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Einleitung: Neben der Metastasierung über das Blutgefäßsystem metastasieren maligne Tumoren in andere Organe über die Lymphgefäße, was als die Haupttodesursache bei Krebspatienten und als größtes Hindernis bei der Entwicklung effektiver Krebstherapien angesehen wird. Ein therapeutischer Ansatz zur Verhinderung oder Reduktion der lymphogenen Metastasierung könnte zukünftig auf die Lymphgefäße selbst zielen, allerdings sind die molekularen Mechanismen der Wechselwirkungen zwischen Lymphendothelzellen, Stammzellen und Tumorzellen sowie die Entstehung der tumorassoziierten Lymphangiogenese noch nicht aufgeklärt.

Das AV-Loop Modell hat sich als grundsätzlich sehr gut geeignet erwiesen, um Angiogenese-Effekte unter „kontrollierten“ in vivo Bedingungen zu untersuchen und weist im Gegensatz zu klassischen subkutanen in vivo Angiogenese- und insbes. Lymphangiogenesemodellen nicht den Nachteil einer zusätzlichen extrinsischen Vaskularisation und damit möglichen separaten Modulation des Prozesses der Angiogenese und Lymphangiogenese auf. Das geschlossene System der Isolationskammer des AV-Loop Modells interagiert hingegen bei kontrollierter intrinsischer Vaskularisation gleichzeitig mit den systemischen Prozessen des gesamten Organismus und könnte daher ein ideales Modell für die Untersuchung und zukünftige Modulation der Lymphangiogenese im Kontext der Tumor-Metastasierung darstellen. In der vorliegenden Studie wurde daher zunächst in vitro die Interaktion von Lymphgefäßendothelzellen (LEC) und mesenchymalen Stammzellen (MSC) untersucht. Anschließend sollte im in vivo Versuchsteil mit Hilfe von LEC und MSC im AV-Loop Modell der Ratte ein autonomes Lymphgefäßnetzwerk etabliert werden.

Material und Methoden: In in vitro Versuchen wurde die Interaktion von MSC und LEC über Zytokine und/oder Zell-Zellkontakte untersucht. Die LEC Proliferation wurde mittels MTT-Assays nach 24, 48 und 72 h ermittelt. Die Zellen wurden hierfür mit Kontrollmedium (Endothelzell-Basalmedium +0,5% FCS), PMA, VEGF-C, bFGF, HGF oder MSC konditioniertem Medium bzw. MSC-Kontrollmedium stimuliert und der Effekt auf die lymphogene Antwort der LEC beobachtet. Es wurde die Beteiligung der MSC am Gefäßaufbau durch das Bilden röhrenförmiger LEC Strukturen in vitro in einem sogenannten Tube-Formation-Assay untersucht. Die Zellen wurden auf Matrigel® ausgesät und analog zu den zuvor beschriebenen Versuchen stimuliert und mit Hilfe neutralisierender Antikörper näher charakterisiert. Anschließend wurde im AV-Loop Modell in immundefizienten Ratte ein autonomes Lymphgefäßnetzwerk mit Hilfe von LEC und MSC etabliert. Hierzu wurden im AV-Loop Modell Ratte humane LEC eingebracht und unter Zugabe humanen MSC und von Wachstumsfaktoren die Bildung des Lymphgefäßnetzwerks stimuliert.

Ergebnisse: Es konnte eine potente Stimulation durch die MSC sekretierten Faktoren auf die LEC Proliferation gezeigt werden. Dieser Effekt war stärker als nach Stimulation mit VEGF-C, bFGF und HGF. Die Zugabe von löslichen Antikörpern sowohl zu den einzelnen Wachstumsfaktoren im Kontrollmedium als auch zu dem MSC konditionierten Medium blockierte die stimulierende Wirkung.

Zur Untersuchung der LEC Migration wurde eine Läsion in den konfluenten LEC Zellrasen eingebracht und die Zellen analog zum Proliferationstest stimuliert. Das MSC konditionierte Medium führte zu einer verstärkten LEC Migration, welche ebenfalls durch neutralisierende Antikörper blockiert werden konnte. Des Weiteren konnte im Transmigrationsversuch (Transwell Assay-System) eine Erhöhung der lymphogenen Antwort im Vergleich zur Kontrollgruppe und der Stimulation mit Wachstumsfaktoren wie VEGF-C und bFGF durch den MSC vermittelten lymphangiogenen Effekt beobachtet werden.

Im dreidimensionalen Sphäroid-basierten Experiment wurde ein vermehrtes Aussprossungsverhalten der LEC nach Stimulation mit MSC konditioniertem Medium und Wachstumsfaktoren wie VEGF-C und bFGF beobachtet.

Die Zugabe von MSC konditioniertem Medium und die Ko-Kultivierung von LEC und MSC führte zu einer verstärkten Netzwerkbildung im Vergleich zur nicht stimulierten Kontrolle. Weitere Versuche mit löslichen Antikörperfragmenten und dem Einsatz von siRNA zur Bestätigung der Ergebnisse werden derzeit durchgeführt.

Im folgenden in vivo Teil wurden humane LEC in Form von Sphäroiden in immundefiziente Ratten eingebracht. Mit Hilfe von humanen MSC und LEC konnte ein Lymphgefäßnetzwerk etabliert werden. Durch immunhistologische Färbungen konnte die Gefäßnetzwerkbildung sowie die Bildung von Lymphgefäßen mittels spezifischer Lymphendothelzellmarker wie LYVE1 und Podoplanin nachgewiesen werden.

Diskussion: In dieser Studie konnte eine potente Stimulation der Lymphangiogenese durch MSC in vitro und in vivo im AV-Loop Modell gezeigt werden. Erstmalig konnte ein rein intrinsisch, neu gebildetes Lymphgefäßnetzwerk etabliert werden, welches Anschluss an das Gefäßnetzwerk findet und somit zur Lymphgefäßdrainage aus dem gezüchteten Gewebe beiträgt. Dieses Modell könnte zukünftig außer für Tissue Engineering Ansätze auch zur Untersuchung der Lymphangiogenese, Anti-Lymphangiogenese sowie Metastasierungsversuche eine wertvolle Grundlage darstellen, so dass die Neubildung von Lymphgefäßen in pathologischen Vorgängen wie der Tumorlymphangiogenese besser verstanden und zukünftig die lymphatische Metastasierung genauer charakterisiert und therapeutisch moduliert werden könnte.