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Visualisierung und Quantifizierung der Cathepsin B-, K- und L-Aktivität in vitalen Knorpelzellen
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Published: | November 11, 2003 |
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Fragestellung
Proteolytische Enzyme wie Cathepsin B, K und L sind an zahlreichen pathologischen Prozessen beteiligt. Der Anteil der einzelnen Protease an der destruktiven Aktivität ist aber mit der effektiv vorhandenen Enzymaktivität verbunden. Dafür wurde eine Darstellung der Proteaseaktivität in lebenden Zellen mit Hilfe eines Fluoreszenzassays versucht.
Methodik
Zur Visualisierung der Cathepsinaktivität wird dem serumfreien Medium ein spezifisches Substrat und ggf. ein spezifischer Inhibitor zugesetzt. Das native Enzym spaltet das synthetische Substrat. Dabei entsteht ein fluoreszierender Niederschlag, der im Mikroskop lokalisiert bzw. photometrisch gemessen werden kann. Zur Charakterisierung der Cathepsinaktivität werden spezifische Proteaseinhibitoren verwendet. Die mikroskopische Auswertung erfolgt mittels einer FITC-Filterkombination und Blaulichtanregung. Die Quantifizierung der Ergebnisse wird durch den Einsatz eines Fluor-S-MultiImagers ermöglicht.
Ergebnisse
Der Assay ermöglicht durch den Einsatz spezifischer Proteaseinhibitoren die Visualisierung und Quantifizierung der Cathepsin B-, K- und L-Aktivität in vitalen Knorpelzellen. Derselbe Ansatz dieses Fluoreszenzassays im 96-well Format läßt eine Quantifizierung der Aktivität zu. Die Expression der Cathepsine wurde zusätzlich durch einen cDNA-Array bestätigt.
Schlußfolgerung
Durch diesen Assay gelingt die Darstellung der Cathepsinaktivitäten an lebenden Zellen in Kultur. Durch die Einführung des Mikroplattenformates kann dieses Verfahren auch zur Testung pharmakologisch relevanter Inhibitoren verwendet werden.