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Fragestellung: Der Transkriptionsfaktor E2p45-related factor 2 (Nrf2) ist ein wesentlicher Regulator des zellulären Abwehrprogramms gegen oxidativen Stress. Nrf2 bindet an das „antioxidant response element“ (ARE) und induziert die Expression einer Vielzahl anti-oxidativ wirkender Enzyme. Zudem besteht eine direkte Interaktion von Nrf2 mit Runx-2, einem wichtigen osteogenen Transkriptionsfaktor, welcher die Osteoblastenreifung unterdrücken kann. In vivo konnte eine erhöhte Mineralappositionsrate in Nrf2-Knockout Mäusen gezeigt werden. Im Gegensatz zu den Auswirkungen auf den Knochenmetabolismus ist bisher noch nichts über den Einfluss von Nrf2 auf Zellen des Knorpels bekannt. Ziel dieser Arbeit ist die Evaluierung der Interaktion von Nrf2 mit Sox9, einem Schlüsselfaktor der Differenzierung und Matrixsynthese, in Chondrozyten.

Methodik: Die Promotoranalyse erfolgte an einem humanen SOX-9 Promotorfragment, dessen zwei ARE Seuquenzen durch Restriktion und Mutagenese eliminiert wurden. Die Konstrukte wurden daraufhin in pGL3 Basic umkloniert, um die Promotoraktivität mit einem dualen Luziferase-Reportergenassay in der Chondrozyten-Zelllinie C-28/I2 zu bestimmen (n=4).

Der Nrf2-Knockdown erfolgte in C-28/I2 mittels shRNAs. Die Analysen der Nrf2 und SOX-9 Expression erfolgten mittels qPCR (n=3). Immunhistologische Färbungen gegen Sox-9 im Gelenkknorpel 12-Wochen alter Nrf2-Wildtyp (WT) und Nrf2-Knockout (KO) Mäuse wurde an formalin-fixierten Femurkondylen durchgeführt. Die statistischen Analysen erfolgten mittels Students t-Test bzw. one-way ANOVA. Angegeben ist jeweils der Mittelwert und Standardfehler.

Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Promotoranalyse des humanen SOX-9 Promotors zeigte keine Abnahme der Promotoraktivität durch Eliminierung der distalen ARE Sequenz (ARE-1) (0,98 ± 0,051) im Vergleich zur Kontrolle (1 ± 0,058), während die Mutation der ARE-2 Sequenz zu einer Reduktion der SOX-9 Promotoraktivität um 53% (0,47 ± 0,069, p= 0,0002) führte. Somit konnte gezeigt werden, dass es sich bei der ARE-2 Sequenz um ein aktives, positives Regulatorelement der SOX-9 Expression handelt.

Diese Beobachtung konnte durch den Knockdown von Nrf2 mittels shRNA verifiziert werden. Der Knockdown von Nrf2 verringerte die Expression der SOX-9 mRNA- um 83% (0,17 ± 0,005, p=0,0001) im Vergleich zur „non-target“ Kontrolle (1 ± 0,04).

Diese Beobachtungen korrelieren mit den in vivo Daten aus Nrf2-KO Mäusen: Im Vergleich zu WT-Mäusen (55% ± 7,2%) konnte im Gelenkknorpel von Nrf2-KO-Mäusen mittels immunhistochemischer Analyse signifikant weniger Sox-9 positive Chondrozyten (26% ± 2%, p=0,02) nachgewiesen werden.

Unsere Daten zeigen eine positive Regulation der SOX-9-Expression durch Nrf2 und legen Effekte auf die Chondrozyten-Differenzierung und Matrix-Produktion nahe. Die pharmakologische Induktion von Nrf2 könnte möglicherweise ein neuer Ansatzpunkt zur Regeneration von Knorpelschäden darstellen.