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Fragestellung: Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) haben in der jüngsten Vergangenheit Einzug in viele Forschungsgebiete gehalten. Ihre autologe Verfügbarkeit, immense Expandierbarkeit und intrinsische Fähigkeit zu allen Körpergeweben, also auch zu hyalinem Knorpel, zu differenzieren machen sie auch für die Knorpelregeneration äußerst attraktiv. Hier versprechen iPSCs sowohl die mengenmäßig extrem limitierten humanen artikulären Chondrozyten als auch die eingeschränkte Differenzierungsfähigkeit mesenchymaler Stromazellen (MSCs) aus dem Knochenmark und Fettgewebe zu übertreffen, die osteochondral statt rein chondrogen differenzieren. Vermittelt vor allem durch die stark hochregulierte Aktivität der Alkalischen Phosphatase (ALP) bilden MSCs nach ektoper Implantation mineralisiertes Gewebe. Ziel dieser Studie war es, ein Protokoll zu entwickeln, das humane iPSCs in vitro zu phänotypisch stabilen Chondrozyten ohne ALP-Aktivität differenziert.

Methodik: Humane iPSCs (IMR90-4) wurden zunächst zu mesenchymalen Progenitoren induziert, die dann 6 Wochen lang in 3-dimensionaler Pelletkultur mit 10 ng/mL TGF- in chondrogenem Medium behandelt wurden. Humane Knochenmark-MSCs dienten als Kontrolle. Die Chondrogenese von iPSCs und MSCs wurde histologisch und auf Genexpressionsebene beurteilt. Das Verhältnis von Kollagen II (typisch für hyalinen Knorpel) und Kollagen X (typisch für mineralisierenden Knorpel) wurde durch Western Blot ermittelt. Die ALP-Aktivität wurde in Kulturüberständen quantifiziert und in histologischen Schnitten visualisiert.

Ergebnisse und Schlussfolgerung: Mit der neu entwickelten Kulturführung differenzierten iPSCs zu Chondrozyten, die typische Knorpelmatrix, reich an Proteoglykanen und Kollagen II bildeten, allerdings in einem von MSCs abweichenden Muster. Die Genexpression der Knorpelmarker COL2A1 und SOX9 war nach 6 Wochen Chondrogenese in iPSC- und MSC-Pellets ähnlich hoch. Interessanterweise war Kollagen-X-Protein in iPSC-Pellets kaum detektierbar, während MSC-Pellets viel Kollagen X ablagerten. Sowohl der Kulturüberstand aller iPSC-Pellets als auch die histologische Färbung in 9 von 10 unabhängigen Versuchen zeigten keinerlei ALP-Aktivität. Im Gegensatz dazu wiesen MSC-Pellets eine starke ALP-Aktivität sowohl im Überstand als auch in der Pellet-Peripherie auf.

Unser neuartiges Protokoll kann erfolgreich die iPSC-Chondrogenese antreiben, ohne gleichzeitig die für die Mineralisierung verantwortliche ALP-Aktivität zu induzieren. Dies legt die Grundlage, um die bisher ungelöste Mineralisierungsproblematik aus MSCs generierter Knorpelkonstrukte mittels Verwendung autologer iPS-Zelllinien zu überwinden. Aufbauend auf diesem Erfolg können nun die in großen Mengen und nicht-invasiv verfügbaren iPSCs für die Knorpelregeneration, als In-vitro-Modell für genetische Knorpelerkrankungen und für Medikamentenscreens nutzbar gemacht werden.