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Genetische Korrektur der Morbus Wilson Punktmutation H1069Q mittels CRISPR/Cas9 Technologie
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Authors
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Viktoria Iwan
- Universitätsklinikum Münster, Medizinische Klinik B (Gastroenterologie, Hepatologie, Endokrinologie, Klinische Infektiologie), Münster, Deutschland
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Andree Zibert
- Universitätsklinikum Münster, Medizinische Klinik B (Gastroenterologie, Hepatologie, Endokrinologie, Klinische Infektiologie), Münster, Deutschland
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Matthias Weiand
- Universitätsklinikum Münster, Medizinische Klinik B (Gastroenterologie, Hepatologie, Endokrinologie, Klinische Infektiologie), Münster, Deutschland
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Oksana Nadzemova
- Universitätsklinikum Münster, Medizinische Klinik B (Gastroenterologie, Hepatologie, Endokrinologie, Klinische Infektiologie), Münster, Deutschland
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Hartmut H.J. Schmidt
- Universitätsklinikum Essen, Klinik für Gastroenterologie, Hepatologie und Transplantationsmedizin, Essen, Münster
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Phil-Robin Tepasse
- Universitätsklinikum Münster, Medizinische Klinik B (Gastroenterologie, Hepatologie, Endokrinologie, Klinische Infektiologie), Münster, Deutschland
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Jonel Trebicka
- Universitätsklinikum Münster, Medizinische Klinik B (Gastroenterologie, Hepatologie, Endokrinologie, Klinische Infektiologie), Münster, Deutschland
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Vanessa Sandfort
- Universitätsklinikum Münster, Medizinische Klinik B (Gastroenterologie, Hepatologie, Endokrinologie, Klinische Infektiologie), Münster, Deutschland
| Published: | May 30, 2025 |
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Hintergrund und Ziele: Morbus Wilson (MW) ist durch eine Anhäufung von toxischem Kupfer (Cu) gekennzeichnet, hauptsächlich in der Leber und im zentralen Nervensystem. Mit bis zu 40% ist die Punktmutation H1069Q die häufigste Mutation des Cu-Transporters ATPase7B in westlichen Populationen. Ziel dieser Studie ist zu untersuchen, ob eine CRISPR/Cas9-vermittelte Genkorrektur von H1069Q in induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) deren Fähigkeit zur Differenzierung in hepatozytenähnliche Zellen (HLCs) beeinträchtigt und eine Cu-Resistenz verleiht.
Methode: In dieser Studie wurden Urin-Epithelzellen von MW-Patienten, die die heterozygote Mutation H1069Q/N1270S tragen, durch transiente Transfektion in iPSCs umprogrammiert. Zur Initiierung der homologiegeleiteten Reparatur wurden iPSCs mit dem Plasmid PX459.H1069Q transfiziert, das die H1069Q-spezifische sgRNA-Sequenz und die Sequenz für das Cas9-Enzym trägt. Als Reparaturvorlagen dienten eine Reihe von einzelsträngigen Oligodesoxynukleotiden (ssODNs), die simultan transfiziert wurden. Einzelne iPSC-Klone wurden durch Sanger-Sequenzierung analysiert. Die korrigierten iPSC-Klone wurden durch standardisierte Protokolle in HLCs differenziert und mittels real-time RT PCR auf hepatozytenspezifische Markergene untersucht. Die Lebensfähigkeit von ATP7B-korrigierten und unkorrigierten HLCs wurde mittels MTT-Assays nach Inkubation in toxischen Cu-Konzentrationen bestimmt.
Ergebnisse: 46% aller analysierten iPSC-Klone wurden nach CRISPR/Cas9-vermittelter Reparatur erfolgreich korrigiert. Die zweite Mutation war nicht betroffen. Die korrigierten iPSC-Klone zeigten nach zweiwöchiger Behandlung eine HLC ähnliche Morphologie. Die korrigierten HLCs zeigten eine Hochregulierung hepatozytenspezifischer Markergene (z.B. Albumin, AFP, HNF4α), was ihren hepatischen Charakter bestätigt, sowie eine verbesserte Resistenz gegenüber hohen Cu-Konzentrationen.
Schlussfolgerung: Diese Studie zeigt, dass die CRISPR/Cas9 Technologie bei iPSCs hoch effizient ist und ihre Fähigkeit zur Differenzierung in HLCs nicht beeinträchtigt. Diese Technologie verfügt über ein bemerkenswertes therapeutisches Potenzial zur Korrektur des ATP7B-Gens, was zu einer verbesserten Cu-Resistenz führt und somit einen Beitrag zu neuen therapeutischen Ansätzen für MW leistet.
