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Pathogenetische Bedeutung und therapeutische Beeinflussung des Hexosamin-Pathways nach Knorpeltrauma
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Published: | October 22, 2019 |
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Fragestellung: Der Hexosamin-Pathway (HP) hat für den Knorpelstoffwechsel eine wichtige Bedeutung. Zum einen werden über ihn die Vorstufen der Proteoglykane und die Hyaluronsäure gebildet, wobei die Glutamin-Fruktose-6-Phosphat-Amidotransferase (GFPT1) das Geschwindigkeits-bestimmende Enzym darstellt. Zum anderen beeinflusst er auch die Glykosylierung von Proteinen, welche eine wichtige Rolle bei der Regeneration und posttraumatischen Schädigung des Knorpels einnehmen. Ziel dieses Projektes war die Untersuchung der pathogenetischen Bedeutung und pharmakologischen Beeinflussung des HP in einem humanen ex vivo Knorpeltrauma-Modell.
Methodik: Es wurde humanes Knorpelgewebe (n=11) verwendet, welches als Restgewebe von Knie-TEP-Operationen anfällt. Aus makroskopisch intaktem Gewebe wurden Stanzen präpariert, die anschließend mit dem „Drop-Tower“ mit 0,59J traumatisiert wurden. Das Gewebe wurde mit N-Acetylglucosamin (GlcNAc ) (0,1 mM, 1 mM, 2,5 mM, 5 mM, 10 mM), Glucosamin-3-Sulfat (GS) (0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2,5 mM, 5 mM, 10 mM), PUGNAc (inhibiert den Abbau O-glykosidischer Bindungen; 0,05 mM, 0,1 mM, 0,15 mM) oder dem GFPT1-Inhibitor Azaserin (0,005 mM, 0,025 mM, 0,1 mM) behandelt. Nicht-traumatisierte Stanzen dienten als Kontrollen (K).
Nach 7 d wurde die Zellvitalität anhand eines Live/Dead-Assay erfasst. Zur Beurteilung der Genexpression anaboler (COL2A1, ACAN) und kataboler (MMP1, MMP3, MMP13, ADAMTS4, ADAMTS5) Zielgene, sowie der GFPT1, wurde eine qRT-PCR durchgeführt. Die statistische Auswertung erfolgte mittels One-Way ANOVA.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Zellvitalität war nach Trauma (T) signifikant reduziert ([vs K] -19%, p≤ 0,001). Eine Behandlung mit GlcNAc (10 mM) hatte einen protektiven Effekt ([vs T], +12%, p≤ 0,05). Im Gegensatz hierzu führten höhere Konzentrationen GS zu einer Reduktion der Zellvitalität ([vs T] 5 mM: -23%, p≤ 0,01; 10 mM: -36%, p≤ 0,0001). Während nach Behandlung mit PUGNAc Hinweise auf eine tendenziell erhöhte Zellvitalität ([vs T] 0,1 mM: +9%; 0,15 mM: +8%) gefunden wurden, hatte Azaserin kaum einen Einfluss auf den prozentualen Anteil lebender Zellen.
In der qRT-PCR war eine signifikante Suppression der anabolen Genexpression nach T zu beobachten ([vs K] COL2A1: -1,9-fach, p≤ 0,001). Gleichzeitig wurde die katabole Genexpression induziert. Die Zugabe von PUGNAc (0,1 mM) reduzierte die Trauma-induzierte katabole Genexpression ([vs T] MMP1: -4,1-fach; MMP3: -3,7-fach; MMP13: -12,7-fach und ADAMTS4: -24,1-fach).
Die Genexpression der GFPT1 blieb durch die unterschiedlichen Behandlungen weitgehend konstant. Jedoch gab es nach Inhibition des Enzyms Hinweise auf eine Suppression der COL2A1-Genexpression ([vs T] 0,025 mM: -2,2-fach, 0,1 mM: -2,4-fach).
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktivierung des HP durch GlcNAc bzw. das Aufrechterhalten O-glykosidischer Verbindungen durch PUGNAc einen protektiven Effekt nach Knorpeltrauma hat.
Basierend auf diesen Erkenntnissen könnten neue Ansätze zur Therapie nach Knorpeltrauma abgeleitet werden.