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Nach erfolgreicher Etablierung dieser neuen Ringversuchsserie wollen wir hier auch für Kolleginnen und Kollegen, die bisher noch nicht an diesen Ringversuchen teilgenommen haben, die Ergebnisse der aktuellen Ringversuche für den PCR/NAT-gestützten Nachweis von Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, EHEC/STEC, Borrelia burgdorferi sensu lato, Legionella pneumophila, Salmonella enterica und Listeria spp., MRSA bzw. cMRSA, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetii, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Brucella spp., Pneumocystis jirovecii (vormals P. carinii), Clostridium difficile (Toxingene), VRE (Vancomycin-resistente Enterokokken) und der molekularen Resistenztestung für Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae sowie dem im Mai 2019 neu ins Programm aufgenommenen Multiplex-Panel für Erreger von Urogenitalinfektionen darstellen und kurz diskutieren.

Wie bei allen anderen Ringversuchen erfolgt die Anmeldung zu ausgewählten Teilen der Reihe „Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis (PCR/NAT)“ über die Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in Medizinischen Laboratorien (INSTAND e.V.), Düsseldorf (https://www.instand-ev.de). Nach Abschluss des jeweiligen Ringversuchs werden die Ergebnisse der einzelnen Teilnehmer dort zentral erfasst, und anhand von individuellen Bewertungskriterien werden die schriftlichen Zertifikate erstellt. Zusätzlich stehen für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe weiterer Informationen auch im Internet unter http://www.udo-reischl.de, Unterpunkt „INSTAND-Ringversuche (PCR/NAT)“, sowie auf der Webseite von INSTAND e.V. als pdf-Files zum freien Download bereit.

Alle Teilnehmer sind natürlich weiterhin dazu aufgerufen, attraktive Parameter für eine zukünftige Erweiterung des Spektrums an Zielorganismen vorzuschlagen und deren mögliche Umsetzung mit dem Ringversuchsleiter zu diskutieren.

Für die externe Qualitätssicherung der zukünftig kommerziell verfügbaren (und damit wohl auch vermehrt eingesetzten) PCR/NAT-Multiplex-Nachweisverfahren für Urogenital-Infektionen haben wir seit Mai 2019 den neuen Ringversuch RV 547 „Urogenital-Panel“ routinemäßig etabliert, der vom Konzept her jeweils einige der nachfolgenden Erreger in unterschiedlichen Kombinationen und Mengen innerhalb des 4er-Panels enthält: Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis und ggf. Treponema pallidum.

Nach 19 Teilnehmern beim Pilotringversuch 2018 und 68 Teilnehmern im November 2019 haben sich diesmal bereits 71 Teilnehmer registriert. Wir werden uns nach Kräften bemühen, der deutlich steigenden Nachfrage auch bei den zukünftigen Ringversuchsrunden mit ausreichenden Mengen an geeignetem Probenmaterial nachkommen zu können.

Zusätzlich stehen für die früheren, für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe zusätzlicher Informationen (wie die graphisch dokumentierten Ergebnisse unserer quantitativen Realtime-PCR-Testsysteme oder die Ergebnisse einiger kommerzieller PCR-Testsysteme) auch unter der Internetadresse http://www.udo-reischl.de, Unterpunkt „Auswertung der Ringversuche“, und natürlich auch über die Webseite von INSTAND e.V. (https://www.instand-ev.de) als pdf-Dateien zum freien Download bereit.

Vorab noch eine Anmerkung zu den statistisch ermittelten und in den jeweiligen Tabellen 3 aufgeführten Leistungsdaten von kommerziellen PCR/NAT-Testsystemen. Auffällig bei vielen der aktuellen aber auch bei einigen der früheren Ringversuche ist das unterschiedlich gute Abschneiden von Teilnehmern mit ein und denselben kommerziellen, vorkonfektionierten und teilweise auch automatisierten und/oder kartuschenartig geschlossenen Testsystemen.

Die meisten dieser Assays sind zudem auch noch IVD-zertifiziert – mit allen aufwändigen herstellerseitigen Vorkehrungen zur möglichst zuverlässigen Durchführung und standardisierten Ergebnisinterpretation. Die auffällige „Streuung der Performance“ (bzw. das Auftreten einzelner Ausreißer) unterstreicht umso mehr die Bedeutung der aktuell vorgegebenen Qualitätsstandards, wie beispielsweise das regelmäßige Mitführen von geeigneten Extraktions-, Positiv- und Negativ-Kontrollen sowie Schulungen und kontrollierte Maßnahmen zur Vermeidung von exogenen Kontaminationsmöglichkeiten in PCR/NAT-Arbeitsbereichen, die u.a. im Rahmen der aktuellen RiLiBÄK, der Akkreditierung und der praxisorientiert verfassten MIQ-1 gefordert werden. Deren Sinnhaftigkeit und Stringenz mag aus Anwendersicht ja gelegentlich bezweifelt werden, wird aber in diesen Ringversuchsrunden (sozusagen von neutraler Warte aus) dennoch immer wieder aufs Neue bestätigt.

Neben den überaus motivierten und engagierten Mitarbeitern der verschiedenen Sollwert-Laboratorien unterstützen uns bei der Konzeption und Auswertung der zahlreichen Ringversuche zum Bakterien- und Pilzgenomnachweis PCR/NAT noch zahlreiche Kolleginnen und Kollegen aus unserem Hause. Allerherzlichsten Dank für ihre spontane Bereitschaft sowie ihr ehrenamtliches Engagement für unsere gemeinsamen Bemühungen zur externen Qualitätssicherung molekularbiologischer Nachweisverfahren in der infektiologischen Diagnostik.

Entsprechend des Grundgedankens unserer Ringversuchsaktivitäten wurde auch bei der Konzeption des aktuellen Ringversuchs zum „Bakteriengenomnachweis mittels PCR oder anderer Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT)“ bei einigen Zielorganismen der Versand von Proben mit relativ niedrigen Erregerzahlen angestrebt. In den aktuellen Ringversuchssets befanden sich daher erneut einige Proben mit einer relativ geringen Menge an den folgenden Zielorganismen: Neisseria gonorrhoeae (Probe # 2025304), Chlamydia pneumoniae (Probe # 2025402), Helicobacter pylori (Probe # 2025334) sowie Mycoplasma pneumoniae (Probe # 2025413).

Im Rahmen der Testentwicklung bzw. Testoptimierung können diese Probensätze, u.a. als Qualitätskontrollen oder als standardisierte Sensitivitätsmarker, für die Austestung der unteren Nachweisgrenze von eigenentwickelten Nukleinsäure-gestützten Testsystemen dienen. An dieser Stelle möchten wir auch darauf hinweisen, dass zahlreiche Rückstell-Probensätze der früheren Ringversuche noch verfügbar sind, und bei Bedarf über den Ringversuchsleiter formlos nachbestellt werden können.

Mit Ausnahme der zuvor erwähnten „grenzwertig-positiven“ Einzelproben wurden die Mengen der entsprechenden Zielorganismen in den Probensätzen der aktuellen Ringversuchsrunde wieder relativ deutlich über der Nachweisgrenze von „durchschnittlich sensitiven PCR/NAT-Testkonzepten“ eingestellt. Diese definieren wir wie folgt: als Richtwert für die Bewertung von Ringversuchsergebnissen gilt das 10- bis 50-fache der unteren Nachweisgrenze durchschnittlich sensitiver PCR-Protokolle unter Standardbedingungen (z.B. 50 µl Block-Cycler Reaktionsansätze, 35 PCR-Zyklen, ggf. entsprechende Realtime-PCR-Protokolle; gut evaluierte Primersequenzen).

Auch im Rahmen des hier diskutierten Ringversuchs waren wieder einige Auffälligkeiten hinsichtlich der Spezifität und Sensitivität von bestimmten Testkonzepten und der für den Nachweis verwendeten Zielsequenzen zu beobachten. Diese Aspekte sind bei der Auswertung des jeweiligen Ringversuchs aufgeführt und dort auch kurz diskutiert.

So wurde beispielsweise im aktuellen RV 539 MRSA/cMRSA eine der vier Proben mit einem MRSA-Patientenisolat versetzt, das zwar alle PCR-detektionsrelevanten Segmente der SCCmec-Genkassette enthielt, dem aber auf Genomebene der bei Staphylococcus aureus-Stämmen „übliche“ Speziesmarker pSA442 fehlte. Erfreulicherweise konnte diese eher untypische MRSA-Variante in der aktuellen Ringversuchsrunde von nahezu 90% aller Teilnehmer mit ihren MRSA-spezifischen PCR-Testsystemen erfasst und korrekt als MRSA befundet werden. Die methodischen Limitationen aufgrund der Sequenzvielfalt bei bestimmten Speziesmarker- und resistenzvermittelnden Genen bestätigt jedoch erneut die Sinnhaftigkeit und auch Notwendigkeit des im Rahmen der PCR/NAT-Ringversuchsdiskussionen bereits mehrfach thematisierten begleitenden kulturellen Nachweises von MRSA.

Interessant war auch die Ergebniskonstellation des Borrelia burgdorferi-Panels im aktuellen RV 535. Neben zwei „normalen“ Borrelia valaisiana- und Borrelia garinii-Isolaten wurde auch die derzeit selten beobachtete Spezies Borrelia hispanica ausgesandt. Diese Spezies, die früher auch Spirochaeta hispanica genannt wurde und als Erreger des spanischen Rückfallfiebers bzw. Zeckenrückfallfiebers gilt, wurde im aktuellen Ringversuch von ca. 15% der Teilnehmer fälschlicherweise als PCR/NAT-positiv für B. burgdorferi sensu lato getestet und befundet.

In jeweils einer der 4 Einzelproben der aktuellen Ringversuche RV 530: CT/GO, RV 533: Helicobacter pylori und RV 541: Mycoplasma pneumoniae befanden sich diesmal relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen. Erfreulicherweise bereitete der zuverlässige PCR-gestützte Nachweis dem Großteil unserer Teilnehmer (bzw. den von ihnen eingesetzten Testsystemen) keine nennenswerten Probleme.

Mit der Auswahl eines etwas breiteren Spektrums von relevanten Carbapenemase-Genen bestätigte sich im Rahmen des Ringversuchs RV 544: Carbapenemase-Gene erneut die Vermutung, dass viele der derzeit verwendeten kommerziellen sowie Inhouse-Testsysteme zur molekularen Carbapenemase-Detektion noch gewisse Lücken hinsichtlich der Abdeckung von unterschiedlichen Carbapenemase-Genen aufweisen. Im aktuellen Ringversuch scheint dies insbesondere für die Carbapenemase GES-5 zu gelten, die plasmidcodiert ist, üblicherweise in Acinetobacter spp. gefunden wird, und deren Nachweisrate in den letzten Jahren auch bei anderen Enterobacterales wie auch in Pseudomonas aeruginosa zugenommen hat. Das Isolat aus dem Enterobacter freundii-Komplex mit GES-5-Gen wurde aktuell lediglich von 21 der insgesamt 80 Teilnehmer detektiert und als solches befundet. Im Umfeld der molekularen Testung von Carbapenemase-Genen unterstützt uns Frau Dr. Agnes Anders vom NRZ für gramnegative Krankenhauserreger weiterhin bei der Auswahl von relevanten „interessanten“ klinischen Isolaten.

In bewährter Form werden im Folgenden die Ergebnisse der jeweiligen erregerspezifischen Ringversuche dargestellt. Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1]) zeigt dabei die Probenzusammensetzung und das erwartete Ergebnis (Sollwert) mit den entsprechenden Codenummern der Ergebnisbögen. Die von den einzelnen Teilnehmern mitgeteilten Ergebnisse werden in Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1]) nach der Häufigkeit der Mitteilung von positiven oder negativen Ergebnissen, und in Tabelle 3 (Anhang 1 [Anh. 1]) nach der absoluten Anzahl der richtig-positiven und richtig-negativen Ergebnisse sowie derem prozentualem Anteil (Befundhäufigkeit) je Amplifikationssystem bzw. Testkonzept aufgeschlüsselt.

Für die objektive Bewertung von kommerziellen Testsystemen sollten neben der rein statistischen Betrachtung der mitgeteilten Ringversuchsergebnisse auch die Anzahl und vor allem die methodische bzw. technische Qualifikation der individuellen Teilnehmer berücksichtigt werden. Da wir im Zuge unserer Ringversuche aber das gesamte Spektrum von spezialisierten Expertenlabors bis hin zum „Gelegenheitsanwender“ abdecken, müssen die arithmetisch ermittelten Richtigkeitsquoten bei der Bewertung einzelner Testsysteme immer mit einem gewissen Toleranzbereich betrachtet werden.

Bei den meisten Probenmaterialien der aktuellen Ringversuchsrunde stellen falsch-negative Ergebnisse damit einen deutlichen Hinweis auf ernstzunehmende Mängel innerhalb der eingesetzten Verfahren zur Nukleinsäure-Extraktion, Amplifikation und Detektion dar.

Falsch-positive Ergebnisse sind dagegen in der Regel als Hinweis auf eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion bzw. -abarbeitung und/oder auf mangelnde Spezifität der eingesetzten Testsysteme zu betrachten.

Die Ergebnislage des aktuellen Ringversuchs deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus vorangegangenen Ringversuchen zum kombinierten NAT-gestützten C. trachomatis und Gonokokken-Nachweis. Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthält drei Proben mit C. trachomatis-Organismen: Probe # 2025303 und # 2025302 mit ~5x10⁴ IFU/mL und Probe # 2025304 mit ~5x10³ IFU/mL. Diesmal waren ebenfalls 3 der 4 Einzelproben mit unterschiedlichen Mengen an Gonokokken versetzt: Probe # 2025303 mit ~5x10⁴ CFU/mL, Probe # 2025301 mit ~5x10³ CFU/mL und Probe # 2025304 mit ~5x10² CFU/mL N. gonorrhoeae-Zielorganismen.

Der Übersichtlichkeit halber stellen wir bei diesem kombinierten Ringversuch (CT/NG) die Ergebniskonstellation in 5 getrennten Tabellen dar (Anhang 1 [Anh. 1], S. 1–3). Damit wird die diagnostische Performance der jeweiligen Testsysteme beim Nachweis von CT und NG aussagekräftiger (Tabelle 2, Anhang 1 [Anh. 1], S. 1: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei CT; Tabelle 4, Anhang 1 [Anh. 1], S. 2: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei NG; jeweils gefolgt von den Richtigkeitsquoten nach aufgeführten Testsystemen in den Tabellen 3 und 5, Anhang 1 [Anh. 1], S. 2–3).

Auch wenn die etwas schwächer positive Probe # 2025304 des aktuellen Ringversuchs nur mit ca. 5x10³ IFU/mL an C. trachomatis-Zielorganismen versetzt worden war, fanden sich unter den von insgesamt 239 Teilnehmern mitgeteilten NAT-Ergebnissen für C. trachomatis diesmal nahezu durchweg richtig-positive Ergebnisse. Bei den beiden ca. 5- und 10-fach stärker CT-positiven Proben # 2025302 und # 2025303 des aktuellen Probensets wurden ebenfalls von nahezu allen Teilnehmern richtig-positive Ergebnisse beobachtet. Lediglich ein Teilnehmer berichtete bei der Probe # 2025303 ein falsch-negatives Ergebnis, und ein Teilnehmer klassifizierte sein Ergebnis für die Probe # 2025303 als „fraglich“. Für die C. trachomatis-negative Probe # 2025301 wurden aus dem gesamten Teilnehmerfeld ebenfalls nur 3 falsch-positive Ergebnisse berichtet. Da in der aktuellen Ringversuchsrunde von einem Großteil der Anwender mit den unterschiedlichsten Testsystemen durchweg korrekte Ergebnisse berichtet wurden, handelt es sich bei dem falsch-negativen und den drei falsch-positiven Ergebnissen vermutlich um ringversuchstypische „sporadische Ausreißer“.

Im Rahmen des NAT-gestützten Gonokokken-Nachweises wurden für die drei positiven Proben # 2025301, # 2025303 und # 2025304 (N. gonorrhoeae; ca. 5x10³, ca. 5x10⁴ und ca. 5x10² CFU/mL) diesmal von den insgesamt 239 Teilnehmern 12 falsch-negative Ergebnisse für Gonokokken-DNA bei der relativ schwach positiven Probe # 2025304 sowie 4 falsch-negative Ergebnisse für Gonokokken-DNA bei Probe # 2015301 und bei der deutlich stärker positiven Probe # 2015303 mitgeteilt. Bei der GO-negativen Probe # 2025302 wurden von 3 der insgesamt 237 Teilnehmer falsch-positive Ergebnisse berichtet.

Dieser im Vergleich zu früheren Ringversuchsrunden doch überraschend hohe Anteil an falsch-positiven Ergebnissen deutet auf Kontaminationsereignisse oder wie auch immer geartete Template-Nukleinsäure-Verschleppungen bei der Probenaufbereitung und -abarbeitung hin; vor allem, weil im aktuellen 4er-Set die GO-negative Probe # 2025302 bei sequenzieller Abarbeitung unmittelbar auf eine der GO-positiven Proben folgte. Den betroffenen Laboratorien sollten diese Ergebnisse Anlass geben, ihren individuellen diagnostischen Workflow hinsichtlich der Kontaminationssicherheit während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik zu überprüfen und gegebenenfalls zu optimieren.

Angesichts der mit 5x10² CFU/mL doch relativ geringen Menge an Zielorganismen wurden die negativen PCR/NAT-Ergebnisse bei der GO-positiven Probe # 2025304 diesmal bei der Erstellung der Zertifikate nicht als „falsch-negativ“ gewertet.

Bei der GO-positiven Probe # 2025303 sollten falsch-negative oder als „fraglich“ klassifizierte Ergebnisse bei betroffenen Ringversuchsteilnehmern jedoch Anlass zur Optimierung ihrer jeweiligen spezifischen PCR/NAT-gestützten Testsysteme geben.

Da die beobachteten „Sensitivitätsprobleme“ diesmal jedoch nur relativ marginal ausfallen, sich offensichtlich nicht auf bestimmte Testkonzepte eingrenzen lassen und sporadisch durch das ganze Portfolio der eingesetzten Testsysteme gehen, kann dem großen Rest des Teilnehmerfeldes erneut eine erfreulich gute analytische Sensitivität und Spezifität ihrer CT- und GO-spezifischen NAT-Testsysteme sowie der angewandten Prozeduren zur Probenaufarbeitung und -prozessierung attestiert werden. Angesichts der streng normierten und standardisierten Abarbeitungsprotokolle von kommerziellen Testsystemen scheint es für den Ringversuchsleiter jedes Mal aufs Neue nicht verwunderlich, dass ein nennenswerter Anteil der teilnehmenden Laboratorien mit den betroffenen Testsystemen erfolgreich die vorgegebenen Zielwerte erreicht. Ohne denjenigen Teilnehmern, die mit bestimmten kommerziellen Testsystemen die Zielwerte nicht erreichen, zu nahe treten zu wollen, deutet dieser Umstand in diesen Fällen dann wohl eher auf individuelle Abweichungen vom Protokoll oder bestimmte Fehler bei der Probenabarbeitung als auf intrinsische Unzulänglichkeiten der in der Regel gut evaluierten Testsysteme hin.

Auch wenn mit ca. 5x10² CFU/mL an Zielorganismen im Probenmaterial der Probe # 2025303 die untere Nachweisgrenze hochsensitiver und standardisierter PCR/NAT-gestützter Testsysteme noch nicht erreicht oder unterschritten sein sollte, stehen mit den Rückstellproben des Ringversuchs RV 530 vom November 2020 den Teilnehmern mit hohem Anspruch an die individuelle Testsensitivität wieder geeignete Sets zur Überprüfung und Optimierung ihrer jeweiligen NAT-gestützten Testsysteme zur Verfügung.

Ich glaube, es ist auch für den Leser dieser Ringversuchsdiskussion weitgehend nachvollziehbar, dass wir als Organisatoren von Testkonzept- und Testplattform-übergreifenden Ringversuchen bei der Konfektionierung unserer Probenmaterialien leider nicht jede Besonderheit im Abarbeitungsprotokoll von kommerziellen Testsystemen berücksichtigen oder unterschiedliche Arten von Ringversuchsprobenmaterial für bestimmte Testsysteme bereitstellen können.

Auf diesen Umstand wurde bereits bei früheren Ringversuchen mehrfach im Zusammenhang mit den RNA-Zielsequenzen der Hologic APTIMA COMBO 2 Testkits hingewiesen. Werden von Teilnehmern bestimmte NAT-Testsysteme eingesetzt, die erregerspezifische RNA-Zielsequenzen nachweisen oder auf einem RNA-basierten Amplifikationsprozess (TMA, Transcription-Mediated Amplification, o.ä.) beruhen, so kann mit dem hier versandten Probenmaterial offiziell keine regelgerechte Abprüfung der entsprechenden Sensitivitäten unter Routinebedingungen gewährleistet werden. Aber selbst wenn das Herstellungsverfahren unserer Ringversuchsproben primär nicht auf die Stabilisierung von RNA-Molekülen hin optimiert und getestet wurde, so konnten dennoch sowohl bei der aktuellen wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchsrunden von vielen Teilnehmern mit RNA-gestützten Testsystemen hohe Richtigkeitsquoten erzielt werden.

Aktuell wurden die C. trachomatis-Zielorganismen von allen 11 Teilnehmern mit RNA-basierten Hologic-Testsystemen in den drei CT-positiven Proben erfolgreich nachgewiesen. Auch in den stärker GO-positiven Proben # 2025301 und # 2025303 gelang nahezu allen Teilnehmern mit RNA-basierten Hologic-Testsystemen der erfolgreiche Nachweis der Neisseria gonorrhoeae-Zielorganismen. Nur bei der sehr schwach GO-positiven Probe # 2025304 (in der zusätzlich noch nennenswerte Mengen an C. trachomatis enthalten waren) versagte der Nachweis bei Teilnehmern mit RNA-basierten Testsystemen. Da bei der Erteilung der Zertifikate ja bekanntermaßen ein falsches Ergebnis innerhalb der bewerteten Ergebnisse toleriert wird und zudem die Probe # 2025304 nicht mit in die Bewertung einging, werden diesmal alle 11 Teilnehmer die entsprechenden Zertifikate ausgestellt bekommen.

Entsprechende Inhibitionskontrollen wurden von nahezu allen der insgesamt 239 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal nicht mitgeteilt.

Bei den ermittelten Richtigkeitsquoten für Teilnehmer mit den kommerziellen CT/NG-spezifischen PCR/NAT-Assays von Hologic, Seegene, Bruker-Hain, BD, Roche, Abbott, Mikrogen, TIB Molbiol oder anderen in den entsprechenden Tabellen 3 und 5 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 2–3) aufgeführten Testsystemen wird erneut eindrucksvoll deutlich, dass mit dem Großteil dieser kombinierten Testsysteme insgesamt erfreulich hohe Richtigkeitsquoten sowohl für die positiven als auch für die negativen Ergebnisse beobachtet werden konnten.

Anmerkung: Bevor durch einen kurzen Blick auf die prozentualen Richtigkeitsquoten in diesen Tabellen ein eventuell etwas zu voreiliger Rückschluss auf die diagnostische „Performance“" bestimmter kommerzieller Testsysteme gezogen wird, sollten erst die effektiven Teilnehmerzahlen berücksichtigt werden, die den dargestellten Richtigkeitsquoten arithmetisch zugrunde liegen.

Im Kommentarfeld der Ergebnisformulare wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: BD ProbeTec (4x), GeneProof C. trachomatis und N. gonorrhoeae (3x), Qiagen artus CT/NG QS-RGQ Kit (3x), AID RDB 2110 STD (2x), AID RDB 2335 STI (1x), Abbott Alinity m STI Assay (2x), Amplex eazyplex STD complete (2x), Seegene Anyplex II STI-7 Detection (2x), BIORON diagnostics RealLine C. trachomatis/N. gonorrhoeae (2x), EUROIMMUN EUROArray STI (4x), SIEMENS VERSANT kPCR CT/GC (1x), Diagenode S-DiaCTNG/S-DiaCT/S-DiaGono (1x), Goffin Presto CT/NG Assay (1x), AusDiagnostics Urinogenital and Resistance (1x), Anatolia Gene works (1x), AmpliSens C. trachomatis/N. gonorrhoeae-screen FRT PCR kit (1x) und AB Analytica (1x).

Unabhängig von der Art des verwendeten Testsystems soll in diesem Zusammenhang auch noch einmal darauf hingewiesen werden, dass in Gegenwart von relativ hohen Mengen an Zielorganismen (bzw. deren Nukleinsäure) die interne Kontrollreaktion aufgrund der „Konkurrenzsituation“ mit der Amplifikation der eigentlichen Zielsequenz durchaus negativ ausfallen kann, obwohl keine Inhibition der PCR-Reaktion im eigentlichen Sinne vorliegt.

Bei kombinierten Testsystemen (Stichwort: Multiplex-PCR) kann ja bekanntlich auch die Gegenwart des einen Erregers oder Zielorganismus in hoher Menge die Nachweisempfindlichkeit für den gleichzeitigen Nachweis des/der anderen Erreger oder Zielorganismen im Multiplex-Reaktionsansatz negativ beeinflussen. Bei bestimmten suboptimal abgestimmten PCR/NAT-Testsystemen könnte die kombinierte Zusammensetzung der positiven Proben des aktuellen Ringversuchs eine solche Problemkonstellation repräsentieren und in der Konsequenz die etwas schlechteren Richtigkeitsquoten für den Gonokokken-DNA-Nachweis erklären.

Das Probenset des aktuellen Ringversuchs enthielt diesmal zwei Proben mit ca. 5x10⁴ IFU/mL an C. trachomatis (# 2025313 und # 2025311), eine Probe mit ca. 5x10³ IFU/mL an C. trachomatis (# 2025312), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 2025314), die ausschließlich nicht infizierte Zellen und Escherichia coli enthielt.

Wie Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 4) der statistischen Auswertung zu entnehmen ist, wurden von den insgesamt 51 Teilnehmern bei allen drei positiven Proben (# 2025311, # 2025312 und # 2025313) diesmal durchweg korrekte Ergebnisse mitgeteilt. Auch bei der C. trachomatis-negativen Probe # 2025314 wurden diesmal von allen Teilnehmern durchweg richtig-negative Ergebnisse berichtet.

Die markante Übereinstimmung der aktuellen Ergebniskonstellation mit den Beobachtungen und hervorragenden Richtigkeitsquoten vorhergegangener Ringversuche mit ähnlicher Menge an C. trachomatis-Zielorganismen kann erneut als Beleg für eine hohe Zuverlässigkeit und Konstanz der eingesetzten Testsysteme sowie der aktuellen Kits und automatisierten Testplattformen zur Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Prozessierung angesehen werden.

Inhibitionskontrollen wurden von allen 51 Teilnehmern durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal nicht mitgeteilt. In diesem Zusammenhang sei kurz angemerkt, dass wir auch im aktuellen Ringversuch keine der Einzelproben absichtlich mit inhibitorischen Substanzen versetzt haben. Trotz der relativ geringen Menge an Zielorganismen bewegten sich die Richtigkeitsquoten dabei durchweg auf erfreulich hohem Niveau.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurden hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die folgenden Testsysteme aufgeführt: EUROIMMUN EUROArray STI (2x), HOLOGIC Aptima Combo 2 assay CT (2x), Roche COBAS 4800 CT (1x), Roche COBAS 6800 CT (1x), Diagenode S-DiaCT (1x), Qiagen artus CT (1x), Abbott RealTime CT (1x), AID RDB 2110 STD (1x), Sansure Biotech (1x), Sacace Biotechnologies C. trachomatis Real-TM (1x), Seegene Allplex CT/NG/MG/TV Assay (1x) und Seegene Allplex STI Essential (1x).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt zwei positive Proben mit einer sehr hohen und einer etwa 10-fach geringeren Menge an Zielorganismen (# 2025321 mit 5x10⁵ CFU/mL und # 2025324 mit 5x10⁴ CFU/mL an B. pertussis), sowie eine Probe mit einem klinischen Isolat von Bordetella holmesii als verwandte Spezies (# 2025323 mit 5x10⁴ CFU/mL). Die Probe # 2025322 enthielt diesmal keine Zielorganismen, sondern lediglich E. coli und eine Suspension aus humanem Zellmaterial.

Die Verfügbarkeit von offensichtlich inzwischen sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesystemen für den Nachweis von Bordetella pertussis-DNA führte diesmal erneut sowohl bei den positiven als auch bei den negativen Proben zu relativ hohen Richtigkeitsquoten.

Der spezifische Nachweis von Bordetella pertussis-DNA in den beiden Proben # 2025322 und # 2025324 bereitete den insgesamt 146 Teilnehmern offenbar keine allzu großen Schwierigkeiten. Lediglich von einem Teilnehmer wurde hier ein falsch-negatives Ergebnis für die Probe # 2025321 berichtet, und je ein Teilnehmer beobachtete bei Probe # 2025324 ein falsch-negatives Ergebnis bzw. klassifizierte seinen Befund als „fraglich“. Für die negative Probe # 2025322 des aktuellen Sets wurden ebenfalls überwiegend korrekt-negative Ergebnisse mitgeteilt. Lediglich 2 der insgesamt 146 Teilnehmer beobachteten mit ihren B. pertussis-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen hier ein falsch-positives Ergebnis, was eventuell mit Kreuzkontaminationen oder wie auch immer gearteten Template-Nukleinsäure-Verschleppungen bei der Probenabarbeitung erklärbar sein könnte.

Im RV 532 befand sich diesmal wieder ein IS481-positives Bordetella holmesii-Isolat, das (Methoden- bzw. Zielsequenz-bedingt) mit vielen der B. pertussis-spezifischen NAT-Testsysteme kreuzreagierte. Diese Problematik spiegelt sich beispielsweise in einer Veröffentlichung aus Frankreich wider [1]. Insgesamt betrachtet scheint aber der Vorteil einer hochsensitiven Detektion von B. pertussis und B. holmesii über die Verwendung der repetitiven IS481-Zielsequenz die Nachteile einer (eher aus akademischer Sicht wünschenswerten) Differenzierungsmöglichkeit zwischen den beiden Spezies in der PCR-Routinediagnostik mehr als aufzuwiegen. Zudem scheint in unseren Breiten B. holmesii eher selten aufzutreten [2] und Infektionen mit beiden Spezies scheinen eine gleichermaßen „behandlungsbedürftige“ Symptomatik hervorzurufen. Eine Abgrenzung zu den übrigen (IS481-negativen) Bordetella-Spezies muss jedoch aus diagnostischer Sicht stets gewährleistet sein. Angesichts der sehr hohen Richtigkeitsquote für die beiden B. pertussis-positiven Proben und der technisch bzw. methodisch bei der Verwendung der IS481-Zielsequenz zu erwartenden Kreuzreaktion mit dem aktuellen B. holmesii-Isolat in Probe # 2025323 haben wir uns (wie auch bei vergleichbaren Konstellationen in vorhergegangenen Ringversuchsrunden) dazu entschlossen, bei der Erteilung der Zertifikate die falsch-positiven Ergebnisse bei B. holmesii nicht als falsch zu bewerten. Dies ist u.a. an der grauen Schraffierung aller 3 Felder in Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 5) zu erkennen.

Die 2 Teilnehmer mit falsch-positivem Ergebnis bei der B. pertussis-negativen Probe # 2025322 sollten jedoch intensiv daran arbeiten, die Kontaminationssicherheit und/oder die analytische Spezifität ihrer jeweiligen Testsysteme zu verbessern. Inhibitionskontrollen wurden von 145 der insgesamt 146 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden bei dem aktuellen Probenset bei keinem der Teilnehmer innerhalb der jeweils ausgesandten vier Einzelproben beobachtet.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: AmpliGnost B. pertussis/B. parapertussis (3x), Altona diagnostics RealStar Anthrax (3x), Luminex ARIES Bordetella Assay (2x), ARGENE Bordetella r-gene (2x), AID RDB 2200 B. pertussis (1x), Diagenode R-DiaBorM (1x), AusDiagnostics (1x), PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x), VIASURE Bordetella Real Time PCR Detection Kit (1x), DiaSorin (1x), BioFire FILMARRAY Respiratory Panel 2.1plus (1x), Bio-Speedy Real-Time PCR Detection Kit (1x), Master diagnostica (1x) und Gerbion Diarella Bordetella (1x).

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 7) dargestellt, enthielt Probe # 2025331 des aktuellen Ringversuchs eine relativ hohe Menge an Clarithromycin-resistenten H. pylori-Zielorganismen (~1x10⁵ CFU/mL). Probe # 2025333 und # 2025334 enthielten eine Kultursuspension der Spezies Helicobacter salomonis (~5x10⁴ CFU/mL) und Probe # 2025334 eine Mischung aus Helicobacter acinonyx (~5x10⁴ CFU/mL) und einer kleinen Menge an Clarithromycin-sensiblen H. pylori (~1x10³ CFU/mL). Probe # 2025332 enthielt ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli.

Erfreulicherweise wurden sowohl die mit einer relativ hohen Menge an H. pylori-Zielorganismen versetzte Probe (# 2025331) als auch die negative Probe # 2025332 nahezu von allen der insgesamt 45 Teilnehmer korrekt befundet. Wie bereits in den letzten Ringversuchen zeigte sich erneut die Verfügbarkeit gut evaluierter NAT-gestützter Analysesysteme mit hoher analytischer Sensitivität. Im aktuellen Ringversuch wurde zudem die analytische Spezifität der verwendeten Testsysteme durch die Probe # 2025333 überprüft, welche mit Helicobacter salomonis (~5x10⁴ CFU/mL) eine „non-pylori“-Helicobacter-Spezies enthielt. Für diese Probe wurden 5 falsch-positive Ergebnisse berichtet, wobei diese bei betroffenen Anwendern zum Anlass genommen werden sollten, die Speziesspezifität der jeweils eingesetzten PCR/NAT-Testsysteme zu überprüfen.

Probe # 2025334 enthielt diesmal eine entsprechend verdünnte Kultursuspension der „on-pylori“-Spezies Helicobacter acinonyx (mittlerweile auch bekannt als H. acinonychis). Nach der erstmaligen Anzucht dieser Spezies aus Magenbiopsien eines vermutlich daran verstorbenen Tigers und Erstbeschreibung im Jahre 1998 wurde die Kultur in unsere Stammsammlung eingepflegt. Offenbar wurde die damalige Reinkultur trotz sorgfältigster mikrobiologischer Arbeitsweise innerhalb der letzten 20 Jahre mit Spuren eines H. pylori-Isolats kontaminiert, das im Rahmen unserer zahlreichen PCR-Untersuchungen bei der Ringversuchsproben-Konfektionierung überraschend auftauchte und sich als solches charakterisieren ließ. Trotz seines relativ geringen Anteils neben deutlich höheren Mengen an H. acinonyx konnte es dennoch von 37 der insgesamt 45 Ringversuchsteilnehmer in der Probe # 2025334 nachgewiesen werden.

Inhibitionskontrollen wurden von allen 45 Teilnehmern durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden dabei nicht beobachtet oder berichtet.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: MOBIDIAG Amplidiag H. pylori + ClariR (1x) und Sacace Biotechnologies H. pylori Real-TM (1x).

Wie in der Testbeschreibung des RV 533 vermerkt, konnten die Teilnehmer auf freiwilliger Basis auch die vermeintliche Clarithromycin-Resistenz der untersuchten H. pylori-Isolate mitteilen. Diese Spezialuntersuchung zur molekularbiologischen Resistenztestung erfolgt in der Regel über die Amplifikation und Sequenzierung von charakteristischen Bereichen, innerhalb der H. pylori 23S rDNA bzw. der Sequenzanalyse dieses Genombereichs, mittels Hybridisierungssonden. Ergebnisse wurden hier von 42 der insgesamt 45 Teilnehmer mitgeteilt, und mit Ausnahme eines der mitgeteilten Ergebnisse war die molekulare Resistenztestung auch durchweg korrekt.

Wie auch bereits bei den vorhergegangenen Runden dieses Ringversuchs mehrfach diskutiert, besteht die eigentliche Herausforderung bei dem Nukleinsäure-gestützten Nachweis von EHEC/STEC prinzipiell nicht so sehr im Nachweis sehr geringer Mengen an Zielorganismen, sondern vielmehr in der differenzierten Analyse und der Typisierung unterschiedlicher Shiga-Toxin-Gene und anderer putativer Pathogenitätsfaktoren (wie das für Intimin kodierende eae-Gen oder das für Enterohämolysin kodierende hlyA-Gen).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt daher zwei gleiche und relativ starke EHEC-positive Proben: mit ca. 5x10⁴ CFU/mL # 2025342 und mit ca. 1x10⁴ CFU/mL # 2025343 (E. coli, stx₁-, stx₂-, eae-, hlyA- und O157-positiv) und eine Probe mit ~10⁴ CFU/mL eines Shigella sonnei-Isolats (# 2025341). Probe # 2025344 enthielt einen E. coli-Stamm (eae-, hlyA-negativ).

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs waren keine „exotischen“ Shiga-Toxin-Gene vertreten, sodass, begründet auf die Verfügbarkeit von mittlerweile bestens etablierten PCR/NAT-gestützten Testsystemen und molekularbiologischen Differenzierungsstrategien für EHEC, bei allen Proben durchweg hohe Richtigkeitsquoten – sowohl für positive als auch für negative Befunde – beobachtet werden konnten. Bei den beiden EHEC-positiven Proben # 2025342 und # 2025343 wurden von 126 bzw. 125 der insgesamt 127 Teilnehmer richtig-positive EHEC-Befunde berichtet. Bei der positiven Probe # 2025342 wurden lediglich von einem Teilnehmer und bei der positiven Probe # 2025343 von 2 Teilnehmern falsch-negative PCR-Ergebnisse für EHEC/STEC beobachtet. Auch die Probe # 2025344 (E. coli K12-Stamm, eae-, hlyA-negativ) wurde von allen Teilnehmern bis auf zwei korrekterweise als negativ befundet.

Eine der vier Proben (# 2025341) war diesmal mit einer nennenswerten Menge an Shigella sonnei (~1x10⁴ CFU/mL) versetzt und auch hier wurden von 119 der insgesamt 127 Teilnehmer negative PCR/NAT-Ergebnisse für EHEC/STEC beobachtet. Da in den meisten der teilnehmenden Laboratorien ein NAT-gestützter Nachweis von Shiga-Toxin-Genen im Umfeld der EHEC-Diagnostik primär als Kulturbestätigungstest eingesetzt wird, werden bei zukünftigen Ringversuchen auch die meisten der positiven Proben wieder relativ hohe Mengen an Zielorganismen enthalten, und der Schwerpunkt bleibt auf der Abprüfung der analytischen Spezifität der eingesetzten Testsysteme, und weniger auf der dabei erzielten unteren Nachweisgrenze.

Neben den traditionellen Inhouse-Testsystemen werden auch hier zunehmend vorkonfektionierte kommerzielle PCR/NAT-Assays eingesetzt. In Anbetracht der insgesamt relativ hohen Richtigkeitsquoten können aktuell keine großen Unterschiede innerhalb dieser Testkonzepte ausgemacht werden.

Zudem wurden von 108 Teilnehmern die Ergebnisse der molekulargenetischen Shiga-Toxin-Subtypisierung sowie des gezielten Nachweises von Intimin (eae)- und/oder Enterohämolysin (hlyA)-Genen mitgeteilt. Wenn auch die Typisierung nicht immer vollständig durchgeführt wurde, so waren diese Angaben zur Typisierung, zumindest in dem mitgeteilten Umfang, großteils korrekt. Lediglich von zwei Teilnehmern wurden in der aktuellen Ringversuchsrunde falsche Ergebnisse für die Feintypisierung berichtet.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: BD MAX Enteric Bacterial Panel (3x), Amplex eazyplex EHEC basic (2x), BioMerieux BioFire GI Panel (2x), Seegene Allplex GI-EB Screening (2x), Seegene Seeplex Diarrhea-B1 (1x), AmpliSens Escherichiosis FRT PCR kit (1x), Altona diagnostic RealStar EHEC PCR Kit (1x), MIKROGEN ampliCube Gastrointestinal Bacterial Panel 2 (1x), AmpliGnost Verotoxin 1/2 (Differenzierung) PCR Kit (1x) und Fast Track DIAGNOSTICS FTD Bacterial gastroenteritis (1x).

Nachdem die Probenauswahl des letzten Ringversuchs mehr auf die analytische Sensitivität der eingesetzten Testsysteme abzielte, wollten wir uns im aktuellen Ringversuch wieder einmal auf die Prüfung der analytischen Spezifität fokussieren. Daher wurden bei der Konzeption des Ringversuchs diesmal drei unterschiedliche Borrelien-Spezies an die Teilnehmer versandt. Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt jeweils eine Probe mit ca. 5x10⁴ Organismen/mL an Borrelia valaisiana (# 2025351), eine Probe mit ca. 5x10⁴ Organismen/mL an Borrelia garinii OspA Typ 3 (# 2025353) und eine Probe mit ca. 1x10⁵ Organismen/mL an Borrelia hispanica (# 2025354). Probe # 2025352 enthielt lediglich eine relativ hohe Menge an Treponema phagedenis (~10⁵ Organismen/mL).

Nochmals eine kurze Rekapitulation: Schon die Tatsache, dass mittlerweile mehr als 20 verschiedene dem B. burgdorferi sensu lato-Komplex zugehörige Spezies beschrieben sind, impliziert erhebliches Problempotenzial für den PCR-/NAT-gestützten Nachweis von B. burgdorferi. B. garinii ist eine seit Langem bekannte, gesichert humanpathogene Spezies, die weit verbreitet in Europa und Asien vorkommt und auch häufig bei disseminierten Infektionen gefunden wird. Für die vor mehr als 20 Jahren beschriebene B. valaisiana ist eine Humanpathogenität nicht gesichert. Obwohl diese Spezies regelmäßig in Ixodes-Zecken aus Europa und Asien nachweisbar ist, existiert bislang kein einziges Isolat aus Humanproben. Lediglich vereinzelte Nachweise dieser Spezies mittels PCR aus Humanmaterial schließen die Humanpathogenität nicht sicher aus.

Dagegen gilt die Borrelienspezies B. hispanica, die früher auch Spirochaeta hispanica genannt wurde, als Erreger des spanischen Rückfallfiebers bzw. Zeckenrückfallfiebers. Diese aktuell in Spanien und Nordafrika beheimatete Rückfallfieber-Borrelie wurde in jüngerer Zeit selten als Erreger humaner Erkrankungen nachgewiesen und ist bei uns nur von differentialdiagnostischer bzw. reisemedizinischer Bedeutung.

Einmal mehr muss in diesem Zusammenhang vor der nicht zu empfehlenden Untersuchung von Zecken, um daraus eine Therapieindikation abzuleiten, gewarnt werden: Abgesehen davon, dass die Studienlage keinen signifikanten Informationsgewinn für die Patientenversorgung erwarten lässt, sind diese Untersuchungen ohne weitergehende Identifikation der nachgewiesenen Spezies schlicht als gefährlich für den Patienten einzustufen, nicht zuletzt da die Angabe „B. burgdorferi s.l. nachgewiesen“ grundsätzlich auch nicht-humanpathogene Arten mit einschließt und somit unnötige und potenziell gefährliche therapeutische Interventionen nach sich zieht.

Nach dieser knappen Auffrischung zu den Ringversuchsergebnissen: Der zuverlässige Nachweis von Borrelia garinii in der Probe mit relativ hoher Erregerlast (# 2025353 mit ~5x10⁴ Organismen/mL) bereitete nahezu keinem der 98 Teilnehmer signifikante Probleme. Da hier von einem Großteil der Anwender mit den unterschiedlichsten Testsystemen durchweg korrekte Ergebnisse berichtet wurden, handelt es sich bei dem einen falsch-negativen Ergebnis vermutlich um einen ringversuchstypischen „sporadischen Ausreißer“.

Auch für die negative Probe # 2025352, die lediglich eine relativ hohe Menge an Treponema phagedenis enthielt, wurde diesmal von allen Teilnehmern ein korrekt-negatives PCR/NAT-Ergebnis berichtet. Für die beiden übrigen Proben # 2025351 (Borrelia valaisiana, 5x10⁴ Organismen/mL) und # 2025354 (Borrelia hispanica, 1x10⁵ Organismen/mL) wurden jedoch deutlich höhere Raten an falschen PCR/NAT-Ergebnissen beobachtet.

Die B. valaisiana-Zielorganismen konnten dabei nur von 91 der insgesamt 98 Teilnehmer mit ihren B. burgdorferi-spezifischen Testsystemen erkannt werden, und beim Vorliegen von nennenswerten Mengen an Borrelia hispanica lieferten die PCR/NAT-Testsysteme von 15 Teilnehmern offenbar ein (falsch-)positives Ergebnis für B. burgdorferi-DNA, und ein Teilnehmer klassifizierte seinen Befund als „fraglich“. Zumindest bei Probe # 2025351 (B. valaisiana) sollten falsch-negative Ergebnisse den betroffenen Teilnehmern Anlass zur gelegentlichen Überprüfung und Optimierung ihres jeweiligen NAT-gestützten Testsystems geben. Möglicherweise ist hier die Gesamtsensitivität des analytischen Workflows und/oder die Spezifität bzw. Abdeckung der unterschiedlichen Borrelien-Spezies des verwendeten PCR-NAT-Assays unzureichend.

Interne oder externe Inhibitionskontrollen wurden von nahezu allen Teilnehmern mitgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse der PCR-Reaktion wurden im Rahmen dieser Ringversuchsrunde von keinem Teilnehmer beobachtet.

Wie bei den vorhergehenden Ringversuchsrunden haben auch diesmal wieder ungefähr knapp die Hälfte der Teilnehmer selbstentwickelte (Inhouse-)Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von Borrelien-DNA verwendet, kommerzielle Testsysteme wurden von 54 der 98 Teilnehmer eingesetzt. Im Großen und Ganzen waren im Rahmen dieses Ringversuchs auch keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (Inhouse-)Testsystemen zu beobachten. Dennoch kann angemerkt werden, dass von den insgesamt 21 falsch-negativen bzw. falsch-positiven Ergebnissen für die Proben # 2025351 (B. valaisiana) und # 2025354 (B. hispanica) 14 davon durch Inhouse-Testsysteme generiert wurden. Gegebenenfalls sollte also die Sensitivität und/oder Spezifität mancher der hauseigenen Testsysteme überprüft werden.

Darüber hinaus wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: Qiagen artus Borrelia (2x), Ingenetix BactoReal B. burgdorferi (2x), Elisabeth Pharmacon EliGene Borrelia RT (1x), Attomol B. burgdorferi Realtime LT (1x), BIORON diagnostics RealLine B. burgdorferi (1x), Sacace Biotechnologies TBEV, B. burgdorferi, A. phagocytophilum, E. chaffeensis/E. muris Real-TM (1x), AID Zecken-Screening (1x), Master diagnostica Tick-borne bacterial flow chip (1x) und Immundiagnostik MutaPLEX Borrelia (1x).

Aus aktuellem Anlass hier erneut vorab ein kurzer Hinweis: Dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von PCR/NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Legionella pneumophila aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Er ist daher NICHT für die Abprüfung von immunologischen Direktnachweisverfahren wie L. pneumophila SG1 Urin-Antigen-Testen o.ä. geeignet. Einzelne Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets können daher typischerweise auch relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostischen Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von L. pneumophila-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 10) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei relativ stark positive Proben: Proben # 2025363 und # 2025364 mit einer großen Menge an Zielorganismen (L. pneumophila SG1, ~5x10⁵ CFU/mL) und Probe # 2025361 mit einer etwa hundertfach geringeren Menge an Zielorganismen (L. pneumophila SG1, ~1x10⁴ CFU/mL). Probe # 2025362 enthielt ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli.

Letztere Einzelprobe wurde erfreulicherweise von allen der insgesamt 109 Teilnehmer als negativ für Legionella pneumophila-DNA befundet.

Die relativ stark positiven Proben # 2025363 und # 2025364 mit ca. 5x10⁵ CFU/mL an Legionella pneumophila SG1 wurden von jeweils 107 Teilnehmern korrekterweise als positiv interpretiert. Die 2 falsch-negativen Ergebnisse bei beiden Proben beruhen vermutlich eher auf anwendungstechnischen Problemen als auf unzureichender analytischer Sensitivität. Die etwa 50-fach geringere Menge an Legionella pneumophila-Zielorganismen in Probe # 2025361 (ca. 1x10⁴ CFU/mL) konnte noch von 106 Teilnehmern korrekt als positiv identifiziert werden, allerdings wurden hier bereits 3 falsch-negative Ergebnisse berichtet. Der aktuelle Ringversuch und insbesondere ein falsch-negatives Ergebnis bei den relativ stark positiven Proben # 2025363 und # 2025364 sollten von den betroffenen Laboratorien dringend zum Anlass genommen werden, die analytische Sensitivität des verwendeten Testsystems kritisch zu hinterfragen und gegebenenfalls zu optimieren.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs kamen bei insgesamt 76 Teilnehmern kommerzielle NAT-Testsysteme für den Nachweis von L. pneumophila-DNA im Untersuchungsmaterial zum Einsatz.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: MIKROGEN ampliCube Respiratory Bacterial Panel 1 (6x), ARGENE Legio pneumo/Cc r-gene (3x), Diagenode R-DiaLeg (2x), Gerbion diarella Legionella real time PCR Kit TM (2x), BioGx auf BD Max (1x), Ingenetix Bacto Real L. pneumophila (2x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (2x), BioFire FILMARRAY Pneumonia Panel (2x), Luminex Respiratory Pathogen Panel Multiplex (2x), AID Community acquired pneumonia bacteria (1x), Fast Track Diagnostics FTD Bacterial pneumonia CAP (1x), Seegene Allplex PneumoBacter Assay (1x), AnDiatec Quidel L. pneumophila (1x), Eazyplex PneumoBug expert (1x), AmpliSens L. pneumophila FRT PCR kit (1x), r-Biopharm SureFast Legionella 3plex (1x), Bioeksen Bio-Speedy L. pneumophila Kit (1x) und PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine Probe mit einer sehr hohen Menge an Salmonella enterica Serovar typhimurium (# 2025371 mit ~5x10⁵ CFU/mL), eine Probe mit Salmonella enterica Serovar typhi (# 2025374 mit ~1x10⁵ CFU/mL), eine Probe mit Shigella sonnei (# 2025372 mit ~1x10⁵ CFU/mL) und eine Probe ohne Zielorganismen (# 2025373), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Die Verfügbarkeit von spezifischen und mittlerweile gut evaluierten selbstentwickelten bzw. kommerziellen NAT-gestützten Analysesystemen führte erfreulicherweise bei allen 4 Proben des Ringversuchssets zu sehr hohen Richtigkeitsquoten. Die Mitteilung von durchweg richtig-positiven und richtig-negativen Ergebnissen von allen 24 Teilnehmern der aktuellen Ringversuchsrunde vereinfacht die Diskussion erheblich. Diesmal war alles perfekt!

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: Seegene Allplex GI-EB Screening (2x), TIB Molbiol LightMix Salmonella (1x), MIKROGEN ampliCube Gastrointestinal Bacterial Panel 1 (1x) und BioMerieux BioFire GI Panel (1x).

In enger Abstimmung mit unserem Sollwert-Laboratorium am Bayerischen Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Oberschleißheim, werden wir weiterhin versuchen, ab und an ein etwas exotischeres Serovar von Salmonella enterica zu versenden und zumindest eine der 4 Proben mit einer relativ geringen Menge an Zielorganismen zu versetzen – auch wenn im Rahmen der gesetzlichen Vorschriften und/oder Richtlinien der einzelnen Fachgesellschaften derzeit noch keine genauen unteren Nachweisgrenzen für den NAT-gestützten Salmonellen-Nachweis festgelegt wurden.

Neben der wohl prominentesten Spezies Listeria monocytogenes sind auch eine Reihe weiterer Listerienspezies bekannt, für die inzwischen auch einige selbstentwickelte und kommerzielle NAT-gestützte Nachweisverfahren zur Verfügung stehen. Auch wenn diese Spezies (mit Ausnahme von L. ivanovii) zumeist nicht von humanpathogener Relevanz sind, werden wir uns bei der Konzeption des Probenmaterials für RV 538 vor allem zur Abprüfung der Spezifität individueller Testsysteme nicht nur auf L. monocytogenes beschränken. Daher werden gelegentlich auch andere Listerienspezies in der einen oder anderen Probe dieses Ringversuchs zu finden sein. Im aktuellen Ringversuch wurde jedoch eine Art Verdünnungsreihe von Listeria monocytogenes angefertigt, um primär die untere Nachweisgrenze der derzeit eingesetzten Testsysteme abzuprüfen. Innerhalb des aktuellen Ringversuch-Probensets enthielt die Probe # 2025383 eine relativ hohe Menge an L. monocytogenes (ca. 5x10⁵ CFU/mL), Probe # 2025384 (ca. 5x10⁴ CFU/mL) eine etwa zehnfach geringere Menge und Probe # 2025382 (ca. 5x10³ CFU/mL) eine etwa hundertfach geringere Menge der entsprechenden L. monocytogenes-Zielorganismen. Erfreulicherweise konnte selbst die am schwächsten positive Probe noch von allen der insgesamt 41 Teilnehmer als „positiv“ klassifiziert werden. Lediglich 1 Teilnehmer berichtete für die negative Probe # 2025381 des aktuellen Probensets ein falsch-positives Ergebnis.

Im Vergleich zu den vorhergegangenen Ringversuchen deutet dies auf eine kontinuierlich verbesserte Vorgehensweise hinsichtlich der analytischen Sensitivität aber auch der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden diagnostischen Laboratorien hin. Von allen 41 Teilnehmern wurden Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen verwendet. Vermeintliche Inhibitionsereignisse bei der Aufarbeitung und Analyse der Ringversuchsproben wurden nicht beobachtet.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: AmpliGnost L. monocytogenes (2x), Progenie RealCycler L. monocytogenes (2x), Sacace Biotechnologies L. monocytogenes Real-TM (2x), BioFire FILMARRAY ME Panel (2x), BioGx Bacterial meningitis ELGBS (1x) und Amplex eazyplex CSF direct (1x).

Zuerst einmal, wie gehabt, eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für den Direktnachweis von MRSA-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise Nasen- oder Wundabstrichen) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen an entsprechenden Zielorganismen. Für interessierte Teilnehmer soll an dieser Stelle noch einmal explizit darauf hingewiesen werden, dass sich mit Testsystemen, die üblicherweise für die Kulturbestätigung von S. aureus und/oder MRSA ausgelegt sind, diese geringen Mengen nicht immer zuverlässig nachweisen lassen werden. Eine Teilnahme an diesem Ringversuch ist daher nur für solche diagnostischen Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von MRSA etabliert haben bzw. im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie an dieser Stelle bereits mehrfach thematisiert, basieren einige der derzeit etablierten eigenentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum Direktnachweis von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial auf einer getrennten Erfassung von S. aureus-spezifischen Markern, Staphylokokkenspezies-spezifischen Markern und dem mecA-Gen in der entsprechenden Nukleinsäurepräparation. Da sowohl bei S. aureus als auch bei Koagulase-negativen Staphylokokken das mecA-Gen für die phänotypische Ausprägung einer Methicillin-Resistenz verantwortlich ist, ist die Aussagekraft dieser PCR-gestützten Testsysteme für den Direktnachweis von MRSA aus nativem Patientenmaterial eingeschränkt, wenn beim Patienten eine gleichzeitige Besiedelung mit S. aureus und Koagulase-negativen Staphylokokken (die als klinische Isolate zumeist mecA-positiv sind) vorliegt. Einen attraktiven Ansatzpunkt zur Lösung dieses Problems bieten sog. SCCmec-basierte PCR-Testkonzepte, die auf dem Nachweis der SCCmec-Kassette innerhalb eines für S. aureus charakteristischen Genbereiches beruhen und die relativ gut konservierte Integrationsstelle der SCCmec-Kassette im S. aureus-Genom als Zielsequenz verwenden. Dass aber auch die SCCmec-basierten Testkonzepte gewisse Limitationen haben, konnte im Rahmen einiger früherer Ringversuche eindrucksvoll aufgezeigt werden: hier wurden bereits einige MRSA-Isolate mit selten vorkommenden SCCmec-Subtypen oder MSSA-Isolate mit einer an den jeweiligen Enden typischen SCCmec-Sequenz, aber mit einer natürlichen Deletion des üblicherweise innerhalb der SCCmec-Kassette vorhandenen mecA-Gens versandt.

Da wir diesmal, abgesehen von einem „ganz speziellen“ MRSA-Isolat keine schwierigen oder komplexen Probenkonstellationen versandt haben, wurden von den insgesamt 294 Teilnehmern mit ihren unterschiedlichsten NAT-gestützten Testsystemen nahezu durchweg korrekte PCR-Ergebnisse für 3 der insgesamt 4 Proben des aktuellen Panels berichtet. Das eben erwähnte MRSA-Patientenisolat enthält auf Genomebene zwar eine typische SCCmec-Genkassette und flankierend die typischen Integrationsstellen bzw. Sequenzbereiche, aber auf Genomebene fehlt der für S. aureus-Stämme typische Speziesmarker pSA442, der nach wie vor in einigen Testkonzepten als bewährte PCR/NAT-Zielsequenz verwendet wird [3].

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 13) der statistischen Auswertung dargestellt, enthielt die Probe # 2025391 diesmal eine relativ hohe Menge eines Methicillin-resistenten S. aureus-Patientenisolats (MRSA; PVL-negativ; pSA442-negativ; ~1x10⁵ CFU/mL), die Probe # 2025393 eine nennenswerte Menge eines Methicillin-resistenten S. aureus-Patientenisolats (MRSA; PVL-positiv; ~5x10³ CFU/mL), die Probe # 2025394 eine deutlich höhere Menge von gleichen Methicillin-resistenten S. aureus-Patientenisolats (MRSA, PVL-positiv; ~5x10⁴ CFU/mL), und die Probe # 2025392 ein „ganz gewöhnliches“ mecA-negatives Staphylococcus epidermidis-Isolat (~1x10³ CFU/mL).

Erfreulicherweise wurden im aktuellen Ringversuch bei der relativ stark positiven MRSA-Probe # 2025394 von 275 der insgesamt 277 Teilnehmer durchweg korrekt-positive PCR/NAT-Ergebnisse mitgeteilt. Auch wenn sich in der zweiten MRSA-positiven Probe # 2025393 eine etwa 10-fach geringere Menge an entsprechenden Zielorganismen befand, so kann die dabei beobachtete Richtigkeitsquote von 98% noch als durchaus zufriedenstellend betrachtet werden. Für diese Probe wurden von 273 Teilnehmern korrekt-positive Ergebnisse mitgeteilt. Der technische oder methodische Hintergrund der für beide Proben insgesamt 5 falsch-negativen und einem als „fraglich“ klassifizierten Ergebnis bei Verwendung von kommerziellen und vorkonfektionierten PCR-Testsystemen ist seitens des Ringversuchsleiters nicht näher zu ergründen. Angesichts der mit 5x10⁴ CFU/mL ehrlicherweise nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollten falsch-negative Ergebnisse bei den Proben # 2025393 und # 2025394 den betroffenen Ringversuchsteilnehmern durchaus Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihrer entsprechenden NAT-gestützten Testsysteme geben.

Die eher untypische Genomkonstellation des MRSA-Patientenisolats in Probe # 2025391 wurde bereits zuvor diskutiert. Da die besagte pSA442-Sequenz nur bei wenigen Anwendern als S. aureus-Speziesmarker zum Einsatz kommt, ist die Ergebnislage bei dieser Probe auch weitgehend nachvollziehbar: die meisten der insgesamt 277 Teilnehmer berichteten hier ein richtig-positives Ergebnis. Diese spezielle Probe wird im Rahmen der aktuellen Ringversuchsauswertung natürlich als „edukativ“ klassifiziert und die Ergebnisse bei der Erteilung der Zertifikate nicht bewertet.

Bei der Probe ohne MRSA-Zielorganismen (# 2025392), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge eines „ordinären“ mecA-negativen S. epidermidis-Patientenisolats enthielt, wurde im Rahmen des aktuellen Ringversuchs von 5 der 277 Teilnehmer ein falsch-positives MRSA-Ergebnis beobachtet. Dabei liegt das Auftreten eines sporadischen laborinternen Kontaminationsereignisses oder einer Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung nahe. Solche „Ausreißer“ sind bei technisch aufwändigen Ringversuchen mit über 200 Teilnehmern nichts Ungewöhnliches und bedürfen meines Erachtens keiner weiteren Diskussion.

Insgesamt bleibt festzuhalten, dass der erfreulich große Anteil von richtig-positiven Ergebnissen bei den beiden bewerteten positiven Proben und die überwiegend richtig-negativen Befunde bei der MRSA-negativen Probe erneut für ein hervorragendes Funktionieren von test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationssereignissen spricht.

Optional wird im Rahmen unserer Ringversuchsreihe auch der molekulargenetische Nachweis des putativen Pathogenitätsfaktors PVL (Panton-Valentine-Leukozidin) bzw. dessen kodierende Gene lukF/S-PV abgefragt. Entsprechende Ergebnisse wurden von 78 der insgesamt 277 teilnehmenden Laboratorien mitgeteilt, und mit Ausnahme von zwei Teilnehmern waren alle Ergebnisse für die molekularbiologische PVL-Testung durchweg korrekt.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: VELA diagnostics Sentosa SA Direct MRSA (2x), HOLOGIC Panther Fusion MRSA Assay (2x), Gerbion Diarella MRSA (2x), GenomEra MRSA/SA Multi Swab (1x), ELITechGroup MRSA/SA Kit (1x) und Q-Bioanalytic MRSA Kit (1x).

Eine wichtige Anmerkung wie immer vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Chlamydia pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von C. pneumoniae-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 14) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal eine Probe mit einer relativ hohen Menge an entsprechenden Zielorganismen (# 2025403; Chlamydia pneumoniae, ~1x10⁶ IFU/mL) und eine Probe mit einer etwa hundertfach geringeren Menge (# 2025402; Chlamydia pneumoniae, ~5x10⁴ IFU/mL), sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 2025401 und # 2025404), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Aus den in Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 14) aufgeführten Daten ist ersichtlich, dass im aktuellen Ringversuch erfreulicherweise nahezu alle der insgesamt 119 Teilnehmer die C. pneumoniae-Zielorganismen in der sehr stark positiven Probe # 2025403 (ca. 1x10⁶ IFU/mL) und in der 50-fach schwächer positiven Probe # 2025392 (ca. 5x10⁴ IFU/mL) sicher und zuverlässig nachweisen konnten. Lediglich ein Teilnehmer berichtete für die sehr stark positive Probe # 2025393 ein falsch-negatives Ergebnis für C. pneumoniae-DNA. Für die beiden Proben ohne C. pneumoniae-Zielorganismen # 2025401 und # 2025404 (jeweils nur E. coli) ist im Vergleich zu den vorhergegangenen Ringversuchen die Anzahl falsch-positiver Befunde erneut etwas zurückgegangen: Hier fanden sich insgesamt lediglich 4 Teilnehmer, die diese Proben fälschlicherweise als positiv für C. pneumoniae-DNA bewerteten. Dabei dürfte es sich aber am ehesten um laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung gehandelt haben. Alle von den Teilnehmern eingesetzten Testsysteme oder PCR/NAT-Protokolle wiesen die im Rahmen der regulatorischen Vorgaben geforderten Inhibitionskontrollen auf, und nennenswerte Inhibitionsereignisse wurden nicht beobachtet. Selbstentwickelte Inhouse-PCR/NAT-Testsysteme zur Detektion von C. pneumoniae-DNA wurden von 34 Laboratorien eingesetzt, von den restlichen 84 Teilnehmern wurde die Verwendung von kommerziellen Assays aufgeführt.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: MIKROGEN Diagenode Myc./Ch. Pneumoniae (3x), Sacace Biotechnologies M. pneumoniae/C. pneumoniae Real-TM (3x), Biolegio ReadyMax b-CAP Assay (2x), AmpliSens M. pneumoniae/C. pneumoniae FRT PCR kit (2x), BioFire FILMARRAY respiratory Panel 2 plus (2x), BioFire FILMARRAY Pneumonia Panel (1x), Ingenetix Bacto Real C. pneumoniae (1x), Seegene PneumoBacter assay (1x), BD Max (1x), Luminex Respiratory Pathogen Panel Multiplex PCR (1x), Eazyplex PneumoBug expert (1x), PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x), r-Biopharm RIDAGENE CAP Bac (1x) und AusDiagnostics Pneumonia 16 Plex (1x).

Aufgrund zahlreicher Rückfragen von Teilnehmern der vergangenen Ringversuche hier eine wichtige Anmerkung vorab: der Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Mycoplasma pneumoniae ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Mycoplasma pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Dieses Mal waren jedoch keine Proben mit geringen Mengen an Zielorganismen im ausgesandten Probenset vertreten.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 15) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben: Probe # 2025414 mit einer hohen Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~5x10⁵ Genomkopien/mL), Probe # 2025412 mit einer etwa zehnfach geringeren Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~5x10⁴ Genomkopien/mL) und # 2025413 mit einer etwa hundertfach geringeren Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~5x10³ Genomkopien/mL). Probe # 2025411 enthielt ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli. Mit jeweils einer bzw. zwei Ausnahmen konnten die 136 Teilnehmer die DNA von M. pneumoniae in den beiden stärker positiven Proben # 2025412 und # 2025414 zuverlässig nachweisen. Die Probe # 2025413 mit der geringsten Menge an Zielorganismen wurde immerhin von 128 Laboratorien als positiv für M. pneumoniae-DNA erkannt. Für die negative, mit E. coli versetzte Probe # 2025411 wurden lediglich von drei Teilnehmern des aktuellen Ringversuchs falsch-positive Ergebnisse berichtet. Hierbei könnte es sich eventuell um sporadische laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung gehandelt haben. Die im Rahmen der regulatorischen Vorgaben geforderten Inhibitionskontrollen wurden von allen 136 Teilnehmern mitgeführt, und bei keiner der ausgesandten Proben wurden Inhibitionsereignisse beobachtet.

Zusammenfassend bleibt anzumerken, dass wie bereits in vorausgegangenen Ringversuchsrunden die PCR/NAT-gestützte Diagnostik von Mycoplasma pneumoniae in vielen Labors robust und zuverlässig implementiert ist. Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs wurde von 100 Teilnehmern die Verwendung von kommerziellen Testkits aufgeführt.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: MIKROGEN Diagenode Myc./Ch. pneumoniae (3x), BioFire FILMARRAY Pneumonia oder respiratory Panel (3x), Biolegio ReadyMax b-CAP Assay (2x), Sacace Biotechnologies M. pneumoniae/C. pneumoniae Real-TM (2x), Luminex MagPix Respiratory Pathogen Panel Assay (2x), Sartorius Microsart ATMP Mycoplasma (2x), Seegene PneumoBacter assay (1x), Fast Track DIAGNOSTICS FTD Atypical CAP (1x), Fast Track DIAGNOSTICS FTD Respiratory Pathogens 21 (1x), AmpliSens M. pneumoniae/C. pneumoniae FRT PCR kit (1x), PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x), AusDiagnostics Pneumonia 16 Plex (1x), Ingenetix BactoReal M. pneumoniae (1x) und Eazyplex PneumoBug expert (1x).

Auch hier wieder eine Anmerkung vorweg: Der kombinierte Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Coxiella burnetii & Bacillus anthracis ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Coxiella burnetii- und Bacillus anthracis-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben (Tabelle 1, Anhang 1 [Anh. 1], S. 17) enthielt zwei Proben mit ähnlichen Mengen an C. burnetii (~5x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 2025421 und # 2025424), zwei Proben mit verschiedenen Mengen an B. anthracis-UR-1-Isolat-DNA (~5x10⁵ Genomkopien/mL in Probe # 2025422 und ~1x10⁵ Genomkopien/mL in Probe # 2025421), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 2025423), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Der Übersichtlichkeit halber wird bei diesem kombinierten Ringversuch die Ergebnislage für die beiden unterschiedlichen Erreger auch in zwei getrennten Tabellen dargestellt: für C. burnetii in den Tabellen 2 und 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 17) und für B. anthracis in den Tabellen 4 und 5 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 18).

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: Gerbion Diarella Q-Feber (2x), INDICAL Bioscience Bactotype C. burnetii PCR Kit (2x), Sacace Biotechnologies C. burnetii Real-TM (1x), Master diagnostica Tick-borne bacterial flow chip (1x), Adiagene ADIAVET C. burnetii (1x) und BioFire FILMARRAY BioThreat Panel (1x).

Coxiella burnetii: Wie bereits in den vorausgegangenen Ringversuchen gestaltet sich auch in der aktuellen Runde die Ergebnislage zufriedenstellend. Die beiden relativ stark positiven Proben # 2025421 und # 2025424 (ca. 5x10⁴ Genomkopien C. burnetii/mL) wurden von jeweils 45 der insgesamt 46 Teilnehmer mit ihren C. burnetii-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen detektiert. Die beiden Teilnehmer mit den singulären falsch-negativen Ergebnissen haben dabei die Verwendung von selbstentwickelten Inhouse-PCR-Assays aufgeführt. Falsch-negative Ergebnisse beim Vorliegen von doch nennenswerten Mengen an C. burnetii-Zielorganismen im Probenmaterial sollten die betroffenen Laboratorien zum Anlass nehmen, die Performance des verwendeten Testsystems zu hinterfragen und die Prozesse der Probenaufarbeitung gegebenenfalls zu optimieren.

Bei den beiden Proben ohne Zielorganismus (# 2025422 und # 2025423) wurde lediglich von einem Teilnehmer ein falsch-positives Ergebnis beobachtet. Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von C. burnetii-DNA der Teilnehmer enthielten durchweg eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Relevante Inhibitionsereignisse wurden nicht beobachtet.

Bacillus anthracis: Die Ergebnislage des Ringversuchs „Bacillus anthracis-DNA“ ist ebenfalls relativ schnell dargestellt. Alle 24 Teilnehmer konnten sowohl die stärker positive Probe # 2025422 als auch die etwa 5-fach schwächer B. anthracis-positive Probe # 2025421 richtig klassifizieren. Im Gegensatz zu einigen der vorausgegangenen Ringversuchsrunden wurden in der aktuellen Aussendung erfreulicherweise auch keine falsch-positiven Ergebnisse für die ‚negativen‘ Proben (# 2025423 und # 2025424) berichtet. Im Hinblick auf die Konsequenzen solcher Ergebnisse für die Therapie und das Management von Patienten (und die Auswirkungen auf das Umfeld!) ist dies sicherlich lobenswert.

Wie immer stehen nach erfolgreichem Abschluss der aktuellen Ringversuchsrunde den Kolleginnen und Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen für C. burnetii-DNA und B. anthracis-DNA interessiert sind, mit den Proben dieses Ringversuchs auch gewissermaßen „standardisierte Rückstellproben“ zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Francisella tularensis & Brucella spp.“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an F. tularensis-DNA und Brucella spp.-DNA aus geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben (Tabelle 1, Anhang 1 [Anh. 1], S. 19) enthielt zwei Proben mit verschiedenen Mengen an F. tularensis subsp. tularensis-DNA (~1x10⁵ CFU/mL in Probe # 2025433 und ~1x10⁴ CFU/mL in Probe # 2025431), zwei Proben mit verschiedenen Mengen an Brucella melitensis-DNA (~1x10⁵ CFU/mL in Probe # 2025432 und ~1x10⁴ CFU/mL in Probe # 2025431), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 2025434), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: Master diagnostica Tick-borne bacterial flow chip (1x), Sacace Biotechnologies Brucella Real-TM (1x) uns Applied Biosystems Brucella (1x).

Francisella tularensis: Sowohl die zwei positiven Proben (# 2025431 und # 2025433) als auch die zwei negativen Proben (# 2015431 und # 2015432) des aktuellen Probensets wurden diesmal von allen bis auf 2 der insgesamt 27 Teilnehmer durchweg korrekt mit ihren F. tularensis-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen analysiert und befundet. Die beiden Teilnehmer mit falsch-negativen Ergebnissen bei Probe # 2025431 sollten die Performance des verwendeten Testsystems überprüfen und/oder versuchen, die Effizienz ihrer jeweiligen Probenaufarbeitung zu optimieren. Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum PCR/NAT-gestützten Nachweis von F. tularensis-DNA enthielten entsprechende Inhibitions- und/oder Extraktionskontrollen, und bei keiner der aktuellen Proben wurden Inhibitionsereignisse beobachtet.

Brucella spp: Die Ergebnislage für die Brucella spp.-spezifische Komponente des RV 543 ist ebenfalls wieder sehr erfreulich. Hier wurden die beiden Brucella spp.-positiven Proben (# 2025431 und # 2025432) und die beiden negativen Proben (# 2025433 und # 2025434) von allen der diesmal 25 Teilnehmer durchweg korrekt mit ihren Brucella spp.-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen analysiert und befundet.

Bei den selbstentwickelten oder kommerziellen Testsystemen zum PCR/NAT-gestützten Nachweis von Brucella spp.-DNA wurden durchweg geeignete Inhibitions- und/oder Extraktionskontrollen mitgeführt, und bei keiner der aktuellen Proben wurden Inhibitionsereignisse mitgeteilt.

Der seit 2015 in das reguläre Ringversuchsprogramm von INSTAND e.V. aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Carbapenemase-Gene“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zur molekularen Resistenztestung bzw. dem Direktnachweis von charakteristischen Carbapenemase-Genen aus DNA-Präparationen von Reinkulturen an Enterobacterales konzipiert.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 21) der Auswertung dargestellt, enthielt das aktuelle Set drei Proben mit Carbapenem-resistenten Enterobacterales: Probe # 2025441 enthielt Serratia marcescens-Zielorganismen mit dem VIM-4-Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL), Probe # 2025443 Escherichia coli-Zielorganismen mit dem OXA-162-Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL) und Probe # 2025444 enthielt Citrobacter freundii-Komplex-Zielorganismen mit dem GES-5-Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL). Die vierte Probe # 2025442 war als Negativkontrolle ausgelegt – sie enthielt lediglich E. coli ohne Carbapenemase-Gene.

Erfreulicherweise konnten diesmal alle der insgesamt 80 Teilnehmer die Carbapenemase-Gene in den beiden positiven Proben # 2025441 und # 2025443 eindeutig nachweisen. Für die negative Probe # 2025442 des aktuellen Sets wurden ebenfalls von allen bis auf einen der Teilnehmer korrekt-negative PCR/NAT-Befunde mitgeteilt. Gewisse Schwächen der gegenwärtig eingesetzten Testsysteme zeigten sich allerdings bei der Detektion des GES-5-positiven Isolats aus dem C. freundii-Komplex. Hier wurden lediglich von 21 der 80 Teilnehmer positive Ergebnisse für Carbapenemase-Gene berichtet. Methodisch gesehen ist das auch nicht weiter verwunderlich, da das GES-5-Gen in vielen der aktuell verfügbaren bzw. routinemäßig eingesetzten Multiplex-PCR/NAT-Testformaten derzeit nicht als Target enthalten ist. Dennoch stellen GES-5-Carbapenemasen durch ihre steigende Nachweisrate in den letzten Jahren sowie ihr Vorkommen sowohl in Enterobacterales wie auch in Pseudomonas aeruginosa ein interessantes Target für diesen Ringversuch dar.

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum PCR/NAT-gestützten Direktnachweis von Carbapenemase-Genen der Teilnehmer enthielten mit zwei Ausnahmen eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: Bruker-Hain Carbaplex (2x), Check-Points Check direct CPE oder MDR (1x), BD Max Check-Points CPO Assay (1x), Amplex eazyplex SuperBug CRE (1x) und AmpliGnost Carbapenemase PCR Kit (1x).

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Clostridium difficile“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Clostridium difficile-DNA aus geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 22) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben zwei positive Proben: Probe # 2025453 mit einer relativ hohen Menge an Clostridium difficile (~5x10⁵ CFU/mL), Probe # 2025452 mit ca. zehnfach geringerer Menge (~5x10⁴ CFU/mL), sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 2025451 und # 2025454), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielten.

Die beiden relativ stark positiven Clostridium difficile-Proben # 2025452 und # 2025453 wurden erfreulicherweise von 164 bzw. 162 der insgesamt 165 teilnehmenden Laboratorien korrekt als „positiv“ klassifiziert. Falsch-negative Ergebnisse sollten hier zum Anlass genommen werden, das verwendete Testsystem bezüglich der analytischen Sensitivität und Spezifität zu evaluieren und auch die laborinternen Prozesse der Probenaufbereitung und -abarbeitung kritisch zu hinterfragen. Letzteres gilt insbesondere für die beiden Teilnehmer mit falsch-positivem Ergebnis für die lediglich E. coli-enthaltende Probe # 2025454. Eine Kreuzreaktion der verwendeten Testsysteme mit E. coli erscheint unwahrscheinlich, am ehesten sind Kreuzkontaminationen im Prozess der Probenbearbeitung ursächlich. Die negative Probe # 2025451 wurde dagegen von allen bis auf einen Teilnehmer, der ein als „fraglich“ klassifiziertes Ergebnis berichtete, korrekterweise als negativ für C. difficile befundet. Bis auf 4 Teilnehmer haben diesmal alle die vorschriftsmäßigen Extraktions- und/oder Inhibitionskontrollen mitgeführt, und signifikante Inhibitionsereignisse wurden bei keiner der diesmal ausgesandten Proben berichtet.

Wie in Tabelle 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 23) angegeben, verwendete der Großteil der Teilnehmer kommerzielle Testsysteme, während selbstentwickelte Testkonzepte in 11 Laboratorien zum Einsatz kamen. In dieser Ringversuchsrunde zeigten sich (vergleichbar mit den vorausgegangenen Aussendungen) keine signifikanten Unterschiede bezüglich Sensitivität und Spezifität zwischen den kommerziellen Testsystemen und den eigenentwickelten PCR/NAT-Assays.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: TIB Molbiol Modular Dx Kit Cdiff Toxin Gene tcdA/tcdB (3x), TIB Molbiol LightMix Kit (1x), Seegene Allplex GI-EB Screening (2x), AmpliGnost C. difficile Toxin A und B (2x), r-Biopharm RIDAGENE CD Toxin A/B (1x), Abacus Diagnostica GenomEra C. difficile (1x), Bio-Speedy C. difficile Real-Time PCR (1x), ANCHOR C. difficile PCR Kit (1x) und Fast Track DIAGNOSTICS FTD Bacterial gastroenteritis (1x).

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Vancomycin-resistente Enerokokken“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an DNA Vancomycin-resistenter Enterokokken aus geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 24) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben zwei positive Proben: Probe # 2025461 mit einer relativ hohen Menge an Zielorganismen (Enterococcus faecium vanA-resistent, ~1x10⁵ CFU/mL), Probe # 2025464 mit einer ähnlichen Menge (Enterococcus faecium vanB-resistent, ~5x10⁴ CFU/mL) und Probe # 2025462 mit ca. ~1x10⁵ CFU/mL an Lactobacillus rhamnosus. Im Ringversuchsprobenset befand sich zudem eine Probe ohne Zielorganismen (# 2025463), die nur humane Zellen und E. coli enthielt.

Erfreulicherweise wurden die beiden positiven Proben mit vanA- bzw. vanB-tragenden Enterococcus faecium (# 2025461 und # 2025464) mit keiner Ausnahme von allen Teilnehmern korrekterweise als „VRE-positiv“ klassifiziert. Wie bereits in den vorangegangenen Ringversuchsrunden waren auch diesmal nahezu alle mitgeteilten Ergebnisse der vanA/vanB-Differenzierungen (bis auf zwei falsch klassifizierte) korrekt. Von den VRE-negativen Proben wurde # 2025462 von allen der insgesamt 63 Teilnehmer korrekt klassifiziert, für die Probe # 2025463 war lediglich ein falsch-positiver Befund zu verzeichnen.

Bei den eingesetzten Testsystemen zeigt sich in den letzten Jahren ein Trend hin zu kommerziell erhältlichen, vorkonfektionierten Systemen. Signifikante Unterschiede in Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu Inhouse-Assays waren auch diesmal nicht zu erkennen.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: Amplex eazyplex VRE (3x), AmpliGnost Vancomycin A/B Resistenz Differenzierung (2x), GeneProof VRE (1x) und MIKROGEN ampliCube MRD Panel 6 (1x).

Nach intensiven Vorarbeiten zum Proben-Design, zur praktischen Umsetzung und der Aussendung von zwei sogenannten „Piloten“ wird der komplexe Ringversuch RV 547 „Urogenital-Panel“ zukünftig im Rahmen des regulären Ringversuchsprogramms von INSTAND e.V. durchgeführt und die Ergebniskonstellation hier diskutiert. Das überaus heterogene Spektrum an eingesetzten Testsystemen erschwert natürlich nach wie vor eine strukturierte und übersichtliche Auswertung der auf den Report-Formularen mitgeteilten Ergebnisse. Daher haben wir im Vergleich zu den übrigen Ringversuchen der hier diskutierten Ringversuchsreihe „Bakterien- und Pilzgenomnachweis PCR/NAT“ die ursprüngliche Tabelle 3 etwas differenzierter dargestellt (jetzt: „erregerspezifische“ Auswertung in den Tabellen 2 bis 9, Anhang 1 [Anh. 1], S. 25–29). Dort ist der Übersicht halber nun die Anzahl an positiven und negativen Ergebnissen für die in den jeweiligen Proben anwesenden Pathogene aufgeführt. Mit dieser Lösung sollte man, trotz der enormen und vermutlich zukünftig auch noch zunehmenden Heterogenität des Erreger- und Testspektrums einzelner Multiplex-PCR-Testkonzepte, eine einigermaßen informative Darstellung über das erfasste Erregerspektrum und über die Leistungsdaten einzelner Testsysteme erhalten können.

Im Großen und Ganzen haben die 79 aktuell registrierten Teilnehmer die Erreger in den 4 Einzelproben entsprechend den methodischen Möglichkeiten ihrer Testsysteme zufriedenstellend nachweisen können. Wie aus den Tabellen 2 bis 9 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 25–29) zu entnehmen, wurden insgesamt nur sehr wenige (sporadische) falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse berichtet.

So wurden in der aktuellen Ringversuchsrunde vereinzelt falsch-positive sowie falsch-negative Ergebnisse für Mycoplasma hominis oder Trichomonas vaginalis beobachtet. Für die Ureaplasma parvum-positive Probe wurden erfreulicherweise durchweg korrekte Befunde von den insgesamt 53 Teilnehmern mit mitgeteiltem PCR-Ergebnis für Ureaplasma berichtet. Bei den falsch-positiven Befunden könnte es sich eventuell um labor- oder testinterne Kontaminationsereignisse bzw. Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung gehandelt haben. Inhibitionskontrollen wurden von allen der 79 Teilnehmer mitgeführt, und von keinem Teilnehmer wurden Inhibitionsereignisse beobachtet.

Dies spricht zum einen für die Praktikabilität unseres innovativen Multiplex-Ringversuchskonzepts und zum anderen für die relativ zuverlässige Erfassung der Zielorganismen innerhalb der jeweils testspezifisch abgedeckten Erregerspektren der eingesetzten kommerziellen oder eigenentwickelten PCR/NAT-Verfahren.

Wie bereits in der vorhergehenden Ringversuchsdiskussion erwähnt, haben wir für im Rahmen der Online-Ergebnisübermittlung des RV 547 eine Option in der Eingabemaske entwickelt, über die die einzelnen Teilnehmer das aktuell erfasste Erregerspektrum ihrer individuellen Testsysteme und Multiplex-Assays während der Ergebniseingabe mitteilen. Für die Erteilung von Zertifikaten macht es nachvollziehbarerweise nur Sinn, dass diejenigen Parameter bewertet und testiert werden, die von den individuellen Teilnehmern im Rahmen ihres diagnostischen Workflows prinzipiell auch als positiv bzw. negativ erfasst werden können.

Wie bereits eingangs kurz erwähnt, werden wir uns aufgrund des zunehmend heterogenen Spektrums von differenziert erfassten oder auch nicht zu differenzierenden Spezies einiger Erregergruppen (z.B. Ureaplasma spp. vs. U. parvum/U. urealyticum) bei vielen der aktuellen PCR-Testsysteme zeitnah bemühen, bei den Online-Eingabemasken die Möglichkeit einer differenzierten Befundung auf Spezies- oder eben nur auf Genus-Ebene zu schaffen.

Der Ringversuchsleiter ist natürlich stets für weitere konstruktive Kommentare und Vorschläge aus dem Teilnehmerkreis dankbar. Trotz des relativ vielfältigen Spektrums an unterschiedlichen Testsystemen und -konzepten werden wir uns nach Kräften bemühen, die Teilnehmer bei den zukünftigen Ringversuchsrunden mit aussagekräftigen Zertifikaten versorgen zu können.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: MIKROGEN ampliCube STD Panel 1 (8x), MIKROGEN ampliCube STD Panel 2 (7x), MIKROGEN ampliCube STD Panel 3 (4x), Seegene Anyplex STI-7 Detection (2x), Seegene Anyplex STI-5 Detection (1x),Seegene Allplex Genital ulcer (1x), AmpliGnost STI Urethritis (1x), AmpliGnost U. urealyt./U. parvum (1x), AmpliGnost M. genitalium und M. hominis (1x), BIORON diagnostics RealLine U. urealyt./U. parvum und M. hominis/genitalium (1x), Bruker-Hain Lifescience FluoroType STI (1x), Amplex eazyplex STD complete (1x), AmpliSens U. parvum/U. urealyticum FRT PCR kit (2x), AmpliSens T. vaginalis FRT PCR kit (1x), AmpliSens M. hominis und M. genitalium FRT PCR kit (1x), Sacace Biotechnologies U. urealyticum und U. parvum/T. vaginalis/T. pallidum/M.hominis und M. genitalium/G. vaginalis (1x), AB Analytica Realquality U. urealyticum und U. parvum (1x), AID RDB 2335 STI (1x), AID RDB 2110 STD (1x), r-Biopharm RIDAGENE T. vaginalis (1x), BD Max CT/GV/TV Panel (1x), EUROIMMUN EUROArray STI-11 (1x), TIB Molbiol LightMix modular T. pallidum (2x),TIB Molbiol LightMix modular M. genitalium (1x) und VIASURE STD Kit (1x).

Der Ringversuch „Pilzgenomnachweis PCR/NAT Pneumocystis jirovecii“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis von Pneumocystis jirovecii-DNA in geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Zum orientierenden Herantasten an die unteren Nachweisgrenzen der im Anwenderkreis etablierten PCR/NAT-gestützten Testsysteme enthielt das aktuelle Set zwei positive Proben (Tabelle 1, Anhang 1 [Anh. 1], S. 30): eine Probe mit einer relativ hohen Menge an Zielorganismen (# 2025603; Pneumocystis jirovecii, ca. 1x10⁵ Organismen/mL), eine Probe mit einer geringeren Menge (# 2025601; Pneumocystis jirovecii, ca. 1x10⁴ Organismen/mL), sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 2025602 und # 2025604) aber mit E. coli und einer Suspension aus humanen Zellen.

Die beiden negativen Proben # 2025602 und # 2025604 wurden erfreulicherweise mit einer bzw. zwei Ausnahmen von allen Teilnehmern korrekt als negativ für Pneumocystis jirovecii-DNA befundet. Im Vergleich zu den vorausgegangenen Ringversuchsrunden hat sich die Rate an falsch-positiven Ergebnissen damit auf einem sehr niedrigen Level stabilisiert. Bei den positiven Proben wurde Probe # 2025603 mit ~1x10⁵ Organismen/mL diesmal von allen der insgesamt 111 Teilnehmer korrekt als positiv befundet. Etwas schlechter war die Ergebnislage für die ca. zehnfach schwächere positive Probe # 2025601 (ca. 1x10⁴ Organismen/mL). Immerhin 107 von insgesamt 111 teilnehmenden Laboratorien berichteten hier ein korrektes, positives Ergebnis. Bei einer Menge von 1x10⁴ Organismen/mL an P. jirovecii (entspricht ca. 100 Zielorganismen in dem für PCR-Untersuchungen typischerweise prozessierten Probenvolumen von 100 µl) nähert man sich offenbar der unteren Nachweisgrenze aktueller, durchschnittlich sensitiver PCR/NAT-Testsysteme und den entsprechenden Arbeitsabläufen zur Probenaufarbeitung und Template-DNA-Präparation an.

Alle von den 111 Teilnehmern eingesetzten Testsysteme oder PCR/NAT-Protokolle wiesen die im Rahmen der regulatorischen Vorgaben geforderten Inhibitionskontrollen auf, und nennenswerte Inhibitionsereignisse wurden nicht beobachtet. Selbstentwickelte Inhouse-PCR/NAT-Testsysteme zur Detektion von P. jirovecii-DNA wurden von 28 Laboratorien eingesetzt, von den restlichen 83 Teilnehmern wurde die Verwendung von kommerziellen Assays aufgeführt.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Sacace Biotechnologies P. jirovecii Real TM (2x), AmpliSens P. jirovecii FRT PCR kit (2x), Biolegio Atypical Pneumonia-1 (1x), PathoNostics PneumoGenius (1x), VIASURE P. jirovecii Real Time PCR Detection (1x) und ELITechGroup Pneumocystis ELITe MGB Kit (1x).