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Einleitung: Tissue Engineering (TE) von Skelettmuskelgewebe ist ein vielversprechender Therapieansatz zur Verbesserung gängiger Behandlungskonzepte von Weichgewebs- und insbesondere Muskeldefekten in der plastisch-rekonstruktiven Chirurgie.

Das Tissue Engineering von Skelettmuskelgewebe soll sowohl die Funktionalität des Transplantates steigern als auch eine individuell steuerbare Anpassung an der Defektstelle ermöglichen.

Da primäre Myoblasten in hohen Passagen ihre Differenzierungsfähigkeit verlieren, sind sie als alleinige Zellgruppe für das Tissue Engineering von Skelettmuskelgewebe ungeeignet.

Mesenchymale Stammzellen (MSC) stellen hier eine vielversprechende Zellgruppe dar, da sie auch nach Expansion ihre Differenzierungsfähigkeit nicht verlieren. Sowohl Dexamethason als auch basic fibroblast growth factor (bFGF) spielen eine zentrale Rolle in dem Prozess der myogenen Differenzierung. Zusätzlich zu diesen Faktoren sind eine Reihe weitere Wachstumsfaktoren, u. a. hepatocyte growth factor (HGF) und insulin-like growth factor 1 (IGF-1), als zentrale Schlüsselpunkte bei der Regeneration von Muskelgewebe identifiziert. In dieser Studie soll als neuer Ansatz die myogene Differenzierung einer Ko-Kultur aus primären Myoblasten und mesenchymalen Stammzellen unterschiedlicher Quellen unter dem Einfluss von Dexamethason, bFGF und verschiedenen Konzentrationen von HGF und IGF-1 untersucht werden. Des Weiteren wurden parallel gesponnene PCL-Kollagen Nanofaserscaffolds mittels Electrospinning generiert und mit MSC und Myoblasten unter verschiedenen Differenzierungsbedingungen besiedelt.

Material und Methoden: Die myogene Differenzierungskapazität von GFP-gelabelten MSC in Ko-Kultur mit Myoblasten und 3 verschiedenen Konzentrationen von HGF und IGF-1 (10 ng/ml, 30 ng/ml, 60 ng/ml) wurde mittels qPCR, Immunhistochemie und FACS-Analyse nach 2 und 7 Tagen untersucht. Anhand der myogenen Marker Desmin, MyoD, Myogenin, MHC und MEF2 konnte mittels qPCR eine quantitative Aussage über das Differenzierungspotential auf mRNA Ebene getroffen werden. Zur Beurteilung der Differenzierung auch auf Proteinebene wurde per FACS-Analyse die Expression von α-sarkomerischem Aktin, MyoD, MEF2 und MHC ermittelt. Bei der Immunhistochemie wurden dieselben Antikörper wie bei der FACS-Analyse verwendet.

Parallel gesponnene Nanofaserscaffolds aus gleichen Anteilen PCL und Kollagen wurden mittels Electrospinning generiert und mit MSC und Myoblasten besiedelt. In den Scaffolds wurden mittels DAPI und TUNEL-Färbung die Besiedelung und das Überleben der Zellen untersucht.

Ergebnisse: Die Auswertung der quantitativen PCR-Analyse zeigte durch die Expression von MEF2 und MHC myogene Differenzierungskapazität der MSC, wenn diese sich in Ko-Kultur mit Myoblasten befinden. Unter dem Einfluss von Dexamethason, bFGF und HGF / IGF-1 wurden diese Marker zusätzlich hochreguliert. Des Weiteren konnte auf Proteinebene anhand der FACS-Analyse eine vermehrte Expression von MEF2 und α-sarkomerischem Aktin gezeigt werden. In der immunhistochemischen Analyse wurde bei den MSC die Bildung von Myotuben beobachtet, wenn sie mit Myoblasten kultiviert wurden und unter dem Einfluss myogener Zusätze waren.

Die parallel gesponnenen PCL-Kollagen Nanofaserscaffolds, welche mit MSC und Myoblasten besiedelt wurden, zeigten anhand der DAPI und TUNEL-Färbung sowohl eine gute Zelladhärenz auf dem Scaffold als auch eine niedrige Apoptoserate.

Diskussion: Das Tissue Engineering von Skelettmuskelgewebe ist eine vielversprechende Methode, mit der Muskelgewebe für klinische Anwendungen gezüchtet werden kann. Diese Gewebe könnten sowohl im Bereich der regenerativen Medizin zur Wiederherstellung von funktionellem Muskelgewebe als auch zur Defektdeckung nach Trauma, Krebserkrankung oder anderen erworbenen Muskelkrankheiten genutzt werden. MSC weisen im Gegensatz zu primären Myoblasten auch nach Expansion eine gute Differenzierungskapazität auf und qualifizieren sich somit als Erfolg versprechende Zellgruppe für das Tissue Engineering von Skelettmuskel. In vorherigen Studien konnte bereits gezeigt werden, dass die Ko-Kultivierung primärer Myoblasten mit MSC vielversprechende Voraussetzungen für das Tissue Engineering bieten.

In dieser Studie konnten wir optimale Ko-Kultur Bedingungen für die myogene Differenzierung von MSC bis hin zur Myotubenbildung etablieren. Sowohl auf mRNA Ebene als auch auf Proteinebene konnte die Expression von spezifischen myogenen Markern, wie MEF2, MHC, α-sarkomerisches Aktin und Desmin, nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse könnten ein aussichtsreicher Ansatz im Bereich der klinischen Anwendbarkeit des Muskel Tissue Engineering sein.