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Fragestellung: In-vitro-Modelle unter Verwendung humaner Bindegewebszellen (Fibroblasten) haben einen hohen Nutzen zur Erklärung grundlegender Vorgänge der Weichgewebeheilung. Um mit diesen Modellen Fragen bezüglich des nachlassenden Heilungspotentials im zunehmenden Lebensalter zu beantworten, ist es notwendig, grundlegende Mechanismen der Zellalterung besser zu verstehen, wie sie sich in nicht seneszenten und bereits prä-seneszenten Fibroblasten in vitro darstellen. Ziel der Studie war es, diese unterschiedlichen Fibroblasten im Rahmen einer Langzeit-Kultivierung zu generieren, zu charakterisieren und zu vergleichen.

Methodik: Kommerziell erhältliche primäre juvenile normale humane dermale Fibroblasten (NHDF) wurden bis zur Passage 43 kultiviert und in nahezu jeder Passage als Kryokultur in einer Master-Cell-Bank (MCB) archiviert.

Neben der Ermittlung der Zellvitalität und -größe und des zellulären Debris mit einem Mehrkanal-Zellzählsystem dienten die Zellzahlen der Berechnung der Populationsverdopplungen pro Passage. Unterschiede der NHDF in den Gruppen „frühe Passage“ („fP“: P5-P17, n=13), „mittlere Passage“ („mP“: P18-P33, n=16) und „späte Passage“ („sP“: P34-P43, n=10) wurden mittels (Rangsummen-) ANOVA (p<0,05) auf Signifikanz überprüft. Zusätzlich wurde die Menge der Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase (SA-β-Gal) und des Gesamtproteins in den Gruppen quantifiziert (n=4/5/2) und verglichen.

Von NHDF aus fP und sP (n=3/3), die nach Kryokonservierung erneut kultiviert wurden, wurde mikroskopisch die Rate SA-β-Gal-positiver Zellen nach Färbung bestimmt und verglichen (t-test; p<0,05).

Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die zunehmende Passagierung führte zu einer Verringerung der Verdopplungen pro Passage.

Im Vergleich der Gruppen fP und mP zeigten sich keine signifikanten Unterschiede bei Zellvitalität und -größe, Menge an SA-β-Gal und Gesamtprotein. Die NHDF der sP hingegen zeigten im Vergleich zu mP und fP Zeichen einer Prä-Seneszenz: Signifikant verringerte Vitalität (81,13 vs. 89,27 vs. 89,23 %), größere Zellen (mittlerer Durchmesser: 21,31 vs. 19,28 vs. 19,01 µm) und erhöhte Menge an SA-β-Gal (27,07 vs. 16,72 vs. 13,96 Fluoreszenzeinheiten / µg Protein). Tendenziell waren dort zusätzlich die Menge an zellulärem Debris (5,10 vs. 3,83 vs. 3,43 x 10⁵/ml) und an Gesamtprotein (60,73 vs. 46,93 vs. 49,79 µg/10⁶ Zellen) erhöht. Auch das erneute Kultivieren von NHDF aus der MCB zeigte bei sP signifikant höhere SA-β-Gal-Raten (29,19 %) als bei fP (5,74 %).

In sP der NHDF können typische Zeichen der Prä-Seneszenz nachgewiesen werden. Kryokonservierte Proben der NHDF in fP und sP bieten damit eine ideale Ausgangsbasis, diesen Weg zur Seneszenz besser zu verstehen, um konkrete Hinweise auf das nachlassende Heilungspotential von Weichgewebe im zunehmenden Lebensalter herauszuarbeiten.