gms | German Medical Science

Fragestellung: Mit dem Hintergrund, eine Möglichkeit für Zell- und Gewebe-Spenden zu finden, haben mittlerweile einige Arbeitsgruppen verschiedene Methoden zur Generierung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus induziert pluripotenten Stammzellen (iPSCs) publiziert. Da es bisher keine vergleichenden Studien gibt, wurden in dieser Studie zwei der gängigsten Methoden bzgl. zeitlichem Aufwand und Funktionalität analysiert.

Methodik: Die verwendeten iPSCs wurden durch Reprogrammierung von humanen Nabelschnurblut-Zellen generiert. Ausgehend von der gleichen Zellpopulation wurden die iPS-Zellen nach verschiedenen Protokollen behandelt, so dass sie zu MSCs differenzierten. Ein Teil der Zellen wurde ausschließlich in Monolayer-Kultur differenziert. Um eine Apoptose der vereinzelten iPSCs zu verhindern, wurde dem Differenzierungsmedium ROCK Inhibitor zugefügt. Der andere Teil wurde zunächst zu Embryoid Bodies (EBs) geformt und ab Tag 14 in Monolayer-Kultur gehalten. Der Differenzierungs-Fortschritt wurde parallel mit Durchflusszytometrie (FCM), morphologischen Beobachtungen und abschließend mit mRNA-Expressionsanalysen (semiquantitative und quantitative real-time RT-PCR) untersucht.

Ergebnisse: Die im Rahmen dieser Versuche differenzierten iPSCs wiesen, unabhängig von der angewandten Methode, nach einigen Passagen MSC-ähnliche Merkmale auf, entsprechend den Kriterien der I.S.C.T. Bei den EB-differenzierten iPS-Zellen war dies nach ca. 20 Tagen der Fall, bei der Monolayer-Differenzierung dauerte es ca. 40 Tage, nachgewiesen sowohl anhand von FCM- als auch PCR-Analysen. So stieg z.B. die Expression der Oberflächenantigene CD73 und CD105, die Expression von CD24 und CD34 ging zum Teil vollständig zurück und die Negativ-Marker CD14 und CD45 konnten weder auf iPSCs noch auf den generierten iPS-MSCs extrazellulär nachgewiesen werden (< 2 %). Sowohl CD90 als auch CD146 wurden vor und nach der Differenzierung extrazellulär nachgewiesen. Des Weiteren konnte in allen iPS-MSC-Kulturen die für MSCs typische spindelförmige Morphologie beobachtet werden.

Schlussfolgerungen: Wir konnten bestätigen, dass die Generierung von iPS-MSCs sowohl über Embryoid Body-Formung als auch in Monolayer-Kultur möglich ist. Dabei ist erstere schneller und einfacher durchzuführen. Zusätzlich ist diese Art der Differenzierung kostengünstiger, da kein teurer ROCK Inhibitor benötigt wird.