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Die Internalisierung von Tight-Junction Proteinen nach Interferon-gamma Inkubation erfolgt Endozytoseabhängig durch Makropinozytose
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Autoren
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Matthias Brüwer
- Klinik und Poliklinik für Allgemeine Chirurgie, Universitätsklinikum Münster; Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University, Atlanta, GA, USA
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M. Utech
- Klinik und Poliklinik für Allgemeine Chirurgie, Universitätsklinikum Münster; Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University, Atlanta, GA, USA
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A.M. Hopkins
- Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University, Atlanta, GA, USA
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A. Nusrat
- Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University, Atlanta, GA, USA
| Veröffentlicht: | 7. Oktober 2004 |
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Gliederung
Text
Einleitung
Die Darmschleimhaut ist eine dynamische Barriere. Unter physiologischen Bedingungen gewährleistet sie eine regulierte Resorption von Nährstoffen und Wasser, welche durch tight junctions (TJ) reguliert wird. Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) ist diese Barrierefunktion gestört. Kürzlich konnten wir in vitro zeigen, daß das proinflammatorische Zytokin Interferon- gamma (IFN-γ), welches bei CED in der Darmmukosa erhöht ist, zu einer Internalisierung der TJ-Proteine Occludin, Junction Adhesion Molecule (JAM)-1, Claudin-1 und -4 mit reversiblem Verlust der Barrierefunktion führt. Ziel dieser Studie war es jetzt zu untersuchen, ob ein vermehrter Abbau/Neusynthese der TJ-Proteine Occludin und JAM-1 mit der IFN-γ bedingten Internalisierung vergesellschaftet ist oder/und endozytotische Pathways darin involviert sind.
Material und Methoden
Nach Inkubation konfluenter T 84-Epithelzellen mit 100U/ml IFN-γ wurde der Zeitpunkt der Internalisierung von Occludin und JAM-1 sowie im weiteren Zeitverlauf verschiedene zelluläre Kompartimente des Endozytose-Pathways (Clathrin coated pits, Caveolae, frühe, späte und Recycling-Endosomen) mittels Immunofloureszenz/konfokaler Mikroskopie bestimmt. Durch Inhibitoren wurden 3 Endozytosewege - Makropinozytose, Caveolin bzw. Clathrin vermittelt - untersucht. Pulldown-Assays/Western-Blots für die GTPasen RhoA, Rac1 und Cdc42, welche eine wichtige Rolle in der Endozytose spielen, dienten zur Untersuchung des Aktivierungszustandes dieser Proteine. Western Blots für Occludin und JAM-1 im Gesamtzelllysat mit/ohne Ko-Inkubation durch den Proteinsynthesehemmer Camptothecin erfolgten zum Nachweis/Ausschluss eines vermehrten Proteinabbaus/Neusynthese.
Ergebnisse
Nach 36 Stunden IFN-γ Inkubation kam es zur Internalisierung der TJ-Proteine Occludin und JAM-1, welche im weiteren Zeitverlauf zunahm und mit einer signifikanten Erhöhung der parazellulären Permeabilität einherging. Ferner kam es durch IFN-γ zur vermehrten Aktivierung von RhoA, Rac 1 und Cdc42 gegenüber Kontrollen. In der konfokalen Mikroskopie beobachteten wir eine Ko-Lokalisation der internalisierten TJ-Proteine mit frühen (EEA-1) und Recycling-Endosomen (Rab-11), nicht aber mit späten Endosomen (Rab-9) oder Lysosomen (LAMP-1). Durch Inhibierung der Makropinozytose mittels EIPA (5-(N-ethyl-N-isopropyl)-amiloride) oder Wortmannin konnte die Internalisierung von Occludin und JAM-1 verhindert werden. Dahingegen zeigten Inhibitoren des Caveolin - (Nystatin, Cholesteroloxidase) bzw. Clathrin - Pathways (0,4 M Sucrose, Phenylarsinoxid) keine diesbezüglichen Effekte. Ebenso war die IFN-γ Inkubation ohne Einfluss auf Abbau/Neusynthese der o.g. TJ-Proteine.
Schlussfolgerung
Unsere Ergebnisse zeigen, daß TJ-Proteine durch IFN-γ Endozytoseabhängig internalisiert und diese ohne Proteinneusynthese durch Recycling-Endosomen wieder zur basolateralen Membran gelangen können. Diese Mechanismen könnten bedeutsam sein für pathophysiologische Vorgänge im Rahmen der veränderten Barrierefunktion bei CED.
