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Evaluierung und Validierung von Referenzgenen aus FFPE Gewebe zur Genexpressionsanalyse im Urothelkarzinom der Harnblase
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Authors
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K. Nitschke
- Universitätsmedizin Mannheim, Klinik für Urologie, Mannheim, Deutschland
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D. Jurgowski
- Universitätsmedizin Mannheim, Klinik für Urologie, Mannheim, Deutschland
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M. Eckstein
- Universitätsklinikum Erlangen, Pathologisches Institut, Erlangen, Deutschland
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R. Wirtz
- Stratifyer Molecular Pathology, Köln, Deutschland
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A. Hartmann
- Universitätsklinikum Erlangen, Pathologisches Institut, Erlangen, Deutschland
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P. Erben
- Universitätsmedizin Mannheim, Klinik für Urologie, Mannheim, Deutschland
| Published: | May 10, 2019 |
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Fragestellung: Referenzgene (housekeeping genes) sind durch eine stabile Expression gekennzeichnet und sind zur Normalisierung von Genexpressionsanalysen mittels qRT-PCR essentiell. Bisher fehlen im Urothelkarzinom der Harnblase (BCa) für archivierte Formalin-fixierte Paraffin-eingebettete (FFPE) Gewebeproben Analysen zu validierten, robusten Referenzgenen. Daher werden hier verschiedene vorbeschriebene Referenzgene analysiert und Empfehlungen bezüglich robuster Referenzgene erarbeitet.
Material und Methoden: Mittels qRT-PCR wurde die Genexpression von den Genen ACTB, B2M, CALM2, GAPDH, GUSB, HPRT1, RPL37A, SDHA und TBP aus 40 FFPE Proben analysiert. Es wurden Proben verschiedener BCa-Stadien (NMIBC und MIBC, n=32) sowie Normalurothel (n=8) verwendet.
Ergebnisse: Für die entsprechenden Gene ergaben sich folgende Expressionsverteilungen: RPL37A (Median Ct-Werte 19,6; Range 17,2-22,3), B2M (Median Ct-Werte 21,0; Range 18,4-24,2), GAPDH (Median Ct-Werte 21,8; Range 18,7-26,4), CALM2 (Median Ct-Werte 25,0; Range 22,9-26,4), SDHA (Median Ct-Werte 25,8; Range 22,2-28,6), GUSB (Median Ct-Werte 27,3; Range 23,8-29,6), ACTB (Median Ct-Werte 28,1; Range 26,3-30,5), HPRT1 (Median Ct-Werte 28,8; Range 24,7-32,8) und TBP (Median Ct-Werte 30,4; Range 27-33,1). Anschließend wurde die Expressionsstabilität mit den Programmen BestKeeper, NormFinder und geNorm ausgewertet (Ausschlusskriterien: RNA-Spezifität, Ct-Werte >30, Expressionsnachweis <90%). GUSB, CALM2 und RPL37A waren die 3 stabilsten Gene unabhängig vom jeweiligen Programm. Weiterhin ergaben sich Gen-abhängige Differenzen zwischen 0,25 und 1,52 in den medianen Ct-Werten bei Normal- und Tumorgewebe.
Schlussfolgerung: Genexpressionsanalysen aus FFPE Proben zeigen hohe Varianzen zwischen verschiedenen Referenzgenen (Median Ct-Werte zwischen 19,6 und 30,4). Als stabilste Referenzgene wurden GUSB, CALM2 und RPL37A identifiziert. Eine Verringerung der Varianz ist durch die Verwendung mehrere Referenzgene (3 oder 5 Referenzgene im Vergleich zu einem Referenzgen) zur Normalisierung möglich.
