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Einleitung: Die Resistenzentwicklung gegen Chemotherapeutika ist ein wesentlicher Faktor für das limitierte Ansprechen auf die Erstlinienchemotherapie mit Gemcitabin und Cisplatin bei Patienten mit metastasiertem Urothelkarzinom (UC). Die Mechanismen der Resistenzentwicklung sind multifaktoriell und teils nur unzureichend verstanden. Ziel dieser Arbeit ist die Identifizierung von Expressionsmustern und möglichen molekularen therapeutischen Targets in Gemcitabin- und Cisplatin-resistenten Urothelkarzinomzellen in vitro.

Methoden: In dieser Studie wurden insgesamt vier UC-Zelllinien und deren Gemcitabin- und Cisplatin-resistente Sublinien verwendet.

Zur Identifikation unterschiedlich regulierter Proteine in Gemcitabin- und Cisplatin-resistenten Urothelkarzinomzellen erfolgte eine vergleichende globale Proteomanalyse mittels gelabelter SILAC (‚stable isotope labeling with amino acids in cell culture‘) Massenspektrometrie von Chemo-naiven RT112 Zellen und deren Gemcitabin- bzw. Cisplatin-resistenten Sublinien in vitro.

Die Validierung der identifizierten Marker erfolgte mittels Real-Time (RT-)qPCR und Western Blotting (WB).

Proliferations- und Softagar-Assays erfolgten unter Verwendung des Ribonukleotidreduktase-Inhibitors Hydroxyurea und nach RRM1-knockdown mittels shRNA.

Ergebnisse: Im Proteom-Screening mittels SILAC Massenspektrometrie zeigte sich eine signifikante Hochregulation der Ribonukleotidreduktase RRM1 und RHOG in der Gemcitabin-resistenten Sublinie von RT112 im Vergleich zu Chemotherapie-naiven RT112 Zellen. In der Cisplatin-resistenten Sublinie war u.a. Kallikrein-6 (KLK6) signifikant hochreguliert. Mittels RT-qPCR und WB konnte eine signifikante Hochregulation von RRM1 in allen vier getesteten Gemctabine-resistenten Sublinien und RHOG in 3 von 4 Gemcitabin-adaptierten Urothelkarzinomzelllinien bestätigt werden. In den Cisplatin-adaptierten Zelllinien konnte die im Screen detektierte Hochregulation des KLK6 Proteins in 2 von 4 Zelllinien auf Transkript-Ebene bestätigt werden.

Der Einsatz von Hydroxyurea, einem klinisch etablierten Ribonukleotidreduktase-Inhibitor, führte zu einem signifikant besseren Ansprechen auf Gemcitabin in drei von vier Gemcitabin-resistenten Sublinien im Proliferationsassay und auch zu kleineren Tumorkolonien im Softagar-Assay. Der RRM1-spezifische Effekt konnte durch shRNA-Knockdown bestätigt werden.

Schlussfolgerung: In dieser Studie identifizierten wir mittels Proteom-weitem Massenspektrometrie-Screening mehrere hochregulierte Proteine und damit potenziell druggable targets in Gemcitabin- und Cisplatin-resistenten UC-Zellen in vitro.

In einer proof-of-principle Studie führte die Inhibition von RRM1 in Gemcitabin-resistenten UC-Sublinien mittels Hydroxyurea und shRNA-Knockdown zu einem ‚Chemosensitizing‘ in vitro. Hydroxurea oder andere RRM1-Inhibitoren stellen damit potenziell wirksame Komedikationspartner bei Patienten unter Gem/Cis-Chemotherapie dar und könnten in klinischen Studien weiter untersucht werden.