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Untersuchungen zur Identifizierung von Serumfaktoren, die nach einem schweren Trauma eine intrinsische Apoptoseresistenz in neutrophilen Granulozyten auslösen
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Veröffentlicht: | 13. Oktober 2014 |
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Fragestellung: Neutrophile Granulozyten (PMN) zeichnen sich durch eine kurze Lebensdauer von wenigen Stunden in der Zirkulation aus bevor sie spontan in Apoptose gehen. Proinflammatorische Faktoren, die nach einem schweren Trauma sezerniert werden, führen zu einer deutlichen Verlängerung der PMN-Lebensdauer. Die Störung des PMN-Apoptoseprozesses kann im Weiteren die Entwicklung einer systemmischen Inflammation sowie Schädigung vom Eigengewebe begünstigen. PMN von polytraumatisierten Patienten weisen eine Hemmung der intrinsischen Apoptose auf und eine damit verbundene Resistenz gegenüber dem Kinase-Inhibitor Staurosporin (STS). Diese Resistenz ist auf bislang noch unbekannte Faktoren zurück zu führen, die im Serum der Patienten zirkulieren. Ziel dieser Arbeit war die Serumfaktoren zu identifizieren, die eine intrinsische Apoptoseresistenz in PMN induzieren.
Methodik: Für die Analysen wurde ein repräsentativer Pool aus dem Serum polytraumatisierter Patienten (n=16; ISS>16, Tag 1 nach Trauma) verwendet. Complementfaktoren wurde durch Erhitzen des Serums inaktiviert. Ferner wurden Serumproteine mittels Dialyseverfahren aufgetrennt. Die Depletion von Serumalbumin erfolgte mittels Ionenaustauschchromatographie. Die gewonnen Faktoren wurden chromatographisch in mehreren Fraktionen aufgetrennt. Die Detektion von Zytokinen in den Serumfraktionen wurde unter Anwendung eines Zytokin-Arrays bestimmt. Serum-Immunglobuline (Ig) wurden mittels Protein A/G Beads aus dem Serum immunpräzipitiert. Die Bestimmung der immunpräzipitierten Faktoren erfolgte mittels Massenspektrometrie. PMN gesunder Probanden wurden in Anwesenheit der einzelnen Serumfraktionen mit STS behandelt und nach 18 h der prozentuale Anteil apoptotischer Zellen mittels FACS-Analyse bestimmt.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die intrinsische Apoptoseresistenz in PMN nach schwerem Trauma wird durch Serumfaktoren mediiert, die unabhängig vom Complementsystem sind. Ferner scheint der Ausschluss kleinmolekularer Proteine sowie von Serumalbuminen keinen Einfluss auf die Serum-vermittelte Apoptoseresistenz in PMN nach Behandlung mit STS zu haben. Die chromatographische Auftrennung des Albumin-depletierten Serums ergab u.a. eine Fraktion, die stark erhöhte Leveln an inflammatorischen Faktoren wie IL-18 Bindeprotein (IL-18 BPa), Retinol-Bindeprotein 4 (RBP4) und Plättchen-Faktor (PF4) enthielt. Die Behandlung von PMN mit dieser Serumfraktion und STS resultierte in einer vergleichbaren Apoptoseresistenz wie in Zellen, die in Anwesenheit von unbehandeltem Patientenserum kultiviert wurden. Die Ig-Depletion aus dem Serum führte zu einem vollständigen Verlust der Apoptoseresistenz nach STS-Zugabe. Die immunpräzipitierten Faktoren wurden mittels Massenspektrometrie näher charakterisiert.
Die intrinsische Apoptoseresistenz, die in PMN nach einem schweren Trauma gefunden wurde, wird durch Albumin- und Complement-unabhängige inflammatorische Faktoren vermittelt. Ferner scheinen Ig oder damit assoziierte Faktoren an der Apoptoseresistenz beteiligt zu sein.