gms | German Medical Science

Fragestellung: Die Therapie von Knochendefekten kritischer Größe, z.B. nach Tumorresektion, ist oft auf die Verwendung autologer Knochentransplantate angewiesen, deren begrenzte Verfügbarkeit die Suche nach Alternativen vorantreibt. Eine aussichtsreiche Möglichkeit stellt die Verwendung autologer 3D-Zellverbände (Sphäroide) dar, die in den Defekt implantiert werden können. Zellen der murinen Osteoprogenitorzelllinie MC3T3-E1 (mOpM-Zellen) wurden in 2D und in 3D charakterisiert, um die optimale osteogene Differenzierung als Basis für nachfolgende in vivo-Versuche zu etablieren.

Methodik: Die Inkubation der mOPM-Zellen erfolgte bis zu 28 Tagen mit drei Kombinationen osteogener Supplements. Zum Nachweis der Differenzierung wurden Von-Kossa- (VK), Alizarin-Rot- (AR) und Alkalische Phosphatase-Färbungen (AP) sowie energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX) durchgeführt. Sphäroide aus je 5.000, 10.000 und 20.000 mOpM-Zellen wurden mittels Liquid-Overlay-Technik (LOT) hergestellt und deren Stabilität und Größenentwicklung bestimmt. An Paraffinschnitten der Sphäroide erfolgte die Quantifizierung der Apoptose- und Proliferationsrate durch quantitative Mikroskopie nach Färbung von Caspase-3 und Ki67. Statistisch signifikante Unterschiede (p<0,05) wurden mit ANOVA oder t-Test festgestellt.

Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die LOT war geeignet, mOpM-Sphäroide aller drei Größen herzustellen, wobei die Größe kontinuierlich bis Tag 4 nach Generierung abnahm. Bereits an Tag 1 war die Stabilität der Sphäroide ausreichend, um einen Transfer durch Pipettieren zu ermöglichen. Die Verwendung von 10 mM Dexamethason, 5 mM beta-Glycerophosphat und 50 µg/ml Ascorbinsäure erlaubte den Nachweis der osteogenen Differenzierung durch AR, AP und VK, wobei der signifikante Anstieg der AR gegenüber der Kontrolle auch quantifiziert werden konnte. Auch die EDX-Analyse zeigte einen signifikanten Anstieg von Kalzium von 0,1 ± 0,1% auf 16,4 ± 2,4% und von Phosphor von 0,6 ± 0,4% auf 10,1 ± 1,1%. Nach 14 Tagen osteogener Differenzierung in 2D war noch eine definierte Generierung von Sphäroiden möglich. Die Apoptoserate lag zwischen 1 und 2,5% und die Proliferationsrate näherte sich 4 Tage nach Generierung physiologischen Werten an.

Es war möglich, Sphäroide aus mOpM-Zellen reproduzierbar herzustellen, welche bereits an Tag 1 nach Generierung eine für mögliche in vivo-Versuche, wie Einsatz in der Rückenhautkammer [1], [2] oder im Calvaria-Defektmodell [3], ausreichende Stabilität aufwiesen. Die gewählte Kombination an Supplements erlaubte in 2D die quantifizierbare osteogene Differenzierung, wobei die Mineralisierung nachweisbar, aber für eine Vereinzelung der Zellen und standardisierte Sphäroid-Generierung noch nicht zu stark ausgeprägt war. Die über alle Sphäroidgrößen niedrige Apoptoserate eröffnet die Möglichkeit weiterführender Studien. In einem nächsten Schritt soll die osteogene Differenzierung auf Sphäroide übertragen und durch qRT-PCR-Analysen relevanter osteogener Marker quantifiziert werden.