gms | German Medical Science

Fragestellung: Die Lasermikrodissektion (LMD) ermöglicht die isolierte Untersuchung von Einzelzellen verschiedener Histiogenese aus (Tumor-)Gewebe. Für Genexpressions-untersuchungen (mRNA) bieten sich hierfür insbesondere kryokonservierte Proben an. Wir haben die Durchführbarkeit derartiger Gen-expressionsuntersuchungen anhand mikro-dissezierter Tumorgefäße von Weichteil-sarkomen (WTS) untersucht und deren Einsatz-möglichkeit in einem Tumor-Organkulturmodell überprüft.

Methodik: Zum einen wurden repräsentative Gewebeproben von Weichteilsarkomen unmittelbar bei Entnahme kryokonserviert. Aus den Gefrierschnitten dieser Proben (10-12µm) wurden unterschiedlich viele Gefäße mittels LMD (P.A.L.M. Microlaser Technologies, PALM® MicroBeam ) gewonnen und deren mRNA isoliert. Anschließend wurde die Möglichkeit der quantitativen real time PCR-Untersuchung (ABI PRISM™ 7700 Sequence Detector) des endothelspezifischen Markers VE-Cadherin geprüft. Zum anderen wurden Gewebeproben zur Etablierung eines Organkulturmodells bei Entnahme direkt in Zellkulturmedium gebracht. Das native Tumormaterial wurde bis zu 72h kultiviert. Auch in den Proben dieser Organkultur wurde die mRNA isoliert und deren Integrität ebenfalls mit der quantitativen real time PCR für die Primer tPA (Tissue Plasminogen Activator), uPA (Urokinase Plasminogen Activator) und PAI-1 (Plasminogen Aktivator Inhibitor-1) in den Abständen 0h, 6h, 12h, 24h, 48h und 72h untersucht. Zu allen definierten Zeitpunkten wurden die Proben ebenfalls histologisch auf Vitalität untersucht.

Ergebnisse: Mit jeweils 10-20 Gefäßen pro mikrodissezierter Gewebeprobe ließ sich in der PCR die Expression von VE-Cadherin nachweisen. Damit konnte die Integrität der mRNA in diesem Ansatz nachgewiesen werden. Für optimale Ergebnisse war neben einem RNase-freien Arbeitsmilieu insbesondere eine rasche Probenverarbeitung essentiell. In der Organkultur konnte über die Zeitachse nachgewiesen werden, dass auch nach 72h eine Isolierung und Amplifikation von mRNA für die beschriebenen Primer möglich war. Auch histologisch zeigte sich nach 72h vitales Tumorgewebe.

Schlussfolgerung: Mit Hilfe der LMD können gezielt molekulargenetische Untersuchungen an minimalen Mengen eines spezifischen Gewebes, in unserem Fall Gefäßendothel von Tumoren, durchgeführt werden. Diese Technik in Kombination mit einer Organkultur bietet die Möglichkeit, dynamische Untersuchungen der Genexpression von beispielsweise Tumorendothelzellen (Angiogenese) im Gewebeverband durchzuführen. Diese stellt eine Ergänzung zu den gängigen Kulturmodellen mit Zelllinien dar und bietet Vorteile gegenüber Untersuchungen von heterogenen, vollständigen Tumorproben.