gms | German Medical Science

Fragestellung: Die Möglichkeit, das osteogene Potential (oP) von Zellkulturen bzw. deren Gehalt an Hydroxylapatit (HA) verlässlich zu bestimmen, ist eine wichtige Voraussetzung für das Bone Tissue Engineering. Im Gegensatz zu bisher standardmäßig verwendeten Methoden (Alizarinrot-Färbung) stellt das Labelling mit 99mTc-HDP eine nicht-destruktive Möglichkeit der Quantifikation in vitro dar. Das hochsensitive Verfahren setzt den radioaktiven Tracer 99mTc-HDP ein, der an HA bindet, was im Folgenden von Aktivimetern oder Gammakameras gemessen werden kann.

Dabei ist die Möglichkeit, während der laufenden Zellkultur das oP der Zellen in real time anhand der HA-Menge zu bestimmen ein äußerst attraktiver Ansatz, da so bereits frühzeitig Trends und Entwicklungen gemessen werden können. Unklar war aber, inwiefern der radioaktive Tracer negative Auswirkungen auf Zellkultur und Differenzierungspotential hat.

Methodik: Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BM-MSCs) (P2) (n=3) wurden in 4 Gruppen und mehreren Duplikaten 21 Tage in 35mm-Petrischalen (10.000 Zellen/cm²) in DMEM LG mit osteogenen Zusätzen differenziert. Gruppen 2 und 4 dienten als nicht-osteogene Kontrollgruppen.

In den Gruppen 1 und 2 wurden an Tag 7, 14 und 21 (d7; d14; d21) je 5 MBq 99mTc-HDP für 30 min direkt auf die Zellkultur gegeben. Bestimmung der gebundenen Aktivität mittels Aktivimeter. Anschließend erhielten die Zellkulturen wieder Medium und wurden weiter kultiviert.

In den Gruppen 3 und 4 wurde die Kultivierung der entsprechenden Duplikate bis Tag 7, 14 bzw. 21 durchgeführt, gefolgt von einmaligem 99mTc-HDP-Labelling mit 5 MBq für 30 min.

Statistischen Analyse durch einfaktorielle ANOVA (Signifikanz p<0,05).

Ergebnisse und Schlussfolgerung: Es konnte zu keinem der drei Zeitpunkte (d7; d14; d21) ein statistisch signifikanter negativer Effekt bezüglich des oP (Hydroxylapatitgehalt) innerhalb der Gruppe 1 (dreimaliges Radioaktivlabeling) gegenüber der Gruppe 3 (einmaliges Radioaktivlabeling) gezeigt werden.

Der absolute Uptake nahm über die Zeit in Gr. 1 (d7: 0,3; d14: 1,1; d21: 3,3 MBq) und Gr. 3 (d7: 0,2; d14: 0,8; d21: 2,4 MBq) zu.

Jedoch zeigten diese beiden Gruppen zu allen Zeitpunkten einen signifikant höheren Uptake des Tracers gegenüber der jeweiligen nicht-osteogenen Kontrollgruppe (p<0,001).

99mTc-HDP-in-vitro-Labelling ist eine sensitive nicht-destruktive Methode zur Bestimmung des oP von MSCs. Die Daten zeigen, dass die mehrfache Exposition gegenüber 99mTc-HDP keinen negativen Einfluss auf das osteogene Differenzierungspotential der MSC-Kultur in vitro hat.

Daher ist die Methode in der Lage, während einer laufenden Zellkultur das oP der Zellen anhand der HA-Menge in real-time zu bestimmen. So können frühzeitig Differenzierungstrends evaluiert werden und es entfällt die Notwendigkeit eines mehrfachen Zellansatzes für die Untersuchung von mehreren Messzeitpunkten. Aufwendige Testungen von Medien, Methoden und Zelllinien können so deutlich kostengünstiger und effizienter gestaltet werden.