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Hintergrund: Die Anzahl der zentralen Hornhautendothelzellen (EC) ist einer der wichtigsten Parameter bei der Bewertung von Spenderhornhäuten in Augenbanken. Allerdings muss etwa ein Drittel der Spenderhornhäute während der Konservierung in Augenbanken verworfen werden – ein Hauptgrund dafür ist eine zu niedrige zentrale EC-Zahl. Diese Arbeit zielt darauf ab, das EC-Reservoir in der endothelialen Peripherie mit Hilfe verschiedener Mikroskopietechniken zu evaluieren. Dies würde eine präzisere Charakterisierung der Qualität von Spenderhornhäuten ermöglichen als der derzeitige Stand der Technik.

Methoden: Spenderhornhäute (n = 46) von 41 Spendern wurden von der hiesigen Hornhautbank (DGFG) bezogen (Ethikkommission Nr. A2020-0108). Die menschlichen Hornhäute wurden mit einem speziellen Heidelberg Retina Tomographen (HRTII/RCM) untersucht. Die verschiedenen Zellpopulationen wurden auch mit Rasterelektronenmikroskopie (FE-SEM; Merlin VP compact, Carl Zeiss) analysiert. Zu diesem Zweck wurden die Hornhäute in 1% Paraformaldehyd und 2% Glutaraldehyd sowie anschließend mit 1% Osmium fixiert, gefolgt von einer Dehydratisierung durch eine aufsteigende Ethanolreihe (30, 50, 70, 90 und zweimal 100%), einer Trocknung mit einem Kritisch-Punkt-Trockner (Emitech850) und einer abschließenden Besputterung mit einer dünnen Goldschicht. Außerdem wurden die Hornhäute mit 2% Paraformaldehyd (1 h, Sigma) fixiert, um die Zellen mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (LSM780, Carl Zeiss) auf ihre Funktion und Eigenschaften mit Hilfe von Markern (wie ABCG2, LRG5, SOX2, ZO1, NaK-ATPase) zu analysieren.

Ergebnisse: Unsere multimodalen Analysen, bei denen verschiedene mikroskopische Techniken der Ex-vivo-Hornhaut zum Einsatz kommen, verdeutlichen den Bedarf an fortschrittlichen und hochauflösenden Bildgebungsverfahren zur Bewertung der Hornhautqualität. Diese Techniken ermöglichen die Visualisierung und Charakterisierung anderer Zellpopulationen, z.B. in der endothelialen Übergangszone. Mit HRTII/RCM konnten Hornhäute ex vivo ohne Fixierung analysiert werden. Mit cLSM und FE-SEM war es möglich, die entsprechenden Schichten und Zellen nach der Fixierung zu charakterisieren. Mit cLSM konnten wir Zellen mit Stammzellmarkern in der TC (multizelluläre Cluster) identifizieren, die eine Nische von EC-Vorläuferzellen darstellen.

Schlussfolgerungen: Unsere Analysen mit den verschiedenen Mikroskopietechniken von Ex-vivo-Hornhäuten unterstreichen die Notwendigkeit, exzellente und hochauflösende Bildgebungsverfahren zur Beurteilung der Hornhautqualität einzusetzen. Die Untersuchung der endothelialen Übergangszone in ex vivo Spenderhornhäuten in der täglichen Augenbankroutine könnte zu einer besseren Charakterisierung von Spenderhornhäuten führen – mit dem Potenzial, die Menge an verworfenem Spendergewebe zu verringern.