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Einleitung: Für rekonstruktive Verfahren hätten neue und innovative Methoden zur in vitro-Differenzierung von Urothel aus patienten-eigenen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) eine hohe Relevanz. Sie bieten das Potential zur Generierung eines differenzierten, Barriere-bildenden Uro-Epithels. Prinzipiell könnten Techniken zur Harnableitung durch patienten-eigenes Urothel optimiert werden. Mit der vorliegenden Arbeit zeigen wir, dass

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eine in vitro-Differenzierung von Urothel-ähnlichen Zellen aus iPSCs möglich ist,

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diese Zellen Organoide zur verbesserten Analyse von Zell-Zell-Interaktionen bilden,

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der Transfer dieser Zellen auf eine de-epithelialisierte Schweineharnblase als Organkultur zu einer Re-epithelialisierung führt und

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die Zellen eine weitere urotheliale Maturierung zeigen.

Material und Methoden: Die gerichtete Differenzierung von Urothelzellen erfolgte aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), welche aus Hautfibroblasten generiert wurden, unter Berücksichtigung bereits publizierter und eigener Protokolle. Die Genexpression von Urothel-spezifischen Markern wurde mittels Western Blot und qRT-PCR untersucht. Zur Evaluierung der Selbstorganisationsfähigkeit differenzierter Zellen sowie der Bildung komplexer dreidimensionaler Strukturen wurden die differenzierten Zellen als Organoide weiterkultiviert. Schweineharnblasen wurden enzymatisch und mechanisch de-epithelialisiert und anschließend als Matrix zur weiteren Maturierung von in vitro differenzierten Urothel-ähnlichen Zellen verwendet. Die Effizienz der Differenzierung wurde histologisch und insbesondere immunhistochemisch (IHC) anhand der Expression urothelialer Marker aufgearbeitet.

Ergebnisse: Nach einer Differenzierung aus iPSCs zeigten Urothel-ähnliche Zellen die Expression von typischen Markern terminal differenzierter Urothelien (UPK1a, UPK3, KRT20) auf transkriptioneller und translationaler Ebene. Die Überführung in dreidimensional wachsende Organoide zeigte, dass die Zellen sich selbst zu komplexen Strukturen organisieren können. Sie exprimierten weiterhin Differenzierungs-assoziierte Uroplakine und Tight junction Proteine (ZO-1, UPK1b), Zytokeratine (CK19) und wichtige urotheliale Transkriptionsfaktoren (FOXA1). Die Überführung urothelial differenzierter Organoide auf eine de-epithelialisierte porzine Harnblase in Organkultur induzierte einen massiven Anstieg terminal differenzierter urothelialer Marker (u.a UPK1b, FOXA1), die mittels IHC nachgewiesen werden konnten.

Schlussfolgerungen: Die Generierung von Urothel-ähnlichen Zellen aus pluripotenten humanen Stammzellen gelingt und kann mittels Markerexpression validiert werden. Eine Kultur in Organoiden zur Untersuchung von komplexeren zellulären Interaktionen und der Bildung von übergeordneten dreidimensionalen Strukturen ermöglicht ein tiefergehendes Verständnis der urothelialen Differenzierung. Der Transfer von in vitro differenzierten Urothel-ähnlichen Zellen auf ein porzines Harnblasenmodell in Organkultur demonstriert die Machbarkeit des Einsatzes patienten-eigener Zellen als Gewebeersatz und bietet Einblicke in Urothelzell-Stroma-Interaktionen und ein potentielles Xenotransplantationsmodell zum Harnblasenersatz in fernerer Zukunft.