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Fragestellung: Die Bedeutung des Steroidhormons Estradiol (E2) auf den Knochenstoffwechsel und Knochentumore ist bekannt. Durch Bindung des Liganden Estradiol an den Estrogenrezeptor alpha (ER α) wird dieser aktiviert, bindet an das "estrogen response element" (ERE) und steuert als Transkriptionsfaktor die Expression zahlreicher Gene. Durch epigenetische Prozesse, wie z. B. die Methylierung der "cytosine-phosphatidyl-guanine (CpG) islands" kann die Transkription von Zielgenen verändert werden; ein hoher Methylierungsstatus ist generell verknüpft mit einer niedrigen Transkription von Zielgenen und nachfolgend mit einer reduzierten Proteinexpression. Bisher gibt es wenig Informationen, ob bei Osteosarkomen Methylierungsprozesse des ER α eine Rolle spielen. Ziel dieser Pilotstudie war, nach Stimulierung mit E2 den Methylierungssatus von ER α in der Osteosarkomzelllinie SAOS-2 zu untersuchen und, abhängig vom Methylierungsstatus, den Einfluss auf Markergene des Knochenstoffwechsels (RUNX2, SP7, SPP1 und BGLAP) zu überprüfen.

Methodik: SAOS-2 Zellen wurden in DMEM kultiviert und mit 10 nM E2 24h inkubiert. Unstimulierte Zellen dienten als Kontrolle. Mittels Immunhistochemie (IHC) wurde die Expression von ER α analysiert. Die Auswertung erfolgte über den Immunreaktiven Score. Zur Ermittlung der mRNA Genexpression wurde die RNA extrahiert, mit der RT-PCR in c-DNA umgeschrieben und eine qPCR durchgeführt. Die unstimulierten Zellen dienten als Referenzkontrolle. Die Semiquantifizierung der mRNA erfolgte mit Hilfe der 2- Δ Δ ct Methode. Zum Nachweis der Methylierung des ER α Promotors wurde je 1 µg extrahierte genomische DNA mit Bisulfit behandelt und eine real-time methylation-specific PCR (rt-MSP) durchgeführt. Die statistische Relevanz wurde mit dem 2way ANONA and Sidak's multiple comparisons test überprüft (p < 0,0001). Es wurden jeweils 3 unabhängige Versuche in Dreifachbestimmung durchgeführt.

Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die stimulierten SAOS-2 Zellen zeigten keine Methylierung des ER α Promotors, dagegen war eine Methylierung des ER α Promotors bei den unstimulierten Zellen nachweisbar. Histologisch zeigten die SAOS-2 Zellen nach E2 Stimulation einen deutlichen Anstieg der Expression des ER α. Die 7-fache Erhöhung des ER α mRNA Levels in der rt-PCR bestätigt die Ergebnisse der IHC bei den stimulierten Zellen. Eine Erhöhung des mRNA Levels aller getesteten knochenspezifischen Gene (RUNX2, SP7, SPP1, BGLAP) wurde gemessen. Die Ergebnisse dieser Pilotstudie deuten darauf hin, dass mit einer E2 Stimulierung auch die Methylierung des ER α Promotors beeinflusst werden kann. Die Regulation der ER α Synthese scheint über die epigenetischen Veränderungen der genomischen DNA möglich zu sein und Einfluss den Knochenstoffwechsel zu nehmen. Die Ergebnisse dieser Pilotstudie zeigen, dass SAOS-2 Zellen ein interessantes Modell zur Untersuchung der ER α Regulation darstellen. Studien zur ER α Promotor Methylierungsanalyse in Osteosarkom Patientenproben sind als nächster Schritt geplant.