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Fragestellung: Die Regeneration von Knorpel nach Trauma ist ein langer und oft erfolgloser Prozess. Aufgrund der Tatsache, dass Knorpel nicht über Blutgefäße mit Nährstoffen versorgt wird, sondern durch Diffusion von Synovialflüssigkeit, ist die Regeneration über einwandernde Stammzellen marginal. Eine gute Möglichkeit, Knorpelgewebe effektiv zu regenerieren, ist die lokale Implantation körpereigener Stammzellen. In diesem Kontext stellt das Fettgewebe eine ergiebige Quelle für mesenchymale Stammzellen, den Adipogen derived stromal cells (ASCs) dar. Diese können in vitro unter Zugabe von TGF β unproblematisch chondrogen differenziert werden. Die second messengers cAMP und cGMP vermitteln wichtige Signale, die zu Proliferation und Differenzierung von Stammzellen führen. Es besteht eine komplexe Interaktion dieser Stoffe mit den TGF β-vermittelten Signalkaskaden. Welche Rolle cAMP- und cGMP-vermittelte Signalkaskaden in der Chondrogenese humaner ASCs spielen ist noch weitgehend ungeklärt.

Methodik: ASCs wurden aus humanem Fettgewebe isoliert. ASCs wurden als Monolayer sowie in 3D-Alginat-Kugeln unter Zugabe von TGF β (10ng/ml) ± Insulin (0,013mg/ml) im Medium chondrogen differenziert. Um die Rolle der second messenger zu klären, wurden cAMP und cGMP Analoga verwendet, sowie diverse Inhibitoren und Aktivatoren der Adenylatzyklase (AC) und Guanylatzyklase (GC). Des Weiteren wurden Inhibitoren der Insulin, MAPK und Akt Signalwege verwendet, um den cross talk der second messenger aufzudecken. Die Differenzierung zu Chondrozyten wurde mit Alcianblau nachgewiesen. Zudem wurden Cryoschnitte der 3D-Kulturen angefertigt und Aggrecan durch Western Blots nachgewiesen. Die Rücklösung des Alcianblaus führt zu quantitativen Ergebnissen über den Differenzierungszustand der Zellen.

Ergebnisse und Schlussfolgerung: Der Zusatz von cAMP bzw. Stimulation der AC durch Forskolin (For) führte in TGFβ/Insulin-aktivierten ASC-Kulturen zu einer signifikant reduzierten (-43%) chondrogenen Differenzierung. Wohingegen die Inhibition der AC durch 2,3-Dideoxyadenosin (DDA) zu einer signifikanten Steigerung der TGF/Insulin-induzierten Chondrogenese (+15%) führte. Eine Steigerung des cGMP-vermittelten Signalkaskade durch Zusatz von cGMP erhöhte die TGF β /Insulin-induzierte Chondrogenese signifikant (+16%). Inhibition von NO-Synthasen durch L-NIO, welche über ihre NO-Synthese die sGC aktivieren können, führte dagegen zur Reduktion der Chondrogenese, wohingegen Zugabe von NO die Chondrogenese stark (>120%) erhöhte. Auch die direkte Inhibition der sGC durch 1H-(1,2,4)oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-on (ODQ) hemmt die Chondrogenese deutlich. Weiterhin fanden wir, dass eine Induktion der Chondrogenese durch TGF in Abwesenheit von Insulin (PI3-Kinase-Aktivator) zu einer ca. 20% niedrigeren Chondrogenese führte.

Die pharmakologische Inhibition der AC-gesteuerten Signalkaskade sowie Erhöhung der sGC-abhängigen Signalwege stellt einen vielversprechenden Ansatz zu Steigerung der Chondrogenese in vitro und gegebenenfalls auch in vivo.