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Fragestellung: Die hypertrophe Entwicklung mesenchymaler Stromazellen (MSCs) behindert ihren Einsatz in der Knorpelregeneration. In einem Hydrogel immobilisiertes Heparin steuerte die MSC-Differenzierung in Hypertrophie-resistente Chondrozyten in vivo. Die In-vitro-Chondrogenese war aber beeinträchtigt. Für die klinische Translation ist es jedoch wichtig Knorpelersatzgewebe unter definierten und reproduzierbaren Bedingungen herzustellen. Wir haben hier untersucht, ob freies lösliches Heparin die MSC-in-vitro-Chondrogenese erlaubt und die hypertrophe Entwicklung unterdrückt. Das soll ermöglichen, die Heparin-vermittelte Stabilisierung der MSC-Chondrogenese gezielt und effizient für die Herstellung von Knorpelersatzgewebe und die Arthrose-Therapie auszunutzen.

Methodik: Humane Knochenmark-MSCs wurden während der 3D In-vitro-Chondrogenese (28 Tage) mit löslichem Heparin oder Chondroitinsulfat (CS) als Kontrolle (10, 100, 700 μg/mL) behandelt (n=3–5). Signalwegaktivitäten, Knorpelmatrix- und Hypertrophiemarker wurden mittels Histologie, DMMB-Assay, ELISA, qRT-PCR, Western Blot und ALP-Assay untersucht (gepaarter studentischer t-Test, p≤0.05).

Ergebnisse und Schlussfolgerung: Heparin reduzierte konzentrationsabhängig leicht die SMAD3-, aber nicht SMAD2-Aktivität. Phospho-AKT und -p38 waren hingegen konzentrationsunabhängig erhöht. Im Einklang mit diesen sich potenziell kompensierenden Effekten auf verschiedene prochondrogene Signalwege, hemmte 10 μg/mL Heparin gegenüber CS die Proteoglykan- und Kollagen-II-Ablagerung nicht. 100/700 μg/mL Heparin erniedrigten aber die DNA-Level und störten die Knorpelmatrixintegrität. Für künftige MSC-basierte Ansätze sind daher nur niedrige Heparindosierungen sinnvoll.

10 µg/mL Heparin erhöhte moderat das WNT3A-induzierte pro-hypertrophe β-Catenin, aber verringerte die SMAD1/5/9-Aktivität und die HH-Zielgenexpression (GLI1). Übereinstimmend war die Expression von Hypertrophiemarkern verglichen mit CS leicht aber signifikant (MEF2C, IBSP, ALPL) oder tendenziell (COL10A1, IHH, RUNX3) erniedrigt. Kollagen-X-Proteinmengen wurden nicht reproduzierbar beeinflusst, die ALP-Aktivität aber signifikant gehemmt. Insgesamt wirkte niedrig dosiertes Heparin antihypertroph, die eingesetzte Konzentration reprogrammierte die MSC-Differenzierung aber nicht stabil in die chondrale Linie.

Heparins chondroprotektive Eigenschaften könnten künftig mit anderen antihypertrophen Stimuli (PTHrP-Puls, WNT-Hemmung) kombiniert werden. Warum freies lösliches Heparin die Chondrogenese in vitro nicht reprogrammiert muss weiter untersucht werden. Die medienwechselbedingte Elimination von heparingebundenen (zellproduzierten) Zytokinen oder undefinierte, nur in vivo vorkommende Faktoren könnten hierbei von Bedeutung sein.

Abbildung 1 [Abb. 1]