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Hintergrund: Die Gentherapie gilt als vielversprechender Ansatz für diverse Erkrankungen. Die Genübertragung durch virale Vektoren wird bereits erfolgreich in der Klinik angewendet. Allerdings bestärken die hierbei auftretenden Nachteile die Weiterentwicklung nicht-viraler Strategien, wie das Einbringen Plasmid-kodierter Gene mit Hilfe der Elektroporation. Wir haben einen gentherapeutischen Ansatz zur Behandlung der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration (nvAMD) entwickelt, der die subretinale Transplantation genetisch modifizierter Pigmentepithelzellen beinhaltet. Die Zellen sind in der Lage, den anti-angiogenen Pigment Epithelium-Derived Factor (PEDF) vermehrt und stabil zu exprimieren, um dem pro-angiogenen Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) entgegenzuwirken. Die hierfür benötigten Methoden wurden mit Standard-Plasmiden und einem laborüblichen Elektroporationsgerät etabliert. Für die Anwendung am Patienten bedarf es Plasmiden, die frei von Antibiotika-Resistenzgenen sind, sowie einem zertifizierten Elektroporationsgerät (Cliniporator).

Methoden: Retinale (RPE) und Iris (IPE) Pigmentepithelzellen von humanen Spenderaugen wurden unmittelbar nach der Isolation unter Verwendung des Cliniporator transfiziert. Das Einbringen des PEDF Gens erfolgte mit Hilfe des optimierten Sleeping Beauty (SB100X) Transposonsystems, kodiert in Plasmiden ohne Antibiotika-Resistenzgen (pFAR). Expression und Sezernierung des PEDF wurden mittels quantitativer RT-PCR bzw. ELISA untersucht. Die Verwendung eines Luciferase-kodierenden pFAR ermöglichte eine zeitnahe Analyse der Genübertragung.

Ergebnisse: Die erfolgreiche Transfektion von 20.000-50.000 frisch isolierten Zellen wurde in wiederholt durchgeführten Experimenten nachgewiesen. Die transfizierten Zellen wiesen eine 15- bis 20-fach gesteigerte PEDF Sezernierung auf. Die Transfektion mit dem Luciferase-kodierenden pFAR führte zu relativen Lumineszenz-Einheiten von 150 (IPE) bzw. 500 (RPE). Jedoch konnte bei einem gewissen Prozentsatz keinerlei Transgen-Expression nachgewiesen werden.

Schlussfolgerungen: Die pFAR/SB100X-vermittelte Transfektion frisch isolierter Pigmentepithelzellen führt zu erhöhten PEDF Konzentrationsspiegeln. Die Verwendung des zertifizierten Cliniporator stellt den ersten wichtigen Schritt für die effiziente und sichere Übertragung des PEDF Gens in Pigmentepithelzellen - entnommen von Patienten mit nvAMD - dar, gefolgt von der subretinalen Transplantation. Die antibiotikafreie Plasmid-Produktion bringt eine Verbesserung der biologischen Sicherheit mit sich, ein weiterer entscheidender Aspekt für die humane Applikation.