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Fragestellung: Tissue Engineering (TE) als Therapie großer Knochendefekte wird limitiert durch die initial fehlende Vaskularisierung und die damit verbundene inadäquate Nährstoff- und Sauerstoffversorgung der Zellen im Inneren großer TE-Konstrukte. Im Rahmen unserer Studien konzentrieren wir uns auf die Entwicklung biomimetischer Scaffolds aus mineralisiertem Kollagen mit einem zentralen Wachstumsfaktor (WF)- angereicherten Hydrogel-Depot. Hypoxie-konditioniertes Medium (HCM) humaner mesenchymaler Knochenmarks-Stromazellen (hBMSC) dient dabei als allogenes WF-Gemisch mit angiogener und chemotaktischer Wirkung (Gabrielyan,2014). Nach Implantation kommt es zur verzögerten WF-Freisetzung aus dem Depot und zur Ausbildung eines WF-Gradienten, wodurch Stammzellen und Endothelzellen angeregt werden sollen schneller in den Scaffold zu migrieren (in situ Tissue Engineering).

Methodik: Die porösen Scaffolds wurden durch Gefriertrocknung einer Suspension aus mineralisiertem Kollagen hergestellt und chemisch quervernetzt (Gelinsky,2008). Zur Herstellung von HCM wurden hBMSC isoliert, in Alpha-MEM (10 vol-% FCS, 10 mM L-Glutamin und 500 U/mL Penicillin/Streptomycin) bis zu 90%iger Konfluenz kultiviert (Normoxie), das Medium ersetzt und die Zellen für 72 h in Hypoxie kultiviert (1 % O2).1 Aufkonzentriertes HCM (100x) wurde als Gemisch mit 1% Alginat, 1% Alginat mit Heparin (1mg/mL) oder 1% Hyaluronsäure in das Scaffoldzentrum injiziert und die Freisetzung angiogener WF am Beispiel von VEGF (vascular endothelial growth factor) mittels ELISA quantifiziert. Die Charakterisierung des angiogenen Potentials von HCM erfolgte sowohl 2D (auf Polysterol) wie auch 3D (im Scaffold) über ein in vitro Angiogenese Assay (Cokultur aus Endothelzellen (HUVEC) und hBMSC). Das prävaskuläre Netzwerk wurde fluoreszenzmikroskopisch visualisiert (CD31) und dessen Ausprägung quantifiziert.

Ergebnisse und Schlussfolgerung: Es konnte gezeigt werden, dass hBMSC unter Hypoxie verschiedene angiogene WF wie VEGF, Angiogenin, Pentraxin-3, Thrombospondin und FGF-7 bilden und VEGF-Konzentrationen bis zu 35 ng/mL erzielt werden können. HCM (1x) zeigte im Angiogenese Assay eine starke angiogene Potenz hinsichtlich Stimulation und Ausbildung prävaskulärer Netzwerke. Die Integration von HCM in verschiedene Hydrogel-Depots führte zur Ausbildung prävaskulärer Strukturen auf der Scaffoldoberfläche, die durch das interkonnektive Porensystem in den Scaffold einwuchsen, wobei Hydrogel-Depots aus 1% Alginat das dichteste Netzwerk mit Einsprosstiefen von ca. 1600 µm nach 10 d Inkubation hervorbrachten.

Diese Studie zeigt, dass HCM eine potentielle Alternative zu rekombinanten WF darstellen, um Angiogenese und Migration von Zellen mit regenerativem Potential zu stimulieren. Die Integration von HCM in mineralisierte Kollagen Scaffolds als zentrales Depot ist demnach eine geeignete Strategie, um die Vaskularisierung von TE-Konstrukten und die Knochendefektheilung zu beschleunigen.

Gefördert von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) (SFB/Transregio 79, TP M4).