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Ein neues in Modell zur Quantifizierung der Tumorzellmigration in vivo
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Published: | June 15, 2005 |
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Einleitung
Der Tumorzellmigration und Extravasation wird zunehmend Bedeutung für die Entstehung klinisch manifester Metastasen aus singulären, zirkulierenden Tumorzellen beigemessen. Eine Vielzahl von in vitro Methoden sind daher entwickelt worden, um Zellmotilität und Chemotaxis in 2- und 3-dimensionalen Modellen zu analysieren. Das komplexe Mikromilieu, das auf metastatische Tumorzellen in potentiellen Targetorganen einwirkt, kann in vitro allerdings nur unzureichend abgebildet werden. Wir haben ein Model entwickelt, das es erlaubt durch in vivo Fluoreszenzmikroskopie die frühe Tumorzellextravasation bzw. Tumorzellmigration semi-quantitativ in situ zu analysieren.
Material und Methoden
Es wurden humane Kolonkarzinomzellen mit unterschiedlichem metastatischem Potential und eine Ratten-Kolonkarzinomzellinie verwendet. Als Versuchstiere dienten männliche CD-Ratten (ca. 250g). Nach Anlage eines arteriellen Katheters und Durchführung einer medianen Laparotomie wurde der linke Leberlappen ohne Beeinträchtigung der Perfusion unter einem in vivo Fluoreszenzmikroskop ausgelagert. 106 fluoreszenzmarkierte Tumorzellen wurden intraarteriell injiziert. Anzahl und Lokalisation stationärer Tumorzellen in der hepatischen Mikrozirkulation wurden beurteilt. Über einen Zeitraum von 30 min. wurden in 5 min. Intervallen 30 Gesichtsfelder über die Leberoberfläche standardisiert ausgewertet. Bei einigen Tieren wurden nach in situ Fixierung der Leber am Untersuchungsende die humanan Karzinomzellen durch Immunfluoreszenz mit einem human-spezifischen Epcam-Antikörper in Parafinschnitten identifiziert.
Ergebnisse
Mit der beschriebenen Methode lassen sich Lebersinusoide und Leberparenchym sowie frei passierende und stationäre Tumorzellen eindeutig differenzieren. In vivo können stationäre Tumorzellen eindeutig entweder intraluminal („adhärente Zellen") oder extra-luminal lokalisiert werden („migrierte Zellen"). Über das Untersuchungsintervall von 30 min. nimmt der Anteil migrierter Tumorzellen („Migrationsrate") zu. Humane und syngene Ratten-Kolonkarzinomzellen zeigten qualitativ gleiches Verhalten. Bei der niedrig metastatischen Zellinie HT-29P wurde nach 30 Minuten eine signifikant niedrigere Migrationsrate als bei hochmetastatischen Subclon HT-29LMM (16% ±12% vs. 23% ±13%; p<0,05) beobachtet. Auch parentale geringer metastatische KM-12C Zellen zeigten am Ende des Beobachtungsintervalls signifikant niedrigere Migrationsraten als der korrespondierende hoch metastatische Subclon KM-12L4 (38% ±7% vs. 45% ±5%; p<0,05). Die frühe Extravasation und extraluminale Lage der Tumorzellen konnte durch Immunofloureszenz-Detektion in Hämatoxilin-Eosin gefärbten Parafinschnitten qualitativ bestätigt werden.
Schlussfolgerung
Mit der beschriebenen Methode lässt sich die Migration von metastatischen Tumorzellen in vivo quantifizieren. Unterschiedliche Zellinien zeigen quantitative Unterschiede bezüglich der Rate migrierter Zellen. Mit diesem Modell wird es möglich sein, die Rolle unterschiedlicher Faktoren des lokalen Mikromilieus für die transendotheliale Migration in vivo zu untersuchen. Immunologische Einflüsse scheinen in dieser frühen Phase der Organkolonisation keine entscheidende Rolle zu spielen. [Abb. 1]