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RIP2beta: Identifikation und Charakterisierung einer neuen alternativen Spleißvariante der Receptor Interacting Protein Kinase RIP2
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Veröffentlicht: | 17. Mai 2010 |
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Einleitung: RIP2 ist ein Mitglied der Receptor Interacting Protein (RIP) Kinase Familie. RIP2 aktiviert den Transkriptionsfaktor NF-kappaB und die MAP-Kinasen JNK, ERK1/2 und p38, wodurch RIP2 eine bedeutende Rolle in der Regulation des Immunsystems sowie in der NOD-Signalkaskade zukommt. Darüber hinaus aktiviert RIP2 die CD95 induzierte Apoptose über eine Stimulation der Caspase-8 und Caspase-1 wodurch IL-1beta sezerniert wird.
Material und Methoden: RNA aus Zellinien diente der Amplifikation der RIP2-Varianten mittels RT-PCR. Die RIP2-Isoformen wurden kloniert und für Immunopräzipitationen und funktionelle Analysen in HEK293T Zellen überexprimiert. Die Aktivitätsmessung von NF-kappaB erfolgte als Luciferase Gen Reporter luminometrisch. Der MTS-Assay diente zur Bestimmung der Proliferation. Caspase-8 Aktivität wurde luminometrisch bestimmt. Ein ELISA quantifizierte den Gehalt an IL-1beta im Zellkulturüberstand. Die Phosphorylierung von p38 wurde im Western Blot verifiziert. Ein in vitro Kinase Assay mit radioaktiv markiertem ATP diente der Bestimmung der Kinase Aktivität.
Ergebnisse: Durch eine BLAST-Analyse konnten wir eine Spleißvariante von RIP2 identifizieren (RIP2beta), die durch den Verlust des Exon 2 zur Translation eines Proteins mit Deletion der Kinase Domäne (KD) und CARD führt. Eine differentielle Expression konnte von RIP2 in Karzinomzellinien verifiziert werden. Während wir zeigen konnten, dass die klassische Isoform (RIP2alpha) über die CARD und Kinase Domäne homodimerisiert, fehlte eine Oligomerisierung der RIP2beta-Variante. Die Deletion der KD verhindert eine Autophosphorylierung in RIP2beta. Im Gegensatz zu RIP2 alpha lies RIP2beta eine Aktivierung von NF-kappaB und der MAPK p38 vermissen. Der Verlust der CARD in RIP2beta bedingt die fehlende Aktivierbarkeit der Caspase-1 und -8.
Schlussfolgerung: Wie anhand von Gentransferexperimenten gezeigt werden konnte, sind die strukturellen Veränderungen in RIP2beta mit einem Verlust der Aktivierbarkeit von NF-kappaB, MAPK, Sekretion von IL-1beta und der Caspase-8 vermittelten Apoptose assoziiert. So ist zu vermuten, dass der Vorgang des alternativen Spleißens an der Regulation der RIP2-Funktionen beteiligt ist und somit die Komplexität der RIP2 Signalwege untermauert.