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Fragestellung: Humane mesenchymale Stammzellen (hMSZ) könnten Kandidatengene zur Verbesserung der Knorpelreparatur überexprimieren. Wir untersuchten die Hypothese, daß eine rAAV-vermittelte Überexpression des humanen Wachstumsfaktors TGF-ß die Chondrogenese von hMSZ stimuliert.

Methodik: Alle Transgene standen unter Kontrolle des CMV-IE Promotor/Enhancers: Beta-Galaktosidase ( β -gal) von E. coli (rAAV-lacZ) und humanes TGF-ß (rAAV-hTGF-ß). MSZ wurden aus dem Knochenmark von Patienten isoliert. Transduzierte Zellen (Passage 2) wurden für 21 Tage in Monolayer (20 μ l rAAV/2 x 10e4 Zellen) oder in Aggregatkultur (50 μ l rAAV/2 x 10e5 Zellen) in definiertem Medium kultiviert. Transgenexpression wurde mittels ELISA und Immunfärbungen (TGF-ß) bestimmt. Paraffinschnitte wurden mit Toluidinblau oder Alizarin Red gefärbt. Typ-II- und Typ-X-Kollagen wurden mittels Immunfärbungen nachgewiesen. Der Proteoglykan-Gehalt wurde durch DMMB ermittelt, der DNS-Gehalt mit Hilfe des Hoechst 33258 Assays. Der Typ-II-Kollagen-Gehalt wurde per ELISA ermittelt. Die SOX9-, Typ-II-Kollagen-, und Typ-X-Kollagen-Expression wurde durch eine Real-time PCR-Analyse bestimmt (SYBR Green, reverse transkribierte Gesamt-RNS, mittels GAPDH normalisiert). Die Daten wurden mit der 2e- Δ Δ Ct Methode ermittelt. Morphometrische Messungen wurden an 3 standardisierten Stellen der Proben durchgeführt. Daten wurden geblindet von zwei individuellen Personen erhoben. Jede Kondition (n = 3) wurde in zwei unabhängigen Experimenten überprüft. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt.

Ergebnisse und Schlussfolgerung: TGF-ß wurde in rAAV-hTGF-ß-transduzierten Zellen in Monolayerkultur (24,1 pg/ml/24 St.; Kontrolle rAAV-lacZ nicht nachweisbar) sowie in Aggregatkultur (268,3 pg/ml/24 St.; Kontrolle rAAV-lacZ 115,4 pg/ml/24 St.) bis 21 Tage überexprimiert. Der DNS-, Proteoglykan-, und Typ-II-Kollagen-Gehalt war in rAAV-hTGF-ß-transduzierten Zellen im Vergleich zu rAAV-lacZ-transduzierten Zellen höher (bis zu 4-fach höher in Monolayerkulturen, bis zu 6-fach höher in Aggregatkulturen). Die chondrogene Differenzierung in Aggregatkulturen lag in beiden Gruppen nach 21 Tagen vor (Toluidinblaufärbung sowie Typ-II-Kollagen-Immunreaktivität), wobei die Färbeintensität in rAAV-hTGF-ß-transduzierten Zellen stärker war. Typ-X-Kollagen-Immunreaktivität und Alizarin-Red-Färbung waren in diesen Aggregatkulturen im Vergleich zu den rAAV-lacZ-transduzierten Aggregatkulturen stärker. Die Real-time PCR-Analyse zeigte eine erhöhte SOX9-, Typ-II-Kollagen-, und Typ-X-Kollagen-Expression in rAAV-hTGF-ß-transduzierten Aggregatkulturen.

TGF-ß kann in hMSZ durch rAAV sowohl in Monolayer als auch in Aggregatkultur überexprimiert werden. Die Chondrogenese wird dadurch in dreidimensionaler Kultur signifikant stimuliert. Diese Ergebnisse könnten zur Verbesserung bestehender hMSZ-basierter, markraumeröffnender Verfahren verwendet werden.