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Einleitung: In Deutschland gibt es ca. 3,5 Millionen Patienten, die an chronischen Lebererkrankungen leiden, wobei verschiedene Stadien von Fibrose bis hin zur Zirrhose durchlaufen werden. Lassen sich die dabei auftretenden Komplikationen durch konservative Verfahren nicht mehr beherrschen, bleibt nur die Lebertransplantation. Durch Mangel an Spenderorganen wird derzeit intensiv nach Alternativmethoden gesucht. Kürzlich konnten wir zeigen, dass die Injektion von NeoHepatozyten, gewonnen aus mononukleären Zellen (PBMCs), das Überleben von Ratten nach erweiterter Leberteilresektion deutlich erhöht. In Anbetracht eines autologen Therapieansatzes war das Ziel der vorliegenden Arbeit die Herstellung und Charakterisierung von NeoHep Zellen von Patienten mit ausgeprägtem Leberschaden. Dabei fokussierten wir uns auf den TGF-β Signalweg, welcher für das Fortschreiten der Lebererkrankung mit verantwortlich ist.

Material und Methoden: PBMCs wurden mittels Dichtegradienten aus Vollblut von Patienten mit alkoholischen Leberschaden und gesunden Kontrollen isoliert. Durch behandlung mit M-CSF und IL-3 entstandenen programmable cells of monocytic origin (PCMOs) welche durch FGF-4 zu NeoHep Zellen differenziert wurden. Humane Heptozyten dienten als Goldstandard für die Charakterisierung. Die Expression von Hepatozyten Markern wurde mittels PCR, Western Blot und Immunfärbungen nachgewiesen. Desweiteren wurden Glukose und Harnstoff Produktion gemessen. Ein Expressionsprofil aller am TGF-β Signalweg beteiligten Komponenten wurde erstellt. Die Aktivierung des Signalweges wurde durch Western Blot und Reporterassays nachgewiesen. Fettablagerungen wurden mit Öl Rot angefärbt.

Ergebnisse: Die Ausbeute an PBMCs war vergleichbar zwischen Patienten (2,2 ± 0,8*10⁷ Zellen/ml Blut) und Kontrollen (2,5 ± 0,9*10⁷ Zellen/ml Blut). Auch gab es keine signifikanten Unterschiede in der Kultivierung der Zellen. Nach ca. 14 Tagen Behandlung mit FGF-4 zeigten sie eine Morphologie ähnlich primärer Hepatozyten. Zu diesem Zeitraum stieg auch die Expression von Hepatozyten Markern, vor allem Cytokeratin 18, Transferrin und ADH1, an. Allerdings blieb die Expression von Albumin uns Connexin 32 auch nach Differenzierung kaum detektierbar. Die Produktion von Glukose und Harnstoff war vergleichbar mit Hepatozyten. Wir färbten die Fetteinlagerung nach Insulin, TGF-β und Ethanol Behandlung. Während PBMCs kaum Potential zur Fetteinlagerung besitzen, sind PCMOs auch ohne Stimulation stark mit Fett beladen. Nur ausdifferenzierte NeoHep Zellen und Hepatozyten wurden durch Behandlung zur Fettproduktion angeregt. NeoHep Zellen und Hepatozyten haben ein vergleichbares Expressionsprofil des TGF-β Signalweges. Lediglich Smad1 und 3 werden Signifikant weniger (ca. 30 und 60%) exprimiert. Dies konnte mittels Western Blot und Reporter Assays bestätigt werden. So ist es nicht verwunderlich, dass durch TGF-β regulierte Gene, wie z.B. CTGF, Fibronektin und Kollagen weniger ausgeschüttet werden.

Schlussfolgerung: Wir konnten zeigen, dass NeoHep Zellen von Patienten hergestellt werden können, welche eine vergleichbare Qualität zu gesunden Kontrollen haben. Die verminderten Expression von Extrazellulärer Matrix könnte den NeoHep Zellen einen Proliferationsvorteil nach Transplantation verschaffen. Zwar kann es die herkömmliche Organtransplantation wahrscheinlich nicht ablösen, jedoch könnte es Patienten auf der Spenderwarteliste helfen, den Zeitraum bis ein geeignetes Organ verfügbar ist, zu überbrücken.