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Fragestellung: Im Rahmen des vorliegenden Projekts wurde der Einfluss von Kollagen I und von dreidimensionaler Zellkultur auf die osteogene Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen untersucht.

Methodik: Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden mittels Gradientenzentrifugation, gefolgt von Selektion über Adhäsion aus humanem Knochenmark isoliert. Sie wurden entweder auf unbeschichteten, Kollagen I beschichteten Zellkulturschalen, oder auf dreidimensionalen Kollagen I-Schwämmen (Resorba) kultiviert. Die osteogene Differenzierung wurde durch Zugabe von osteogenem Medium (Dexametason, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäurephosphat) induziert. Die Zellzahl wurde über die DNA-Menge quantifiziert.

Die osteogene Differenzierung wurde auf funktioneller Ebene durch Quantifizierung der alkalischen Phosphataseaktivität und der produzierten mineralisierten Matrix nachgewiesen. Auf RNA-Ebene wurde die Expression von 13 typischen osteoblastären Proteinen und Transkriptionsfaktoren untersucht.

Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Die Beschichtung der Zellkulturschalen mit Kollagen I in 2D Kultur steigerte die Proliferation von MSCs. Im Gegensatz zur 2D-Kultur zeigten die Zellen in der 3D Kollagenmatrix eine deutlich geringere Proliferation.

Auf den verschiedenen Matrizes zeigten MSCs eine unterschiedliche Expression von Runx2, einem wichtigen osteogenen Transkriptionsfaktor. So waren die Runx2-Level sowohl in 2D, als auch in 3D Kultur in Anwesenheit von Kollagen I erhöht. Obwohl sie höhere Mengen an Runx2 exprimierten, zeigten die Zellen auf Kollagen I in 2D-Kultur eine vergleichbare Expression Runx2-abhängiger Matrixproteine, wie Bone sialoprotein 2, Osteopontin and Collagen I, zu Zellen, welche ohne Kollagen I kultiviert wurden. In den 3D-Kollagenschwämmen exprimierten MSCs im Gegensatz dazu deutlich höhere Mengen von Osteopontin und Bone sialoprotein 2. Zudem war das RANKL/Osteoprotegrin-Verhältnis in 3D-Kultur in Richtung Knochenkatabolismus verschoben.

Unsere Studie bestätigt einen ausgeprägten Einfluss von Art und Struktur der extrazellulären Matrix auf Proliferation und osteogene Differenzierung von humanen MSCs in Kultur. Bemerkenswerterweise zeigte Kollagen I hierbei unterschiedliche Effekte in 2D- und 3D-Kultur. Während es in 2D-Kultur zu verstärkter Proliferation führte, verbesserte es die osteogene Differenzierung in 3D-Kultur.

Da Runx2 gleiche Expressionslevel in 2D- und 3D-Kultur in Anwesenheit von Kollagen I aufwies, müssen diese Unterschiede durch eine unterschiedliche Runx2-Aktivität bedingt sein. Die Aktivität von Runx2 wird durch Phosphorylierung moduliert. Diese kann von Kollagen I über das Integrin a2β1 und den MAP-Kinasepathway vermittelt werden. Ob die Unterschiede im Zellverhalten in 2D- und 3D-Kollagen I Kultur durch Integrin-Signaling oder durch Hypoxie bedingt sind, ist Gegenstand aktueller Untersuchungen.