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Fragestellung: Eine Überaktivität von Osteoklasten ist nach wie vor eine häufige Ursache für Knochenbrüche bei älteren Patienten. Einer der ersten Schritte in der Osteoklastenbildung ist die Fusion von monozytären Vorläuferzellen, wodurch am Ende des Reifungsprozesses mehrkernige Osteoklasten entstehen. Osteoklasten werden daher als mehrkernige Riesenzellen hämatopoetischer Abstammung mit der einzigartigen Fähigkeit, Knochen zu resorbieren, beschrieben. Insbesondere in Riesenzelltumoren und beim Morbus Paget kann es dabei zu einer sehr hohen Zahl von Nuclei pro Osteoklast (>100) kommen. Inwieweit die Zellkernanzahl jedoch einen Einfluss auf die Resorption hat ist bisher nicht bekannt.

Ziel dieses Versuchsvorhabens war es daher molekulargenetische Osteoklasten mit erhöhter Zellkernanzahl zu erzeugen um den Einfluss selektiv zu untersuchen.

Methodik: Zur Erleichterung der Zellfusion wurden zwei Zellmodelle mit einem lentiviralen CD9-GFP Vektor transduziert:

1. die humane Monozytenzelllinie THP-1 und

2. primäre CD14+ humane Monozyten.

hPBCMs wurden aus menschlichen Buffy Coats isoliert und nach CD14+ sortiert. Die Monozyten wurden im Anschluss mit einem lentiviralen CD9-GFP Vektor transduziert. Die Überexpression von CD9 wurde durch Genexpression und Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Unter Verwendung von RANKL und M-CSF wurden die Monozyten auf Kunststoff und auf Rinderknochenscheiben zu reifen Osteoklasten differenziert. Morphologie, Anzahl der Zellkerne und Aktivität wurden mit TRAP+DAPI-Färbung nach 7 Tagen und Toluidinblau-Färbung von Knochenscheiben nach 28 Tagen analysiert.

Für die Bestimmung der Zellgröße und der Resorptionsfläche pro Knochenscheibe wurde ein interaktives Lernprogramm mithilfe einer künstlichen Intelligenz (ilastik) trainiert.

Ergebnisse und Schlussfolgerung: CD9 transduzierte THP-1-Zellen zeigten eine signifikante CD9-Überexpression auf mRNA-Ebene (8,4-fach) und Proteinebene (13,7-fach). Zellen mit CD9-Überexpression wiesen eine signifikant höhere Anzahl von Zellkernen (6 Kerne/Zelle) auf als die Kontrollzellen (4 Kerne/Zelle), während sich die Zelloberfläche verkleinerte. Weder die THP-1-Wildtyp- noch die transduzierten Zellen zeigten nach der Kultivierung auf Knochenscheiben Anzeichen von Resorption.

Nach CD9-GFP Transduktion von CD14+ hPBMCs wurde ein starkes GFP-Signal in der Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Eine CD9 Überexpression führte zu einer erhöhten Anzahl an Zellkernen (CD9: 7,4 Kerne/Zelle vs. Kontrolle: 4,5 Kerne/Zelle), wodurch ein Vergleich mit Osteoklasten mit niedriger Kernzahl (ohne CD9 Überexpression) möglich wurde. Die quantitative Analyse der Knochenresorption zeigte keinen signifikanten Unterschied in der gesamten resorbierten Fläche, jedoch zeigten CD9 Osteoklasten kleinere Resorptionslakunen.

Zusammengefasst ist die CD9 Überexpression ein geeignetes Modell um eine erhöhte Zellkernanzahl bei Osteoklasten herbeizuführen und einen möglichen Einfluss unterschiedlicher Mengen an Zellkernen in Zukunft weiter zu untersuchen.