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Fragestellung: Die Bildung neuen Knochens aus mesenchymalen Stammzellen ist ein wesentlicher Schritt in der Knochenheilung und Regeneration. Eine wichtige Rolle in diesem Prozess spielt die Gefäßversorgung. Um diesen Prozess detailliert untersuchen zu können, wird bisher hauptsächlich auf Tiermodelle zurückgegriffen. Die Herstellung von perfundierten, künstlichen Gewebeersatzprodukten aus patienteneigenen Stammzellen könnte hier unterstützen. Bisher sind diese Konstrukte aufgrund fehlender Gefäßversorgung in vitro in Ihrer Größe stark begrenzt.

Wir haben ein 3D-Zellkultursystem zur Osteogenese von mesenchymalen Stammzellen (hBM-MSCs) in größeren Konstrukten (0,75x0,75x0,5cm) mit einer zentralen Perfusion entwickelt. In diesem Kultursystem wurde der Effekt unterschiedlicher Trägermaterialien auf die Entwicklung eines dreidimensionalen mineralisierten Gewebes untersucht.

Methodik: Humane mesenchymale Stammzellen wurden aus Patientenhüftköpfen isoliert und durch FACS-Analyse von Oberflächenmarkern, sowie ihrer Differenzierungseigenschaften charakterisiert. Ein Bioreaktor wurde mittels open source software designed (blender) und mit biokompatiblen Polymeren (PLA) im 3D-Druck hergestellt. Verschiedene Hydrogele (PEGDA 6000, 20000, Fibrin-Thrombin, PEGDA 6000 mit Zusatz von methacryliertem Typ I Kollagen) wurden hinsichtlich ihres Potentials, eine osteogene Differenzierung in der 3D-Hydrogelkultur zu unterstützen, verglichen. Die Auswertung erfolgte histologisch durch Färbungen (Alizarin Rot, von Kossa), durch microCT-Dichtemessungen und durch Vergleich der molekularen Differenzierungsmarker in der qPCR.

Ergebnisse und Schlussfolgerung: PEGDA 6000 mit und ohne Zusatz von methycryliertem Typ I Kollagen erlaubten in unserem 3D-Perfusions-Bioreaktor eine 21-tägige Hydrogelkultur bei offenem zentralen Perfusionskanal. Die humanen hBM-MSCs differenzierten in dieser Zeit zu Osteoblasten. Die Alizarin Rot Färbung zeigte nach 21 Tagen Differenzierungsmedium eine Mineralisierung, die per microCT in 3D validiert wurde. Diese Mineralisierung war im Bereich von 1mm um den Perfusionskanal am stärksten. Interessanterweise zeigte die 3D-Zellkultur in PEGDA 6000 bereits ohne Differenzierungsmedium eine Mineralisierung nahe des Perfusionskanals (Osteoinduktion). Diese Eigenschaft wurdemittel qPCR validiert, die eine deutliche Steigerung der Differenzierungsmarker OCN, RUNX2 und hCol1A1 zeigte. Eine zusätzliche Erhöhung dieser Marker konnte durch die Kultur mit Differenzierungsmedium erreicht werden. Zusatz von metacryliertem Collagen führte zu einem Rückgang der Differenzierungsmarker und Mineralisierung in unserem Modell.

Zusammenfassend wurde ein 3D-Zellkultur Modell etabliert, das die Züchtung größerer knochenähnlich mineralisierter, perfundierter Konstrukte aus humanen mesenchymalen Stammzellen ermöglicht. Dieses Modell wird es uns in Zukunft erlauben, Effekte von Versorgung auf humane Knochenbildung und -regeneration besser untersuchen zu können.