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Der Einfluss verschiedener Kulturmedien auf die Differenzierung, Proliferation sowie den Zellphänotyp von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC)
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Veröffentlicht: | 23. Oktober 2013 |
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Fragestellung: Die Kulturbedingungen von MSCs haben im Rahmen des tissue engineering einen zentralen Einfluss auf das Differenzierungsergebnis. Verschiedene Studien haben die Wahl des Kulturmediums bei der Beeinflussung des Differenzierungsergebnisses bereits herausheben können. Zusätzlich mehren sich Studien, die MSCs als eine heterogene Population beschreiben und von unterschiedlichen Differenzierungseigenschaften in Abhängigkeit von den auf MSCs exprimierten Oberflächenmarkern berichten. Vor diesem Hintergrund sollte diese Studie den Einfluss der Kulturkonditionen in der Expansion auf Differenzierung und Immunphänotyp untersuchen.
Methodik: Humane MSCs wurden im Rahmen von Hüft-TEP-Implantationen aus Knochenmark gewonnen und
isoliert. Die Expansion erfolgte unter verschiedenen Kulturkonditionen (s.u.). Anschließend erfolgte die osteogene (Monolayer) und chondrogene (3D-high-density Pellet) Differenzierung für 21 bzw. 42 Tage. Die Auswertung erfolgte bei allen Versuchen durch quantitative Bestimmung des Glycosaminoglycan (GAG)-Gehaltes und Safranin-O-Färbung (chondrogen) sowie quantitative ALP-Bestimmung und Alizarinrot-Färbung. Zusätzlich wurde eine FACS-Messung für gängige MSC-Marker durchgeführt. Die Studie hatte drei experimentelle Ansätze:
I. Zunächst erfolgte der Vergleich von vier gängigen Expansionsmedien (DMEM-LG, DMEM-F12, Alpha-MEM, alle supplementiert mit 10% FCS und 1% P/S, sowie Verfaillie-Medium bis Passage 4.
II. Zudem wurde der Einfluss des FCS-Gehalts im Expansionsmedium bestimmt. Hierzu erfolgte die Expansion der MSCs in DMEM-LG + 10% FCS sowie in DMEM + 20% FCS (jeweils supplementiert mit 1% P/S) bis Passage 3.
III. Schließlich erfolgte der Vergleich des Mediums mit der höchsten chondrogenen Potenz aus I. und II. (DMEM + 20% FCS) mit Embryonalem Stammzell-Medium (ES-Medium) durch eine vergleichende Expansion der MSCs in beiden Medien bis Passage 3.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: I. Der Vergleich der vier Expansionsmedien zeigte in der chondrogenen Differenzierung einen signifikant höheren GAG Gehalt bei MSCs, die in DMEM-LG expandiert wurden. Dies konnte in der histologischen Aufarbeitung bestätigt werden.
II. Im Vergleich der FCS-Fraktion konnte ein Trend zu Gunsten der höheren FCS Konzentration aufgezeigt werden. Die Analyse der auf den MSCs exprimierten Oberflächenmarker nach Passage 3 zeigte eine erhöhte Expression von CD 146 bei in DMEM-LG mit 20% FCS expandierten MSCs.
III. Dieser Versuch zeigte für die GAG-Synthese zwar einen Trend zu Gunsten des ES-Mediums, allerdings keinen signifikanten Unterschied. Auch in diesem Versuch konnte bei der Expansion der MSCs in DMEM-LG + 20% FCS eine erhöhte Expression von CD 146 aufgezeigt werden.
Unsere Studie zeigt, dass die Wahl des Kulturmediums einen zentralen Einfluss auf das therapeutische Potenzial von humanen mesenchymalen Stammzellen haben kann. Weiterhin kann mit dem Kulturmedium offensichtlich eine Präselektion von MSC-Subpopulationen eintreten, die für ein zielgerichtetes tissue engineering einsetzbar sein könnte.