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Dreidimensionale Kultivierung humaner immortalisierter mesenchymaler Stromazellen auf Peressigsäure/Ethanol-behandelten Spongiosaträgern
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Autoren
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J. Rauh
- Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Dresden, Klinik und Poliklinik für Orthopädie, Translationales Zentrum, Dresden, Germany
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C. Liebers
- Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Dresden, Klinik und Poliklinik für Orthopädie, Translationales Zentrum, Dresden, Germany
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M. Schieker
- Ludwig-Maximilians-Universität München, Experimentelle Chirurgie und Regenerative Medizin, München, Germany
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K.-P. Günther
- Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Dresden, Klinik und Poliklinik für Orthopädie, Translationales Zentrum, Dresden, Germany
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M. Stiehler
- Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Dresden, Klinik und Poliklinik für Orthopädie, Translationales Zentrum, Dresden, Germany
| Veröffentlicht: | 18. Oktober 2011 |
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Gliederung
Text
Fragestellung: Die Kombination von humanen mesenchymalen Stromazellen (MSC) und Peressigsäure/Ethanol-behandelten Spongiosaträgern (PES) stellt ein vielversprechendes Konzept zur Knochenregeneration dar. Die Anwendbarkeit von primären MSC für zellbasierte regenerative Strategien ist jedoch durch deren Seneszenz und begrenzte Verfügbarkeit limitiert. Die Lebensdauer von MSC kann durch die ektope Expression der katalytischen Untereinheit von humaner Telomerase (hTERT = humane telomerase reverse transcriptase) verlängert werden. Diese Modifikation kann Vorteile in Bezug auf die präklinische Testung zellbasierter Ansätze zur Knochenregeneration bieten. Ziele dieser Studie waren die Untersuchung der Zelladhärenz, Proliferation und osteogenen Differenzierung von auf humanen PES dreidimensional (3D)-kultivierten hTERT-MSC.
Methodik: Mittels lentiviral-basiertem Gentransfer immortalisierte hTERT-MSC (Passage 74) wurden in Basismedium (DMEM mit 10% fötalem Kälberserum) und osteogenem Medium (Dexamethason, Ascorbinsäurephosphat und beta-Glycerolphosphat) für 21 Tage kultiviert. Die 3D-Kultivierung erfolgte auf kubischen humanen PES (DIZG, Kantenlänge 5 mm). Eine zweidimensionale (2D) Zellrasenkultur auf Polystyrol diente als Kontrolle. Proliferation und osteogene Differenzierung wurden mittels Bestimmung der Gesamt-DNA bzw. Messung der alkalischen Phosphataseaktivität (ALP), Osteocalcin- und Osteopontin-ELISA sowie quantitativer real time Polymerasekettenreaktion (PCR) und immunozytochemischer Färbung untersucht. Die Vitalität der auf PES kultivierten MSC wurde anhand einer Live-Dead-Färbung, die Zelladhäsion und Bildung von extrazellulärer Matrix (Fibronectin, Collagen I) immunfluoreszenztechnisch evaluiert. Die statistische Berechnung der Signifikanz erfolgte mittels Varianzanalyse mit Bonferroni-Korrektur (n=6).
Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Die Proliferation von hTERT-MSC war in der Zellrasenkultur im Vergleich zur 3D-Kultur erhöht (p<0,001), wohingegen die 3D-Kultivierung eine gesteigerte osteogene Differenzierung mit höherer ALP-Aktivität und Proteinexpression von Osteocalcin zeigte (p<0,05). Zudem war die Expression osteogener Markergene (ALP, Osteopontin und Osteocalcin) der 3D-kultivierten hTERT-MSC gegenüber der 2D-Kultur erhöht. Mittels Immunfluoreszenz konnten die Zellvitalität, Adhäsion und homogene Verteilung von hTERT-MSCs innerhalb der interkonnektierenden Poren der Spongiosa nachgewiesen werden.
Die 3D-Kultivierung von hTERT-überexprimierenden, immortalisierten MSC auf humaner Spongiosa fördert die osteogene Differenzierung im Vergleich zur Zellrasenkultur. In folgenden Studien soll der Einfluss zusätzlicher biophysikalischer osteogener Stimuli mittels dynamischer 3D-Kultivierung von hTERT-MSC zur Entwicklung innovativer zellbasierter Therapiekonzepte für die Knochenregeneration untersucht werden.
