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Interaktion zwischen artikulärem OA-Knorpel und humanen Chondrozyten / mesenchymalen Stammzellen in vitro
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Veröffentlicht: | 13. Oktober 2014 |
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Fragestellung: Adulte mesenchymale Stammzellen (MSC) besitzen aufgrund ihres chondrogenen Differenzierungspotentials, der einfachen Isolierung und Kultivierung das Potential im Bereich der regenerativen muskuloskelettalen Medizin zur Behandlung von fokalen Knorpeldefekten eingesetzt werden zu können. Über die Kapazität von MSC zur Bildung eines Knorpelersatzgewebes unter osteoarthrotischen (OA) Bedingungen ist bisher nur wenig bekannt. Um die Eigenschaften von Knorpelersatzgewebe aus MSC zu kontrollieren und ggf. zu verbessern, sind ein besseres Verständnis der Signale aus der OA-Mikroumgebung und des modulierenden Einflusses von Gewebegrenzen des benachbarten Knorpels wichtig. Deshalb soll die Interaktion zwischen der OA-Knorpeloberfläche und differenzierten Chondrozyten bzw. chondrogen differenzierenden MSC untersucht werden. Mittels eines in vitro Kokulturmodells, bei dem Chondrozyten bzw. MSC auf der Oberfläche von OA-Knorpelexplantaten kultiviert werden, soll einerseits der Einfluss des Explantats auf die kokultivierten Zellen und umgekehrt der Effekt der Zellen auf den OA-Knorpel analysiert werden.
Methodik: Chondrozyten, MSC und ein Gemisch (1:1) wurde in Fibringele eingebettet und auf Knorpelexplantaten für 7 und 28 Tage in chondrogenem Medium kokultivert, sowie in Monokultur (ohne Knorpelexplantat) unter gleichen Bedingungen. Mittels TaqMan-PCR wurde die Expression von miR-124a und miR-675 analysiert, die mit der Expression von Sox9 bzw. Kollagen II assoziiert werden. Die Expressionslevels wurden anhand der U6 snRNA-Expression normalisiert. Aus den Knorpelexplantaten wurde nach einem modifizierten Protokoll [1] mittels einer Kombination aus physikalischen (Pulverisierung mit Dismembrator), enzymatischen (Deglykosylierung mittels Chondroitinase ABC) und chemischen Methoden (Extraktion mit 1M NaCl bzw. 4M GdnHCl) Proteine extrahiert und mit SDS-PAGE aufgetrennt. Unterschiede im Proteinexpressionsmuster zwischen Knorpelexplantaten, die zellfrei bzw. mit MSC oder Chondrozyten kokultiviert wurden, wurden nach Anfärben der Proteinbanden mit Coomassie Blau detektiert.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Kokultur mit OA-Knorpel führt zu einer erhöhten Expression von miR-124a und miR-675 in Chondrozyten und chondrogen differenzierenden MSC. Es wurden unterschiedlich stark exprimierte Proteinbanden zwischen Knorpelexplantaten, die zellfrei oder mit MSC oder Chondrozyten kokultiviert wurden, detektiert, die mittels MALDI-TOF identifiziert werden.
Kokultur von Chondrozyten bzw. MSC und OA-Knorpel induziert im Vergleich zu den Monokulturen zum einen die Expression von miRNAs in den kokultivierten Zellen, die mit essentiellen Genen für die Chondrogenese assoziiert sind (SOX9, COL2A1), und moduliert zum anderen die Proteinexpression des OA-Knorpels.
Literatur
- 1.
- Wilson R, Norris EL, Brachvogel B, Angelucci C, Zivkovic S, Gordon L, Bernardo BC, Stermann J, Sekiguchi K, Gorman JJ, Bateman JF. Changes in the chondrocyte and extracellular matrix proteome during post-natal mouse cartilage development. Mol Cell Proteomics. 2012 Jan;11(1):M111.014159. DOI: 10.1074/mcp.M111.014159