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Hintergrund: Mechano-elektrische Transduktions (MET) Kanäle wandeln mechanische Reize in elektro-/chemische Signale um. Ein elastisches Element, die „Gating-Spring", überträgt Kräfte auf das Channel-Gate. Dieser Vorgang vermittelt eine nichtlineare Gating-Compliance in der Mechanik von Haarbündeln und dem Hörorgan von Drosophila (Johnston-Organ; JO), die molekularen Identitäten dieser Elemente sind unklar. In Drosophila ist die nichtlineare Compliance von mindestens zwei verschiedenen Gating-Springs erkennbar, von denen eine selektiv in mutierten Fliegen verloren geht, denen der Kanal NompC fehlt.

NOMPC ist ein bona fide MET-Kanal, der eine Ankyrin-Wiederholungsdomäne (ARD, 29 Ankyrine) an seinem N-Terminus besitzt, die eine federähnliche helikale Struktur annimmt und durch einen Linker mit dem Rest des Kanals verbunden ist.

Methoden: Wir testeten verschiedene NOMPC-Konstrukte in adulten Fliegenmutanten sowie in S2-Zellen.

1.

Wildtyp-NOMPC mit GFP-Tag,

2.

2xARD-NOMPC (ARD-Duplizierung),

3.

i2xLinker-NOMPC (Linker-Duplizierung),

4.

2xLinkerCys-NOMPC (2xL +Cysteinpaare).

In vivo NOMPC-Funktion

Wir verwendeten ein Laser-Doppler-Vibrometer, um Antennenbewegungen zu messen, während wir gleichzeitig compound Aktionspotentiale von JO-Neuron aufzeichneten.

Elektrostatische Stimulation wurde verwendet, um JO Neurone anzuregen. Die nichtlineare compliance der JO-Neurone wurde durch ein angepasstes Gating-Spring-Modell beschrieben.

S2 Zellen Outside-Out Patch-Experimente

Die gleichen NOMPC-Konstrukte wurden in Drosophila S2-Zellen transfiziert. Spontane und mechanisch hervorgerufene Ströme wurden in Outside-out Membranpatches aufgezeichnet. Der Cystein-Crosslinker 1,6-Hexanediyl-Bismethan-ethiosulfonat (MTS6) wurde verwendet um einen der Linker im 2xLinkerCys-NOMPC zu versteifen.

Ergebnisse: Die Duplizierung der ARD hat keinen Einfluss auf die Gating-Compliance in adulten Fliegen oder auf die spontane Aktivität und Sensitivität von NOMPC in S2-Zellen.

Die Duplizierung des Linkers beeinflusst jedoch die NOMPC-Gating-Compliance in adulten Fliegen und verändert die spontane Aktivität sowie die Sensitivität in S2-Zellen. Die mit NOMPC assoziierte Gating-Spring Steifigkeit wurde in adulten Fliegen etwa halbiert, und die Sensitivität in S2-Zellen verschob sich um den Faktor zwei in Richtung größerer Stimuli. Dies steht im Einklang mit der Annahme, dass der Linker wie eine Hookesche Feder funktioniert.

Vernetzung von Cysteinpaare in einem der beiden Linker im 2xLinker-NOMPC-Konstrukt durch MTS6 führte zur Wiederherstellung der Sensitivität.

Schlussfolgerung: Wir zeigen, dass die Duplizierung des NOMPC-ARD keinen Einfluss auf das NOMPC-Gating in vitro, die NOMPC-MET-Funktion in vivo oder die effektive Steifigkeit der Gating-Spring hat. Im Gegensatz dazu halbierte die Duplizierung des Linkers die NOMPC-Druck/Verschiebungsempfindlichkeit in vitro/in vivo sowie die Steifigkeit der Gating-Spring. Wir glauben daher die molekulare Identität der Gating-Spring in NOMPC gefunden zu haben.