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Regenerationspotential von Cell-Saver-Komponenten zur Geweberegeneration
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Veröffentlicht: | 23. Oktober 2013 |
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Fragestellung: Mesenchymale Stammzellen (MSC) gewinnen in der klinischen Anwendung im Bereich der regenerativen Therapien von Knorpel- und Knochendefekten eine immer größere Bedeutung. Die etablierten Methoden, bei denen MSC aus Knochenmarkaspirat oder Spongiosa gewonnen werden, sind zum Teil aufwendig und nur bedingt für eine klinische Anwendung geeignet. Daher wird eine neue und einfache Methode zur Gewinnung von MSC benötigt. Es wurde untersucht, ob es möglich ist, aus dem Cell-Saver Material MSC zu isolieren (intraoperative, autologe Bluttransfusion) und diese Progenitorzellen in Osteo-, Chondro-, und Adipoblasten zu differenzieren.
Methodik: Die untersuchten Proben wurden von 25 Patienten generiert, die einen elektiven Hüftgelenksersatz erhielten. Aus dem Saugerschlauch, der ein grobes Filtersystem enthält, wurde koaguliertes Blut entnommen. Eine Probe direkt aus dem Cell-Saver-System wurde aus dem Reservoir, dem Filterbereich, gewonnen. Als Kontrolle diente Aspirat aus dem Osteotomiespalt und Spongiosa aus dem Hüftkopf. Das Koagulat aus dem Filtersystem wurde mittels Streptokinase gelöst. Mittels Ficoll-Gradient erfolgte die Isolation der mononukleären Zellen(MNC) mit anschließender in vitro Kultivierung. Die Quantifizierung der MSC erfolgte mittels CFU-Assay. Darüber hinaus wurden die MSC durchflusszytometrisch mit den Markern CD34/45/73/90/105 und CD271 identifiziert. Im Anschluss erfolgte eine in vitro Stimulation zu Osteo-, Chondro-, und Adipoblasten. Zum qualitativen Nachweis der Differenzierung wurden verschiedene zytochemische Färbungen verwendet (Oil red O, Alizarin Rot, Alcian Blau). Die Quantifizierung des Differenzierungspotentials erfolgte mittels real-time PCR: BMP2, BGLAP, RUNX2 und ALPL für die osteogene Differenzierung sowie SOX2, Col10a1, COL2a1, MMP13 für die chondrogene Differenzierung. Zur Detektion der osteogenen Differenzierung wurde außerdem ein ELISA zur Bestimmung der ALPL Konzertration im Zellkulturmedium durchgeführt.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Aus allen Proben wurden MSC gewonnen. Durchschnittlich wurden aus dem Saugerschlauch 510 x106 MNC, aus dem Reservoir 351x106, aus der Spongiosa 43 x106 und aus dem Aspirat 32 x106 MNC isoliert. Im Saugerschlauch waren 34 x106 , im Reservoir 15 x106, in der Spongiosa 9 x106 und im Aspirat 7 x106 MNC pro ml Probe enthalten. Die Gesamtanzahl an MSC im Saugerschlauch betrug im Mittel 20000, im Reservoir 9000, in der Spongiosa 500 und im Aspirat 100 Zellen. Durchflusszytometrisch waren die Marker in allen Probenmaterialien gleich stark exprimiert. Auch bei der Differenzierung zeigte sich, dass die Probenmaterialien in gleichem Maße in Chondro-, Osteo und Adipozyten zu differenzieren waren. Nach den vorliegenden Daten ermöglicht Cell-Saver-Material eine quantiativ bedeutsame Gewinnung von MSC.