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Untersuchung zur Optimierung der In-vitro-Differenzierung von Osteoklasten
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Published: | October 23, 2017 |
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Fragestellung: Die Osteoporose ist die häufigste Knochenerkrankung im hohen Alter und zählt laut WHO zu den größten Gesundheitsproblemen in unserer Gesellschaft. Die Osteoporose ist definiert durch eine reduzierte Knochendichte, die mit einem erhöhten Frakturrisiko verbunden ist. Ursache der verminderten Knochendichte ist eine erhöhte Knochenresorption, die durch eine Überaktivität der Osteoklasten bedingt ist. Diese Zelle ist in der Lage Knochengewebe, Dentin, oder kalzifiziertes Collagen zu resorbieren und neben anderen Proteinen die tartratresistente saure Phosphatase zu exprimieren. Um die Rolle der Osteoklasten weiter untersuchen zu können, haben wir in In-vitro-Ansätzen verschiedene in der Literatur vorgegebene Standardmedien, Zellzahlen und resorbierbare Oberflächen hinsichtlich des Differenzierungserfolgs miteinander verglichen
Methodik: Periphere mononukleäre Zellen (PMNC) wurden in zwei verschiedenen Zellzahlen in 96 Wellplatten zu 5 x 105 Zellen und 6 x 105 Zellen ausgesät und mit zwei verschiedenen Differenzierungsmedien behandelt. Zur Differenzierung wurde zum Kultivierungsmedium (DMEM (4,5 g/l Glucose), 2mM α-Glutamin, 10 % fötales Kälberserum (FBS), 100 U/ml Penicillin and 100 µg/ml Streptomycin) 10 µg/ml RANKL und 10 µg/ml M-CSF hinzugefügt oder zusätzlich zu den vorgenannten Inhaltstoffen 5 ng/ml TGF-β und 1µM Dexamethason. Der Erfolg der Differenzierung zu Osteoklasten wurde nach 10, 14 und 19 Tagen mit Hilfe des tartratresistenten alkalischen Phosphatase-(TRAP)-Assays evaluiert. Des Weiteren wurde verglichen, ob Dentin- oder Knochenplättchen sich besser für die Resorptionsmessung (Pit-Assay) der Osteoklasten eignen und welche Differenzierungsdauer auch hier am geeignetsten war.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Wir konnten zeigen, dass für eine erfolgreiche Differenzierung von mononukleären Zellen zu Osteoklasten die kleinere Zellzahl von 5 x 105 Zellen/Well ausreichend war. Eine zusätzliche Gabe von TGF-β und Dexamethason zu dem Differenzierungsmedium konnte den Erfolg der Differenzierung nicht signifikant verbessern, im Gegenteil haben wir einen inhibierenden Einfluss beobachten können. Somit konnten wir festhalten, dass das Standardkultivierungsmedium mit RANKL und M-CSF das beste Differenzierungsergebnis lieferte. Außerdem konnten wir demonstrieren, dass bei der Bestimmung der Osteoklastendifferenzierung die Verwendung der Knochenplättchen gemessen an der Resorptionsaktivität der Osteoklasten den Dentinplättchen überlegen waren. Insgesamt konnte dokumentiert werden, dass eine Differenzierungsdauer von 14 Tagen völlig ausreichend war.
Unsere Ergebnisse stellen wichtige Erkenntnisse zur Zeit-, Kosten-, und Ressourcenersparnissen hinsichtlich der methodischen Differenzierung von Osteoklasten dar, mit deren Hilfe sich pathologische Mechanismen in Osteoklasten aufklären lassen.