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Hintergrund: PAX6 assoziierte Aniridie geht mit einem Verlust von Limbusepithelstammzellen (LESC) im frühen Lebensalter einher. Ein verringertes regeneratives Potenzial der Cornea und eine ausgeprägte Keratopathie sind die Folge. In unseren vorläufigen Studien wurde die Eignung der Kryokonservierung von Limbusstammzellen getestet. In Zukunft soll die Machbarkeit einer autologen Transplantation von kryokonservierten Stammzellen von Aniridie Patienten erforscht werden. Hierzu wurden Techniken der Stammzellisolation verglichen und Auswirkungen der Kryokonservierung und Kulturdauer auf Stammzell- und Differenzierungsmarker untersucht.

Methode: Humane LESCs wurden von Corneo-Skleralringen mittels drei verschiedenen Techniken; Migration, Dispase oder Collagenase Assay isoliert. Zur Kultivierung wurde kommerziell erhältliches Kulturmedium verwendet (KSFM, Gibco). Die Effizienz der Anreicherung wurde in allen Assays über morphologische Parameter der Zellen bestimmt. Die Expression des Stammzellmarkers ABCG2 sowie des Differenzierungsmarkers K3 wurde zu verschiedenen Zeitpunkten untersucht, sowie vor und nach Kryokonservierung. Expressionsstudien erfolgten an Primärzellkulturen die durch Collagenase Assays gewonnen wurden. Die Signifikanz wurde mit einem t-Test überprüft.

Ergebnisse: Das Auswachsen der Zellen folgender Morphologie waren Kriterien für einen erfolgreichen Versuch: Klein kopfsteinpflasterartig und im Verhältnis zum Zytoplasma große Zellkerne. Beim Collagenase Assay war dies in 63,6 % (n=11), beim Dispase Assay in 45,5 % (n=11) und beim Migrations-Assay in 17,9 % (n = 56) der Versuche der Fall. Analysen der Stammzellmarker erfolgen an Zellen die mit dem Collagenase Assay isoliert wurden, da diese Zellen in allen Versuchen bis Passage 7 subkultiviert werden konnten, bei Zellen aus dem Dispase Assay war dies nur für 9,1% der Ansätze der Fall. ABCG2 positive Zellen machten etwa 16,3 ± 8,9 % der Zellen in Passage 1 aus, und 6,0 ± 3,7 % der Zellen in Passage 6. Nach Kryokonservierung zeigt sich eine leichte Abnahme der ABCG2 positiven Zellen.

Schlussfolgerungen: Eine Kryokonservierung von Limbusepithelstammzellen scheint prinzipiell möglich. ABCG2 positive Zellen nehmen mit Kulturdauer und nach Kryokonservierung ab. Folglich besteht bei den Kulturbedingungen immer noch Optimierungsbedarf. Weitere Kryokonservierungsversuche sind ebenfalls notwendig.