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Beta-Catenin bildet einen Abbaukomplex mit dem COP9 Signalosom (CSN)
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Veröffentlicht: | 2. Mai 2006 |
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Einleitung: Beta-Catenin ist das zentrale Element im Wnt-Signalweg. Seine Interaktion mit Adhäsions-, Transkriptions- und Abbaukomplexen ist für ordnungsgemäße Zell-Zellkontakte einerseits und regelgerechte Genaktivierung andererseits verantwortlich. Kolorektale Karzinome und eine Vielzahl weiterer Tumore werden unter anderem durch eine Überaktivität des Wnt/beta-Catenin Signalwegs verursacht. Dies resultiert in einer konstitutiven beta-Catenin vermittelten Transaktivierung von Genen wie Cyclin D1, c-MYC, VEGF. Der gestörte Abbau des zytoplasmatischen beta-Catenins spielt dabei in den meisten Kolonkarzinomen eine Rolle. Die Proteolyse von beta-Catenin wird durch Phosphorylierung durch GSK3-beta und Interaktion mit Adenomatosis Polyposis Coli (APC) mit nachfolgender Ubiquitinierung und einem Abbau über das Ubiquitin-Proteasom-System gewährleistet. Dabei wird beta-Catenin durch einen Cullin-Ring-Ligase-Komplex (CRL) ubiquitiniert. Das COP9 Signalosom (CSN) ist ein hoch konservierter Proteinkomplex, der aus 8 Untereinheiten besteht. Er ist ein Regulator des Ubiquitin-Systems und bei essentiellen regulatorischen Prozessen wie Signaltransduktion und Transkriptionsaktivierung beteiligt. Da das Signalosom die CRLs kontrolliert, haben wir seine Beteiligung am Abbau des beta-Catenins untersucht.
Material und Methoden: Beta-Catenin wurde in die Vektoren pCMVTag3C, pQE32, pcDNA3.1 und Flag-Vektor kloniert, um rekombinantes Protein herzustellen, respektive Zellen mit den jeweiligen Vektoren zu transfizieren. Initial wurde die endogene beta-Catenin Expression in Karzinom-Zelllinien (HT29, CaCo-2, SW480, MCF7 und HeLa) in Western Blots analysiert. Glycerol-Dichtegradientenzentrifugation wurde sowohl von Zelllysaten als auch mit rekombinantem beta-Catenin und aufgereinigtem CSN-Komplex durchgeführt. Immunpräzipitationen von rekombinantem beta-Catenin und Zelllysaten mittels CSN7 Antikörper bzw. beta-Catenin Antikörper wurden etabliert.HeLa Zellen wurden mit Flag-markiertem beta-Catenin transfiziert oder mit Flag-markiertem CSN7 und myc-markiertem beta-Catenin co-transfiziert. Pull-down Experimente mit den jeweiligen transfizierten Zellen wurden für das Flag-markierte beta-Catenin oder Flag-markiertes CSN-7 durchgeführt.
Ergebnisse: Dichtegradientenzentrifugation mit Lysaten von HT29 und MCF7 Zellen zeigte, dass beta-Catenin und das CSN in den gleichen Fraktionen co-sedimentierten, und dass diese Fraktionen außerdem CRLs enthielten. Eine Interaktion zwischen beiden Komponenten konnte durch die Dichtegradientenzentrifugation von rekombinantem beta-Catenin und aufgereinigtem CSN-Komplex nachgewiesen werden. Hier gab es eine Verschiebung des beta-Catenins hin zu den Fraktionen des CSN, im Vergleich zu rekombinantem beta-Catenin allein, das in Fraktionen niedrigerer Dichte sedimentierte. Außerdem konnten wir in Immunpräzipitationen eine Co-Präzipitation von beta-Catenin und CSN zeigen. Darüber hinaus ließ sich in den Pull-Down Experimenten eine Komplexbildung zwischen beta-Catenin und dem CSN nachweisen. Zusätzlich konnten Cullin 1 und Cullin 3, Komponenten der CRLs, und das APC Protein in diesem Komplex nachgewiesen werden.
Schlussfolgerung: Wir konnten die Existenz von Superkomplexen bestehend aus beta-Catenin, CSN, CRLs und APC nachweisen. Diese Komplexe sind höchstwahrscheinlich verantwortlich für einen gerichteten Abbau des beta-Catenins über das Ubiquitin-Proteasom-System. Weitere Experimente zur Rolle des Wnt-Signalwegs in Bezug auf die Komplexentstehung werden gegenwärtig in unserem Labor durchgeführt.