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Hintergrund/Ziel: Verschiedene Organellen des Retinalen Pigmentepithels (RPE) wie Lipofuszin (L), Melanolipofuszin (MLF), Melanosomen (Mel), zeigen autofluoreszierende Eigenschaften. Widersprüchliche Daten existieren darüber, ob L auch Autofluoreszenz (AF) bei Nahinfrarot (NIR)-Anregung zeigt, oder NIR-AF nur melaninhaltigen Organellen zuzuordnen ist. In dieser Studie verwenden wir super-resolution Mikroskopie basierend auf strukturierter Beleuchtung und einen multispektralen Ansatz, um den Ursprung des NIR-AF Signals im RPE des Menschen weiter einzugrenzen.

Methoden: Netzhaut-RPE Schnitte (12 µm) von sechs Spenderaugen (80 – 89 Jahre) mit unauffälliger Makula wurden mittels: 1) konfokalem Mikroskop, Leica Stellaris 8; Weißlicht-Laserquelle [Anregung: 488, 514, 642, 705, 750, 785 nm], 2) Super-resolution Mikroskop mit strukturierter Beleuchtung (SIM) (Zeiss ELYRA S-1, Anregung: 488, 642 nm) und 3) neuartigem NIR-SIM (Anregung: 785 nm) untersucht. Durchlichtaufnahmen dienten als optische Referenz für pigmentierte Organellen. Die Bildprozessierung und Analyse der konfokalen Aufnahmen erfolgte mittels: 1) Bereichsauswahl und Granula-Segmentierung in Fiji, 2) normalisierten Liniendiagrammen (selbstgeschriebenes Skript in Python). Die Prozessierung der SIM Bilder wurde mithilfe von 3) Software Zeiss ZEN 2.3 SP1 (Rekonstruktion der Elyra-SIM-Aufnahmen), 4) Matlab-basierter Software (Rekonstruktion von NIR-SIM-Aufnahmen) durchgeführt. Die Post-Prozessierung und Darstellung der Bilder erfolgte in Fiji.

Ergebnisse: NIR-Anregung (750, 785 nm) zeigte AF von Organellen des RPE-Zellkörpers sowie in den apikalen RPE-Prozessen, während kürzere Wellenlängen (488, 514 nm) Signale von Organellen des RPE-Zellkörpers aufwiesen. Insbesondere die kürzeren Anregungswellenlängen führten zu keiner nachweisbaren AF in den apikalen RPE-Prozessen. Die klar unterschiedlichen Emissionssignale bei kurz- vs. langwelliger Anregung ermöglichen nun eine klare Unterscheidung zwischen einzelnen Organellen: das NIR-AF Signal kann den melaninhaltigen Granula (Mel, Melanin in MLF), das kurzwellige AF-Signal LF-haltigen Granula zugeordnet werden. Beachtenswert: bei 642 nm Anregung waren sowohl LF als auch MLF sichtbar, doch erst ab 705 nm zeigten sich zusätzlich eindeutige Melaninsignale. Erst bei der Anregung mit 785 nm war das AF-Signal nur noch Melanin im Zentrum des MLF und in den Mel des RPE-Zellkörpers und der apikalen Prozesse zuzuordnen.

Schlussfolgerung: Je nach Anregungswellenlänge lassen sich intrazelluläre Organellen des RPEs gut unterscheiden. Insbesondere die melaninhaltigen Granula können erst im NIR-Bereich (785 nm) sicher von LF-haltigen Granula unterschieden werden. Weiterführende histologische Untersuchungen mit der super-resolution Mikroskopie werden weitere Erkenntnisse zur Physiologie und Pathophysiologie (bei altersbedingter Makuladegeneration) der intrazellulären, melaninhaltigen Granula liefern. Diese Daten können dann auch zur Validierung der klinischen NIR-AF-Bildgebung verwendet werden.