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Kryokonservierte Amnionmembran für die Rekonstruktion der Augenoberfläche produziert keine bioaktive Substanzen
Cryopreserved amniotic membrane for ocular surface reconstruction does not actively produce bioactive substances
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Veröffentlicht: | 18. September 2006 |
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Gliederung
Text
Ziel
Es wurde oft berichtet, dass kryokonservierte Amnionmembran (kryo-AM) verschiedene Faktoren auf RNA Ebene exprimiert und sogar lösliche Proteine sezernieren soll, die wundheilungsfördernd bei der Rekonstruktion der Augenoberfläche wirken. Wir möchten klarstellen, dass AM nach Kryokonservierung devitalisiert ist und daher solche Faktoren aktiv nicht exprimieren und sezernieren kann.
Methode
Wir haben einen Zell-Vitalitätsassay für frische sowie kryo-AM benutzt, um mit Plasmamembran-inpermeablen Propidiumiodid tote Zellen zu detektieren und mit Membran-permeablen Calcein-Acetoxymethylester (Calcein-AM) lebende Zellen (Calcein-positiv) sowie tote Zellen (Calcein-negativ) zu identifizieren. Als positive und negative Kontrollen für die Färbung haben wir lebende, Paraformaldehyd-fixierte (tote) sowie semi-intakte 3T3-Zellkulturen, welche kurz mit 0.01% Saponin permeabilisiert wurden, verwendet. Zusätzlich haben wir die Gesamt-RNA, die von den AM Proben extrahiert wurde, analysiert.
Ergebnisse
Im Gegensatz zu frischer AM waren die Zellen der kryo-AM (50% DMEN/50% Glycerol) eindeutig devitalisiert. Alle Zellen auf kryo-AM waren mit Propidiumiodid gefärbt. Calcein-AM, welches in lebenden Zellen nach enzymatischer Hydrolisierung fluoresziert und dann im Zytoplasma zurückgehalten wird, war homogen in lebenden Zellen verteilt, was nicht für kryo-AM zutraf. Die lebenden, fixierten und permeabilisierten 3T3 Zellen bestätigten, dass der Assay wie erwartet funktionierte. Im Einklang mit diesen Resultaten konnten wir mit verschiedenen Extraktionsmethoden intakte RNA von guter Qualität aus frischer AM isolieren, jedoch nur stark degradierte RNA aus kyo-AM und gar keine RNA aus kryo-AM nach länger Inkubation in Zellkulturmedium.
Schlussfolgerungen
Weil die Zellen der kryo-AM nach dem Auftauen eindeutig devitalisiert, keine enzymatische Aktivität detektierbar und keine intakte RNA extrahierbar war, ist es generell unmöglich, dass dieses Material aktiv irgendwelche bioaktive Substanzen produzieren oder gar sezernieren kann. Falls allerdings solche aus kryo-AM freigesetzt werden, so sind diese vermutlich Zellreste von geschädigten, toten Zellen. Da diese Faktoren in der Praxis ausgewaschen werden, ist ein längerfristiger Nutzen solch löslicher Zerfallsprodukte fraglich, d. h. höchstwahrscheinlich zeitlich begrenzt. Deshalb empfehlen wir in Fällen, wo die AM als Patch in der Rekonstruktion der Augenoberfläche eingesetzt wird, diese regelmäßig in kurzen Zeitabständen zu erneuern.