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Nach erfolgreicher Etablierung dieser neuen Ringversuchs-Serie wollen wir hier auch für Kolleginnen und Kollegen, die bisher noch nicht an diesen Ringversuchen teilgenommen haben, die Ergebnisse der aktuellen Ringversuche für den PCR/NAT-gestützten Nachweis von Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, EHEC/STEC, Borrelia burgdorferi sensu lato, Legionella pneumophila, Salmonella enterica und Listeria spp., MRSA bzw. cMRSA, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetti, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Brucella spp., Pneumocystis jirovecii (vormals P. carinii), Clostridium difficile (Toxingene), VRE (Vancomycin-resistente Enterokokken) und der molekularen Resistenztestung für Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae sowie dem im Mai 2019 neu ins Programm aufgenommenen Multiplex-Panel für Erreger von Urogenitalinfektionen darstellen und kurz diskutieren.

Wie bei allen anderen Ringversuchen erfolgt die Anmeldung zu ausgewählten Teilen der Reihe „Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis (PCR/NAT)“ über die Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in Medizinischen Laboratorien (INSTAND e.V.), Düsseldorf (https://www.instand-ev.de). Nach Abschluss des jeweiligen Ringversuchs werden die Ergebnisse der einzelnen Teilnehmer dort zentral erfasst, und anhand von individuellen Bewertungskriterien werden die schriftlichen Zertifikate erstellt. Zusätzlich stehen für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe weiterer Informationen auch im Internet unter http://www.udo-reischl.de, Unterpunkt „INSTAND-Ringversuche (PCR/NAT)“, sowie auf der Webseite von INSTAND e.V. als pdf-Files zum freien Download bereit.

Neben der Aussendung von lyophilisierten Probenmaterialien zur systematischen Abprüfung von NAT-gestützten Testsystemen für derzeit 19 unterschiedliche bakterielle und fungale Zielorganismen bzw. Pathogenitätsfaktoren gab es im Rahmen dieser Ringversuchsrunde auch wieder gewisse „Highlights“.

So wurde beispielsweise im aktuellen RV 539 MRSA/cMRSA eine der vier Proben mit einem MRSA-Patientenisolat versetzt, das zwar PCR-detektionsrelevante Segmente der SCCmec-Genkassette enthielt, aber anstatt des bei MRSA-Stämmen „üblichen“ mecA-Gens das ebenfalls phänotypisch Methicillin-resistenzvermittelnde mecC-Gen enthielt. Erfreulicherweise konnte dieses mecC-positive MRSA-Isolat in der aktuellen Ringversuchsrunde von nahezu 80% aller Teilnehmer mit ihren MRSA-spezifischen PCR-Testsystemen erfasst und korrekt als MRSA befundet werden. Im Ringversuch November 2015 wurde ein vergleichbares MRSA-Isolat mit mecC-Gen lediglich von knapp einem Drittel der damaligen Teilnehmer als MRSA erkannt. Die methodischen Limitationen aufgrund der Sequenzvielfalt bei resistenzvermittelnden Genen bestätigen jedoch erneut die Sinnhaftigkeit und auch Notwendigkeit des im Rahmen der PCR/NAT-Ringversuchsdiskussionen bereits mehrfach thematisierten begleitenden kulturellen Nachweises von MRSA. Interessant war auch die Ergebniskonstellation des EHEC/STEC-Panels im aktuellen RV 534. Neben zwei „normalen“ O157-Isolaten wurde auch ein weiteres EHEC-Isolat mit der etwas selteneren Shiga-Toxin-Genvariante stx_2f ausgesandt und dabei sogar eine sehr respektable Richtigkeitsquote von ca. 60% erzielt. Aufgrund der deutlich von den anderen Shiga-Toxin-Genen abweichenden Gensequenz von stx_2f war bei den üblicherweise zum EHEC-Nachweis eingesetzten PCR/NAT-Testsystemen ja auch eine gewisse „diagnostische Lücke“ zu erwarten.

In jeweils einer der 4 Einzelproben der aktuellen Ringversuche RV 530: CT/GO, RV 533: Helicobacter pylori und RV 560: Pneumocystis jirovecii befanden sich diesmal relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen. Erfreulicherweise bereitete der zuverlässige PCR-gestützte Nachweis dem Großteil unserer Teilnehmer (bzw. den von ihnen eingesetzten Testsystemen) keine nennenswerten Probleme.

Mit der Auswahl eines etwas breiteren Spektrums von relevanten Carbapenemase-Genen bestätigte sich im Rahmen des Ringversuchs RV 544 Carbapenemase-Gene erneut die Vermutung, dass viele der derzeit verwendeten kommerziellen sowie Inhouse-Testsysteme zur molekularen Carbapenemase-Detektion noch gewisse Lücken hinsichtlich der Abdeckung von unterschiedlichen Carbapenemase-Genen aufweisen. Im aktuellen Ringversuch scheint dies insbesondere für die Carbapenemase IMI-2 zu gelten, die zu den Serin-Carbapenemasen gehört und deren Nachweisrate in den letzten Jahren zugenommen hat. Das Isolat aus dem Enterobacter cloacae-Komplex mit IMI-2-Gen wurde aktuell lediglich von 14 der insgesamt 89 Teilnehmer detektiert und als solches befundet. Im Umfeld der molekularen Testung von Carbapenemase-Genen unterstützt uns Frau Dr. Agnes Anders vom NRZ für gramnegative Krankenhauserreger weiterhin bei der Auswahl von relevanten „interessanten“ klinischen Isolaten.

Alle Teilnehmer sind natürlich weiterhin dazu aufgerufen, attraktive Parameter für eine zukünftige Erweiterung des Spektrums an Zielorganismen vorzuschlagen und deren mögliche Umsetzung mit dem Ringversuchsleiter zu diskutieren.

Für die externe Qualitätssicherung der zukünftig kommerziell verfügbaren (und damit wohl auch vermehrt eingesetzten) PCR/NAT-Multiplex-Nachweisverfahren für Urogenital-Infektionen haben wir seit Mai 2019 einen neuen Ringversuch routinemäßig etabliert, der vom Konzept her jeweils einige der nachfolgenden Erreger in unterschiedlichen Kombinationen und Mengen innerhalb des 4er-Panels enthält:

RV 547 „Urogenital-Panel“ zum Nachweis von Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis und ggf. Treponema pallidum.

Nach 19 Teilnehmern beim Pilotringversuch 2018 und 68 Teilnehmern im November 2019 haben sich diesmal bereits 88 Teilnehmer registriert. Wir werden uns nach Kräften bemühen, der deutlich steigenden Nachfrage auch bei den zukünftigen Ringversuchsrunden mit ausreichenden Mengen an geeignetem Probenmaterial nachkommen zu können.

Vorab noch eine Anmerkung zu den statistisch ermittelten und in den jeweiligen Tabellen 3 aufgeführten Leistungsdaten von kommerziellen PCR/NAT-Testsystemen. Auffällig bei vielen der aktuellen aber auch bei einigen der früheren Ringversuche ist das unterschiedlich gute Abschneiden von Teilnehmern mit ein und denselben kommerziellen, vorkonfektionierten und teilweise auch automatisierten und/oder kartuschenartig geschlossenen Testsystemen.

Die meisten dieser Assays sind zudem auch noch CE- und/oder IVD-zertifiziert – mit allen aufwändigen herstellerseitigen Vorkehrungen zur möglichst zuverlässigen Durchführung und standardisierten Ergebnisinterpretation. Die auffällige „Streuung der Performance“ (bzw. das Auftreten einzelner Ausreißer) unterstreicht umso mehr die Bedeutung der aktuell vorgegebenen Qualitätsstandards, wie beispielsweise das regelmäßige Mitführen von geeigneten Extraktions-, Positiv- und Negativ-Kontrollen sowie Schulungen und kontrollierte Maßnahmen zur Vermeidung von exogenen Kontaminationsmöglichkeiten in PCR/NAT-Arbeitsbereichen, die u.a. im Rahmen der aktuellen RiLi-BÄK 2019 (Richtlinie der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen), der Akkreditierung und der praxisorientiert verfassten MIQ-1 gefordert werden. Deren Sinnhaftigkeit und Stringenz mag aus Anwendersicht ja gelegentlich bezweifelt werden, wird aber in diesen Ringversuchsrunden (sozusagen von neutraler Warte aus) dennoch immer wieder aufs Neue bestätigt.

Neben den überaus motivierten und engagierten Mitarbeitern der verschiedenen Sollwert-Laboratorien unterstützen uns bei der Konzeption und Auswertung der zahlreichen Ringversuche zum Bakterien- und Pilzgenomnachweis PCR/NAT noch zahlreiche Kolleginnen und Kollegen aus unserem Hause. Allerherzlichsten Dank für ihre spontane Bereitschaft sowie ihr ehrenamtliches Engagement für unsere gemeinsamen Bemühungen zur externen Qualitätssicherung molekularbiologischer Nachweisverfahren in der infektiologischen Diagnostik.

Entsprechend des Grundgedankens unserer Ringversuchsaktivitäten wurde auch bei der Konzeption des aktuellen Ringversuchs zum „Bakteriengenomnachweis mittels PCR oder anderer Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT)“ bei einigen Zielorganismen der Versand von Proben mit relativ niedrigen Erregerzahlen angestrebt. In den aktuellen Ringversuchssets befanden sich daher erneut einige Proben mit einer relativ geringen Menge folgender Zielorganismen: Neisseria gonorrhoeae (Proben # 2015303 und # 2015304), Helicobacter pylori (Probe # 2015334), Borrelia burgdorferi (Probe # 2015352), Chlamydia pneumoniae (Probe # 2015403), Mycoplasma pneumoniae (Probe # 2015414) sowie Clostridium difficile (Probe # 2015451).

Im Rahmen der Testentwicklung bzw. Testoptimierung können diese Probensätze, u.a. als Qualitätskontrollen oder als standardisierte Sensitivitätsmarker, für die Austestung der unteren Nachweisgrenze von eigenentwickelten Nukleinsäure-gestützten Testsystemen dienen. An dieser Stelle möchten wir auch darauf hinweisen, dass zahlreiche Rückstell-Probensätze der früheren Ringversuche noch verfügbar sind, und bei Bedarf über den Ringversuchsleiter formlos nachbestellt werden können.

Mit Ausnahme der zuvor erwähnten „grenzwertig positiven“ Einzelproben wurden die Mengen der entsprechenden Zielorganismen in den Probensätzen der aktuellen Ringversuchsrunde wieder relativ deutlich über der Nachweisgrenze von „durchschnittlich sensitiven PCR/NAT-Testkonzepten“ eingestellt. Diese definieren wir wie folgt: als Richtwert für die Bewertung von Ringversuchsergebnissen gilt das 10- bis 50-fache der unteren Nachweisgrenze durchschnittlich sensitiver PCR-Protokolle unter Standardbedingungen (z.B. 50 µl Block-Cycler-Reaktionsansätze, 35 PCR-Zyklen, ggf. entsprechende Realtime-PCR-Protokolle; gut evaluierte Primersequenzen).

Bei den meisten Probenmaterialien der aktuellen Ringversuchsrunde stellen falsch-negative Ergebnisse damit einen deutlichen Hinweis auf ernstzunehmende Mängel innerhalb der eingesetzten Verfahren zur Nukleinsäure-Extraktion, Amplifikation und Detektion dar.

Falsch-positive Ergebnisse sind dagegen in der Regel als Hinweis auf eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion bzw. -abarbeitung und/oder auf mangelnde Spezifität der eingesetzten Testsysteme zu betrachten.

In bewährter Form werden im Folgenden die Ergebnisse der jeweiligen erregerspezifischen Ringversuche dargestellt. Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1]) zeigt dabei die Probenzusammensetzung und das erwartete Ergebnis (Sollwert) mit den entsprechenden Codenummern der Ergebnisbögen. Die von den einzelnen Teilnehmern mitgeteilten Ergebnisse werden in Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1]) nach der Häufigkeit der Mitteilung von positiven oder negativen Ergebnissen, und in Tabelle 3 (Anhang 1 [Anh. 1]) nach der absoluten Anzahl der richtig-positiven und richtig-negativen Ergebnisse sowie derem prozentualem Anteil (Befundhäufigkeit) je Amplifikationssystem bzw. Testkonzept aufgeschlüsselt.

Für die objektive Bewertung von kommerziellen Testsystemen sollten neben der rein statistischen Betrachtung der mitgeteilten Ringversuchsergebnisse auch die Anzahl und vor allem die methodische bzw. technische Qualifikation der individuellen Teilnehmer berücksichtigt werden. Da wir im Zuge unserer Ringversuche aber das gesamte Spektrum von spezialisierten Expertenlabors bis hin zum „Gelegenheitsanwender“ abdecken, müssen die arithmetisch ermittelten Richtigkeitsquoten bei der Bewertung einzelner Testsysteme immer mit einem gewissen Toleranzbereich betrachtet werden.

Auch im Rahmen des hier diskutierten Ringversuchs waren wieder einige Auffälligkeiten hinsichtlich der Spezifität und Sensitivität von bestimmten Testkonzepten und der für den Nachweis verwendeten Zielsequenzen zu beobachten. Diese Aspekte sind bei der Auswertung des jeweiligen Ringversuchs aufgeführt und dort auch kurz diskutiert. Zusätzlich stehen für die früheren, für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe zusätzlicher Informationen (wie die graphisch dokumentierten Ergebnisse unserer quantitativen Realtime-PCR-Testsysteme oder die Ergebnisse einiger kommerzieller PCR-Testsysteme) auch unter der Internetadresse http://www.udo-reischl.de, Unterpunkt „Auswertung der Ringversuche“ und natürlich auch über die Webseite von INSTAND e.V. (https://www.instand-ev.de) als pdf-Files zum freien Download bereit.

An dieser Stelle möchte ich mich noch einmal ausdrücklich bei den geschätzten Kolleginnen und Kollegen für ihre zahlreichen und überaus konstruktiven Kommentare und Anregungen zu den Ausführungen in dieser Ringversuchsdiskussion sowie deren tatkräftige Unterstützung bei der Konzeption und dem Aufbau neuer Ringversuche bedanken.

Die Ergebnislage des aktuellen Ringversuchs deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus vorangegangenen Ringversuchen zum kombinierten NAT-gestützten C. trachomatis- und Gonokokken-Nachweis. Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthält jeweils drei Proben mit C. trachomatis-Organismen: Probe # 2015304 mit ~5x10⁴ IFU/mL, Probe # 2015303 mit ~1x10⁴ IFU/mL und Probe # 2015301 mit ~5x10³ IFU/mL. Diesmal waren ebenfalls 3 der 4 Einzelproben mit unterschiedlichen Mengen an Gonokokken versetzt: Probe # 2015301 mit ~5x10⁴ CFU/mL, Probe # 2015304 mit ~5x10³ CFU/mL und Probe # 2015303 mit ~5x10² CFU/mL N. gonorrhoeae-Zielorganismen.

Der Übersichtlichkeit halber stellen wir bei diesem kombinierten Ringversuch (CT/NG) die Ergebniskonstellation in 5 getrennten Tabellen dar (Anhang 1 [Anh. 1], S. 1–3). Damit wird die diagnostische Performance der jeweiligen Testsysteme beim Nachweis von CT und NG aussagekräftiger (Tabelle 2: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei CT, Tabelle 4: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei NG; jeweils gefolgt von den Richtigkeitsquoten nach aufgeführten Testsystemen in den Tabellen 3 und 5).

Auch wenn die etwas schwächer positive Probe # 2015301 des aktuellen Ringversuchs nur mit ca. 5x10³ IFU/mL an C. trachomatis-Zielorganismen versetzt worden war, fanden sich unter den von insgesamt 269 Teilnehmern mitgeteilten NAT-Ergebnissen für C. trachomatis diesmal nahezu durchwegs richtig-positive Ergebnisse. Bei den beiden ca. 2- und 10-fach stärker CT-positiven Proben # 2015303 und # 2015304 des aktuellen Probensets wurden ebenfalls von nahezu allen Teilnehmern richtig-positive Ergebnisse beobachtet. Lediglich zwei Teilnehmer berichteten bei der Probe # 2015303 falsch-negative Ergebnisse und ein Teilnehmer klassifizierte sein Ergebnis für die Probe # 2015301 als „fraglich“. Für die C. trachomatis-negative Probe # 2015302 wurden aus dem gesamten Teilnehmerfeld ebenfalls nur 2 falsch-positive Ergebnisse berichtet. Da in der aktuellen Ringversuchsrunde von einem Großteil der Anwender mit den unterschiedlichsten Testsystemen durchweg korrekte Ergebnisse berichtet wurden, handelt es sich bei den zwei falsch-negativen und den zwei falsch-positiven Ergebnissen vermutlich um ringversuchstypische „sporadische Ausreißer“.

Im Rahmen des NAT-gestützten Gonokokken-Nachweises wurden für die drei positiven Proben # 2015301, # 2015303 und # 2015304 (N. gonorrhoeae; ca. 5x10⁴, ca. 5x10² und ca. 1x10³ CFU/mL) diesmal von den insgesamt 267 Teilnehmern 29 falsch-negative Ergebnisse für Gonokokken-DNA bei den relativ schwach positiven Proben # 2015303 und # 2015304 sowie 5 falsch-negative Ergebnisse für Gonokokken-DNA bei der deutlich stärker positiven Probe # 2015301 mitgeteilt. Bei der GO-negativen Probe # 2015302 wurden jedoch von 6 der insgesamt 267 Teilnehmer falsch-positive Ergebnisse berichtet.

Dieser im Vergleich zu früheren Ringversuchsrunden doch überraschend hohe Anteil an falsch-positiven Ergebnissen deutet auf Kontaminationsereignisse oder wie auch immer geartete Template-Nukleinsäure-Verschleppungen bei der Probenaufbereitung und -abarbeitung hin; vor allem, weil im aktuellen 4er-Set die GO-negative Probe # 2015302 bei sequenzieller Abarbeitung unmittelbar auf eine der GO-positiven Proben folgte. Den betroffenen Laboratorien sollten diese Ergebnisse Anlass geben, ihren individuellen diagnostischen Workflow hinsichtlich der Kontaminationssicherheit während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik zu überprüfen und gegebenenfalls zu optimieren.

Angesichts der mit 5x10² CFU/mL bzw. 1x10³ CFU/mL doch relativ geringen Mengen an Zielorganismen wurden die negativen PCR-/NAT-Ergebnisse bei den beiden Proben # 2015303 und # 2015304 bei der Erstellung der Zertifikate diesmal nicht als „falsch-negativ“ gewertet.

In der GO-positiven Probe # 2015301 sollten falsch-negative Ergebnisse bei betroffenen Ringversuchsteilnehmern jedoch Anlass zur Optimierung ihrer jeweiligen spezifischen PCR/NAT-gestützten Testsysteme geben.

Da die beobachteten „Sensitivitätsprobleme“ diesmal jedoch nur relativ marginal ausfallen, sich offensichtlich nicht auf bestimmte Testkonzepte eingrenzen lassen und sporadisch durch das ganze Portfolio der eingesetzten Testsysteme gehen, kann dem großen Rest des Teilnehmerfeldes erneut eine erfreulich gute analytische Sensitivität und Spezifität ihrer CT- und GO-spezifischen NAT-Testsysteme sowie der angewandten Prozeduren zur Probenaufarbeitung und -prozessierung attestiert werden. Angesichts der streng normierten und standardisierten Abarbeitungsprotokolle von kommerziellen Testsystemen scheint es für den Ringversuchsleiter jedes Mal aufs Neue nicht verwunderlich, dass ein nennenswerter Anteil der teilnehmenden Laboratorien mit den betroffenen Testsystemen erfolgreich die vorgegebenen Zielwerte erreicht. Ohne denjenigen Teilnehmern, die mit bestimmten kommerziellen Testsystemen die Zielwerte nicht erreichen, zu nahe treten zu wollen, deutet dieser Umstand in diesen Fällen dann wohl eher auf individuelle Abweichungen vom Protokoll oder bestimmte Fehler bei der Probenabarbeitung als auf intrinsische Unzulänglichkeiten der in der Regel gut evaluierten Testsysteme hin.

Auch wenn mit ca. 5x10² CFU/mL an Zielorganismen im Probenmaterial der Probe # 2015303 die untere Nachweisgrenze hochsensitiver und standardisierter PCR/NAT-gestützter Testsysteme noch nicht erreicht oder unterschritten sein sollte, stehen mit den Rückstellproben des Ringversuchs RV 530 vom Mai 2020 den Teilnehmern mit hohem Anspruch an die individuelle Testsensitivität wieder geeignete Sets zur Überprüfung und Optimierung ihrer jeweiligen NAT-gestützten Testsysteme zur Verfügung.

Wir glauben, es ist auch für den Leser dieser Ringversuchsdiskussion weitgehend nachvollziehbar, dass wir als Organisatoren von Testkonzept- und Testplattform-übergreifenden Ringversuchen bei der Konfektionierung unserer Probenmaterialien leider nicht jede Besonderheit im Abarbeitungsprotokoll von kommerziellen Testsystemen berücksichtigen oder unterschiedliche Arten von Ringversuchsprobenmaterial für bestimmte Testsysteme bereitstellen können.

Auf diesen Umstand wurde bereits bei früheren Ringversuchen mehrfach im Zusammenhang mit den RNA-Zielsequenzen der Hologic APTIMA COMBO 2 Testkits hingewiesen. Werden von Teilnehmern bestimmte NAT-Testsysteme eingesetzt, die erregerspezifische RNA-Zielsequenzen nachweisen oder auf einem RNA-basierten Amplifikationsprozess (TMA, Transcription-Mediated Amplification, o.ä.) beruhen, so kann mit dem hier versandten Probenmaterial offiziell keine regelgerechte Abprüfung der entsprechenden Sensitivitäten unter Routinebedingungen gewährleistet werden. Aber selbst wenn das Herstellungsverfahren unserer Ringversuchsproben primär nicht auf die Stabilisierung von RNA-Molekülen hin optimiert und getestet wurde, so konnten dennoch sowohl bei der aktuellen wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchsrunden von vielen Teilnehmern mit RNA-gestützten Testsystemen hohe Richtigkeitsquoten erzielt werden.

Aktuell wurden die C. trachomatis-Zielorganismen von allen 9 Teilnehmern mit RNA-basierten Hologic-Testsystemen in den drei CT-positiven Proben erfolgreich nachgewiesen. Auch in der stärker GO-positiven Probe # 2015301 gelang nahezu allen Teilnehmern mit RNA-basierten Hologic-Testsystemen der erfolgreiche Nachweis der Neisseria gonorrhoeae-Zielorganismen. Nur bei den beiden sehr schwach GO-positiven Proben # 2015303 und # 2015304 (in der zusätzlich noch relativ hohe Mengen an C. trachomatis enthalten waren) versagte der Nachweis bei Teilnehmern mit RNA-basierten Testsystemen. Da bei der Erteilung der Zertifikate ja bekanntermaßen ein falsches Ergebnis innerhalb der bewerteten Ergebnisse toleriert wird, werden auch diesmal allen 9 Teilnehmern die entsprechenden Zertifikate erteilt.

Entsprechende Inhibitionskontrollen wurden von nahezu allen der insgesamt 269 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal nicht mitgeteilt.

Bei den ermittelten Richtigkeitsquoten für Teilnehmer mit den GenProbe CT/NG, Roche COBAS Amplicor, COBAS TaqMan, dem Becton Dickinson ProbeTec, Abbott RealTime CT/NG, Artus CT, LightMix CT/NG oder anderen in den entsprechenden Tabellen 3 und 5 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 2–3 ) aufgeführten Testsystemen wird erneut eindrucksvoll deutlich, dass mit dem Großteil dieser kombinierten Testsysteme insgesamt erfreulich hohe Richtigkeitsquoten sowohl für die positiven als auch für die negativen Ergebnisse beobachtet werden konnten.

Anmerkung: Bevor durch einen kurzen Blick auf die prozentualen Richtigkeitsquoten in diesen Tabellen ein eventuell etwas zu voreiliger Rückschluss auf die diagnostische „Performance“ bestimmter kommerzieller Testsysteme gezogen wird, sollten erst die effektiven Teilnehmerzahlen berücksichtigt werden, die den dargestellten Richtigkeitsquoten arithmetisch zugrunde liegen.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: GenProbe CT/NG (3x), BD ProbeTec (4x), Abbott Alinty m (1x), AB Analytica (1x), BIORON (2x), HOLOGIC Panther (2x), Diagenode S-DiaCTNG/S-DiaCT/S-DiaGono (4x), Qiagen artus (3x), GenID STD (1x), EUROIMMUN EUROArray STI (4x), aprimeo Vivalytic STI (1x), VERSANT kPCR CTGC (1x), AID RDB 2111 (1x), AID Urethritis Panel (1x), Goffin Presto CT/NG Assay (1x), MIKROGEN ampliCube STD Panel 1 (6x), Anatolia Gene works (1x), eazyplex STD complete (1x), Sacace Biotechnologies C. trachomatis/N. gonorrhoeae Real-TM (7x), Immundiagnostik MutaPLEX (1x), AmpliSens C. trachomatis/N. gonorrhoeae-screen-FRT (2x), Fast Track DIAGNOSTICS FTD Urethritis panel (1x) und Stratagene Mx3005p (1x).

Unabhängig von der Art des verwendeten Testsystems soll in diesem Zusammenhang auch noch einmal darauf hingewiesen werden, dass in Gegenwart von relativ hohen Mengen an Zielorganismen (bzw. deren Nukleinsäure) die interne Kontrollreaktion aufgrund der „Konkurrenzsituation“ mit der Amplifikation der eigentlichen Zielsequenz durchaus negativ ausfallen kann, obwohl keine Inhibition der PCR-Reaktion im eigentlichen Sinne vorliegt.

Bei kombinierten Testsystemen (Stichwort: Multiplex-PCR) kann ja bekanntlich auch die Gegenwart des einen Erregers oder Zielorganismus in hoher Menge die Nachweisempfindlichkeit für den gleichzeitigen Nachweis des/der anderen Erreger oder Zielorganismen im Multiplex-Reaktionsansatz negativ beeinflussen. Bei bestimmten suboptimal abgestimmten PCR/NAT-Testsystemen könnte die kombinierte Zusammensetzung der positiven Proben des aktuellen Ringversuchs eine solche Problemkonstellation repräsentieren und in der Konsequenz die etwas schlechteren Richtigkeitsquoten für den Gonokokken-DNA-Nachweis erklären.

Das Probenset des aktuellen Ringversuchs enthielt diesmal eine Probe mit ca. 5x10⁴ IFU/mL an C. trachomatis (# 2015312), eine Probe mit ca. 1x10⁴ IFU/mL an C. trachomatis (# 2015314), eine Probe mit ca. 5x10³ IFU/mL an C. trachomatis (# 2015311), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 2015313), die ausschließlich nicht infizierte Zellen und Escherichia coli enthielt.

Wie Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 4) der statistischen Auswertung zu entnehmen ist, wurden von den insgesamt 59 Teilnehmern bei zwei der drei positiven Proben (#2015311 und # 2015312) diesmal durchwegs korrekte Ergebnisse mitgeteilt. Bei der dritten positiven Probe # 2015314, die im Vergleich zu den anderen beiden positiven Proben vergleichbare Mengen an C. trachomatis enthielt, wurden jedoch von zwei der insgesamt 59 Teilnehmer falsch-negative Resultate beobachtet. Bei der C. trachomatis-negativen Probe # 2015313 wurden diesmal von 3 der Teilnehmer falsch-positive Ergebnisse berichtet.

Die markante Übereinstimmung der aktuellen Ergebniskonstellation mit den Beobachtungen und hervorragenden Richtigkeitsquoten vorhergegangener Ringversuche mit ähnlicher Menge an C. trachomatis-Zielorganismen kann erneut als Beleg für eine hohe Zuverlässigkeit und Konstanz der eingesetzten Testsysteme sowie der aktuellen Kits und automatisierten Testplattformen zur Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Prozessierung angesehen werden.

Auch wenn mit ca. 5x10³ IFU/mL an Zielorganismen im Probenmaterial die untere Nachweisgrenze hochsensitiver und standardisierter PCR/NAT-gestützter Testsysteme noch nicht erreicht oder unterschritten sein sollte, sollten bei Ringversuchsteilnehmern mit hohem Anspruch an die individuelle Testsensitivität generell sowohl falsch-negative als auch falsch-positive Ergebnisse Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihres jeweiligen NAT-gestützten Testsystems geben. Angesichts der nach wie vor anhaltenden Diskussion um das „Pooling“ von entsprechendem Untersuchungsmaterial bleibt der Aspekt der analytischen Sensitivität der jeweils eingesetzten Testsysteme bedeutsam.

Inhibitionskontrollen wurden von 57 der insgesamt 59 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal nicht mitgeteilt. In diesem Zusammenhang sei kurz angemerkt, dass wir auch im aktuellen Ringversuch keine der Einzelproben absichtlich mit inhibitorischen Substanzen versetzt haben. Erfreulicherweise waren im Rahmen dieses Ringversuchs im Großen und Ganzen keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität und Spezifität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und den selbstentwickelten Inhouse-Testsystemen zu beobachten. Trotz der relativ geringen Menge an Zielorganismen bewegten sich die Richtigkeitsquoten dabei durchweg auf erfreulich hohem Niveau.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurden unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die folgenden Testkits aufgeführt: Roche COBAS CT (2x), Qiagen artus CT (1x), Abbott RealTime CT (1x), Sacace Biotechnologies C. trachomatis Real-TM (1x), Seegene Allplex STI Essential (1x), EUROIMMUN EUROArray STI (1x), Diagenode S-DiaCT (1x), HOLOGIC Aptima Combo 2 assay CT (1x), GenID STD (1x), Sansure Biotech (1x), AmpliSens C. trachomatis (1x), Meridian Bioscience (1x), Clonit C. trachomatis (1x) und Nuclear Laser Medicine C. trachomatis Real Time (1x).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt zwei positive Proben mit einer sehr hohen und einer etwa 10-fach geringeren Menge an Zielorganismen (# 2015323 mit 10⁶ CFU/mL und # 2015321 mit 10⁵ CFU/mL an B. pertussis), sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 2015322 und # 2015324), die lediglich E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielten.

Die Verfügbarkeit von offensichtlich inzwischen sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesystemen für den Nachweis von Bordetella pertussis-DNA führte auch diesmal wieder zu durchwegs hohen Richtigkeitsquoten sowohl bei den positiven als auch bei den negativen Proben. Lediglich von 2 der insgesamt 153 Teilnehmer wurde ein falsch-positives Ergebnis für die negative Probe # 2015322 und von 4 Teilnehmern für die negative Probe # 2015324 mitgeteilt. Hierbei handelt es sich offensichtlich um laborinterne Kontaminationsereignisse oder um Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung. Da diese Probe lediglich E. coli-Zellen enthielt, ist eine Kreuzreaktion aufgrund mangelnder Spezifität des eingesetzten PCR/NAT-Testsystems bei dieser Konstellation sehr unwahrscheinlich.

Überraschenderweise wurden diesmal auch zwei falsch-negative PCR/NAT-Ergebnisse für die doch relativ stark positive Probe # 2015323 (10⁶ CFU/mL an B. pertussis) mitgeteilt. Wie bereits bei den vorhergegangenen Ringversuchsauswertungen bei solchen Konstellationen erwähnt, sollten diese Ergebnisse den betroffenen Laboratorien Anlass geben, ihren individuellen diagnostischen Workflow hinsichtlich der Kontaminationssicherheit während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik zu überprüfen und gegebenenfalls zu optimieren.

Inhibitionskontrollen wurden von allen der insgesamt 153 Teilnehmer durchgeführt und Inhibitionsereignisse wurden dabei von keinem Teilnehmer beobachtet. In diesem Zusammenhang sei kurz angemerkt, dass wir auch im aktuellen Ringversuch keine der Einzelproben absichtlich mit inhibitorischen Substanzen versetzt haben.

Erfreulicherweise waren im Rahmen dieses Ringversuchs im Großen und Ganzen keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität und Spezifität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und den selbstentwickelten Inhouse-Testsystemen zu beobachten. Trotz der relativ geringen Menge an Zielorganismen bewegten sich die Richtigkeitsquoten dabei durchweg auf erfreulich hohem Niveau.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: MIKROGEN ampliCube Respiratory Bacterial Panel 2 (7x), Meridian Bioscience Alethia (4x), Hologic Panther Fusion Bordetella Assay (3x), Bio-Evolution RT PCR kit B. pert./parapert. (2x), Altona diagnostics RealStar Anthrax (3x), AmpliSens B. pert./parapert./bronch (2x), QUIDEL Solana Bordetella Complete Assay (2x), Ingenetix BactoReal B. pert./parapert. (2x), ARGENE Bordetella r-gene (2x), Sacace Biotechnologies B. pert./parapert./bronch. Real-TM (1x), AID RDB 2200 B. pertussis (1x), DiaSorin Liaison MDX (1x), BioFire FILMARRAY (1x), Luminex ARIES Bordetella Assay (1x), AusDiagnostics Respiratory Pathogens B (1x), PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x), Attomol Bordetella Realtime LT (1x), FOCUS Simplexa Bordetella Direct (1x), BD Max DNA MMK (1x), VIASURE Bordetella Real Time PCR Detection Kit (1x) und Bio-Speedy Real-Time PCR Detection Kit (1x).

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 7) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben in einer Art Verdünnungsreihe. Eine Probe mit einer sehr hohen Menge an Clarithromycin-resistenten H. pylori (# 2015332; ~5x10⁵ CFU/mL), eine mit ca. zehnfach geringerer Menge (# 2015331; ~5x10⁴ CFU/mL), eine Probe mit ca. hundertfach geringerer Menge (# 2015334, ~1x10³ CFU/mL), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 2015333), die nur humanes Zellmaterial und E. coli enthielt.

Erfreulicherweise wurden die beiden H. pylori-positiven Proben mit höherer Menge an Zielorganismen (# 2015331 und # 2015332) sowie die negative Probe # 2015333 von allen der insgesamt 51 Teilnehmer ausnahmslos korrekt befundet.

Lediglich bei der H. pylori-positiven Probe # 2015334 mit deutlich geringerer Menge an Zielorganismen zeigten sich 8 falsch-negative und ein als „fraglich“ klassifizierter Befund. Bei einer Menge von 1x10³ CFU/mL an H. pylori-Zielorganismen (entspricht ca. 1x10² CFU in dem für PCR-Untersuchungen typischerweise prozessierten Probenvolumen von 100 µl) nähert man sich offensichtlich der unteren Nachweisgrenze entsprechender Testsysteme an.

Aufgrund der relativ geringen Menge an Zielorganismen in Probe # 2015334 wurden die mitgeteilten Ergebnisse diesmal nicht in die Bewertung für die Zertifikate mit einbezogen. Dies ist auch durch die drei grau schraffierten Felder in Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 7) gekennzeichnet.

Wie bereits in den letzten Ringversuchen zeigte sich erneut die Verfügbarkeit gut evaluierter NAT-gestützter Analysesysteme mit hoher analytischer Sensitivität. Für das aktuelle Probenset wurden bei keinem der Teilnehmer, abgesehen von den Sensitivitätsproblemen einiger der verwendeten PCR/NAT-Assays, falsch-positive PCR/NAT-Ergebnisse durch Kreuzreaktionen o.ä. beobachtet. Inhibitionskontrollen wurden von allen 51 Teilnehmern durchgeführt, und von keinem Teilnehmer wurden Inhibitionsereignisse bei den 4 Einzelproben beobachtet.

Sowohl die kommerziellen als auch die eigenentwickelten Testsysteme schnitten im aktuellen Ringversuch wieder einmal erfreulich gut ab. So erreichten die Inhouse-Testsysteme wie auch die kommerziellen Assays bei den bewerteten drei Einzelproben eine Richtigkeitsqoute von 100%. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: Seegene Allplex H. pylori & ClariR Assay (3x), MOBIDIAG Amplidiag H. pylori + ClariR (2x), TIB Molbiol LightMix Helicobacter 23S Kit (3x), Sacace Biotechnologies H. pylori Real-TM (1x) und VIASURE H. pylori + Clarithromycin Real TM PCR kit (1x).

Wie in der Testbeschreibung des RV 533 vermerkt, konnten die Teilnehmer auf freiwilliger Basis auch die vermeintliche Clarithromycin-Resistenz der untersuchten H. pylori-Isolate mitteilen. Diese Spezialuntersuchung zur molekularbiologischen Resistenztestung erfolgt in der Regel über die Amplifikation und Sequenzierung von charakteristischen Bereichen, innerhalb der H. pylori 23S rDNA bzw. der Sequenzanalyse dieses Genombereichs, mittels Hybridisierungssonden. Ergebnisse wurden hier von 45 der insgesamt 51 Teilnehmer mitgeteilt, und mit Ausnahme von zwei Teilnehmern waren die mitgeteilten Ergebnisse der molekularen Resistenztestung auch durchweg korrekt.

Wie auch bereits bei den vorhergegangenen Runden dieses Ringversuchs mehrfach diskutiert, besteht die eigentliche Herausforderung bei dem Nukleinsäure-gestützten Nachweis von EHEC/STEC prinzipiell nicht so sehr im Nachweis sehr geringer Mengen an Zielorganismen, sondern vielmehr in der differenzierten Analyse und der Typisierung unterschiedlicher Shiga-Toxin-Gene und anderer putativer Pathogenitätsfaktoren (wie das für Intimin kodierende eae-Gen oder das für Enterohämolysin kodierende hlyA-Gen). Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt daher drei unterschiedliche EHEC-positive Proben: mit ca. 1x10⁵ CFU/mL (# 2015341: E. coli, stx₁-, stx₂-, eae-, hlyA- und O157-positiv und # 2015344: E. coli, stx₁-positiv) und mit ca. 5x10⁴ CFU/mL (# 2015343: E. coli, stx_2f- und eae-positiv). Die Probe # 2015342 enthielt diesmal nur einen „normalen“ E. coli K12-Stamm (eae-, hlyA-negativ).

Mit Ausnahme der Probe # 2015343 (stx_2f-positives EHEC-Isolat) führte die Verfügbarkeit von mittlerweile sehr gut etablierten NAT-gestützten Testsystemen und molekularbiologischen Differenzierungsstrategien für EHEC bei den restlichen drei Proben durchweg zu hohen Richtigkeitsquoten – sowohl für positive als auch für negative Befunde. Von 130 bzw. 131 der insgesamt 132 Teilnehmer wurden hier durchwegs korrekte Ergebnisse berichtet.

Angesichts der Probenkonstellation mit einer vorhergehenden stark positiven Probe könnte es sich bei den 2 falsch-positiven PCR-Resultaten für die negative Probe # 2015342 (mit eae- und hlyA-negativem E. coli K12-Stamm) eventuell um laborinterne Kontaminationsereignisse oder um Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung gehandelt haben. Aber das bleibt aus Sicht der retrospektiven Ringversuchsauswertung natürlich spekulativ.

Erfahrungsgemäß sind bei den üblicherweise eingesetzten PCR/NAT-Testsystemen auch gewisse „diagnostische Lücken“ aufgrund der mehr oder weniger stark ausgeprägten Sequenzheterogenität innerhalb der bisher bekannten Shiga-Toxin-Genvarianten zu erwarten. Dies wurde im aktuellen Ringversuch wieder einmal mit der Probe # 2015343 und dem darin enthaltenen stx_2f-positiven EHEC-Isolat bestätigt. Hier wurde lediglich von 79 der insgesamt 132 Teilnehmer ein positives Ergebnis für die Anwesenheit von Shiga-Toxin-Genen berichtet. Bei genauerer Analyse der mitgeteilten Test-Daten war auffällig, dass aus der Reihe von kommerziellen Testsystemen nicht alle Testkits die stx_2f-positive Probe # 2015343 problemlos nachweisen konnten. Anwender des TIB MolBiol Modular Kits und des r-Biopharm RIDAGENE EHEC Kits berichteten dagegen durchweg richtig positive EHEC-Ergebnisse für diese Probe.

Auch wenn die humanpathogene Relevanz von stx_2f-positiven EHEC-Isolaten in der Fachwelt nach wie vor umstritten ist, soll hier an einem Beispiel aus der mikrobiologischen PCR-Routinediagnostik wieder einmal die überraschende Vielfalt an möglichen Genkonstellationen im Umfeld von EHEC-Isolaten aufgezeigt werden. Der bisher einzige Nachweis eines stx_2f-positiven EHEC-Isolates in unserem Hause erfolgte aus einer Lebensmittelprobe, als im Zuge des EHEC-Ausbruchsgeschehens im Jahre 2011 umfangreiche Screeninguntersuchungen aus Stuhl-, Umwelt- und Lebensmittelproben durchgeführt wurden. In diesem Fall passte der stx_2f-Nachweis übrigens „anamnestisch“ hervorragend zu den bekannten Übertragungsrouten (Blattsalat aus Gewächshaus, das aus ökologischen Gründen mit Regenwasser aus der Dachrinne bewässert wurde; das Dach dieses Gewächshauses war ein beliebter Rastplatz für die Bewohner von umliegenden Taubenkobeln…). Zur Thematik der „stx_2f-positiven E. coli-Isolate“ sind inzwischen auch zahlreiche wissenschaftliche Arbeiten veröffentlicht worden. Exemplarisch sei hier auf eine Publikation des RKI in Wernigerode aus dem Jahre 2009 verwiesen [1].

Anmerkung an die Teilnehmer des aktuellen Ringversuchs: bitte keine Angst um die Zertifikate, denn diese Probe wurde natürlich als „edukative Probe“ deklariert und die entsprechenden Ergebnisse daher bei der offiziellen Bewertung zur Erteilung von Ringversuchszertifikaten außen vor gelassen.

Da in den meisten der teilnehmenden Laboratorien ein NAT-gestützter Nachweis von Shiga-Toxin-Genen im Umfeld der EHEC-Diagnostik primär als Kulturbestätigungstest eingesetzt wird, werden bei zukünftigen Ringversuchen auch die meisten der positiven Proben wieder relativ hohe Mengen an Zielorganismen enthalten, und der Schwerpunkt bleibt auf der Abprüfung der analytischen Spezifität der eingesetzten Testsysteme und weniger auf der dabei erzielten unteren Nachweisgrenze.

Neben der erfreulicherweise stark ansteigenden Zahl an kommerziellen Testsystemen mit guter „Performance“ gab ein Drittel der Teilnehmer nach wie vor die Verwendung von selbstentwickelten oder „anderen“ kommerziellen Testsystemen mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von EHEC an, und bei keiner der ausgesandten Proben wurden signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Zudem wurden von 115 der insgesamt 132 Teilnehmer die Ergebnisse der molekulargenetischen Shiga-Toxin-Subtypisierung sowie des gezielten Nachweises von Intimin (eae)- und/oder Enterohämolysin (hlyA)-Genen mitgeteilt. Wenn auch die Typisierung nicht immer vollständig durchgeführt wurde, so waren diese Angaben zur Typisierung, zumindest im mitgeteilten Umfang, großteils korrekt.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: Altona diagnostic RealStar EHEC PCR Kit (3x), Amplex eazyplex EHEC complete (2x), BioMerieux BioFire GI Panel (3x), Seegene Allplex GI-EB Screening (1x), Amplex eazyplex EHEC classic plus und eazyplex EHEC basic (1x), MIKROGEN ampliCube Gastrointestinal Bacterial Panel 2 (1x), AmpliGnost Verotoxin 1/2 (Differenzierung) PCR Kit (1x), Fast Track Diagnostics (1x), Mast Group Mast Isoplex VTEC-Kit (1x) und OptiGene Isothermal Master Mix (1x).

Nachdem die Probenauswahl des letzten Ringversuchs mehr auf die analytische Spezifität der eingesetzten Testsysteme abzielte, wollten wir uns im aktuellen Ringversuch wieder einmal auf die Prüfung der analytischen Sensitivität fokussieren. Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt somit eine Probe mit einer relativ hohen Menge an Borrelia burgdorferi sensu stricto (# 2015351, ~5x10⁵ Organismen/mL), eine Probe mit einer etwa zehnfach geringeren Menge (# 2015353, ~5x10⁴ Organismen/mL), eine Probe mit einer etwa hundertfach geringeren Menge (# 2015352, ~5x10³ Organismen/mL) an Borrelia burgdorferi sensu stricto, sowie eine Probe ohne Zielorganismen, die einen E.coli K12-Stamm enthielt (# 2015354).

Die Detektion von Borrelia burgdorferi sensu stricto in den beiden Proben mit relativ hoher Erregerlast (# 2015351 und # 2015353) bereitete dem Großteil der Teilnehmer keinerlei Probleme, sodass für beide Proben durchwegs richtig-positive Ergebnisse beobachtet wurden. Wie zu erwarten und auch im Rahmen der vorhergehenden Ringversuche stets zu beobachten war, werden mit abnehmender Erregerlast deutlich mehr falsch-negative Ergebnisse beobachtet. So konnten diesmal 3 der insgesamt 114 Teilnehmer bei der relativ schwach positiven Probe # 2015352 (~5x10³ Organismen/mL an Borrelia burgdorferi sensu stricto) mit ihren PCR/NAT-Testsystemen keine Borrelien-DNA mehr nachweisen.

Hier nur kurz zum Vergleich: bei einer ähnlichen Probenkostellation wurden in der Ringversuchsrunde November 2015 bei der Probe mit einer Erregerlast von ~5x10³ Organismen/mL noch von ca. 10% der Teilnehmer falsch-negative PCR/NAT-Ergebnisse berichtet. Erfreulicherweise scheint sich die analytische Sensitivität der Borrelien-spezifischen PCR/NAT-Testsysteme über die Jahre also deutlich verbessert zu haben.

Interne oder externe Inhibitionskontrollen wurden von allen 114 Teilnehmern mitgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse der PCR-Reaktion wurden im Rahmen dieser Ringversuchsrunde von keinem Teilnehmer beobachtet.

Wie bei den vorhergehenden Ringversuchsrunden haben auch diesmal wieder ungefähr knapp die Hälfte der Teilnehmer selbstentwickelte (Inhouse-)Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von Borrelien-DNA verwendet; kommerzielle Testsysteme wurden von 69 der 114 Teilnehmer eingesetzt.

Nicht zuletzt aufgrund der hohen Richtigkeitsquote waren im Rahmen dieses Ringversuchs auch keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und der – zumindest aus methodischer Sicht – relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (Inhouse-)Testsystemen zu beobachten.

Darüber hinaus wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: Ingenetix BactoReal B. burgdorferi (3x), Gerbion Diarella Borrelia (1x), Elisabeth Pharmacon EliGene Borrelia RT (1x) und Demeditec GenFlow Borrelia plus PCR (1x).

Wie schon beim letzten Mal hier vorab nochmals der Hinweis: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Legionella pneumophila aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Er ist daher nicht für die Abprüfung von immunologischen Direktnachweisverfahren wie L. pneumophila SG1 Urin-Antigen-Testen o.ä. geeignet. Einzelne Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets können daher typischerweise auch relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von L. pneumophila-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine sehr stark positive Probe # 2015361, die mit einer Menge von ca. 10⁵ CFU/mL an Legionella pneumophila Serogruppe 14 versetzt war, sowie eine Probe mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 2015363, ca. 10⁴ CFU/mL) an Legionella pneumophila Serogruppe 1. Die Probe # 2015364 des aktuellen Sets enthielt ca. 5x10⁴ CFU/mL an Legionella bozemanii. Die zweite „negative“ Probe # 2015362 des aktuellen Probensets enthielt neben humanem Zellmaterial lediglich E. coli.

Die relativ hoch positive Probe # 2015361 des aktuellen Sets wurde erfreulicherweise von allen 120 Teilnehmern als positiv für Legionella pneumophila-DNA befundet, und bei der etwa 10-fach schwächer positiven Probe # 2015363 berichtete lediglich ein Teilnehmer ein falsch-negatives Ergebnis. Auch bei der negativen Probe # 2015362 wurden diesmal erfreulicherweise keine falsch-positiven Ergebnisse beobachtet.

Die mit Legionella bozemanii (~5x10⁴ CFU/mL) versetzte Probe wurde von 109 Teilnehmern mit L. pneumophila-spezifischen PCR-/NAT-Testsystemen korrekterweise als negativ befundet. Drei Teilnehmer berichteten hier ein falsch-positives Ergebnis für Legionella pneumophila-DNA, was auf eine Kreuzreaktion bzw. mangelnde Speziesspezifität der Zielsequenz zurückzuführen sein dürfte. Bei der Interpretation der Daten in Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 10) ist zu berücksichtigen, dass 8 der 11 Teilnehmer mit positivem Ergebnis bei Probe # 2015364 die Verwendung des ampliCube Respiratory Bacterial Panels der Fa. Mikrogen angegeben haben – dieses Testsystem detektiert jedoch unseres Wissens nach lediglich Legionella spp.

Vor allem Inhouse-Realtime-PCR-Protokolle mit ribosomalen Zielsequenzen zeigten in der Vergangenheit immer wieder Probleme bei der Speziesspezifität. Bei Verwendung von nested Block-Cycler PCR-Protokollen zur Amplifikation von spezifischen Bereichen der 16S rDNA und anschließender DNA-Sequenzierung sollte jedoch der Fehler eher auf Anwenderseite gesucht werden (beispielsweise Kontaminationsereignisse bei der Probenaufbereitung und -abarbeitung), da dieses Testkonzept in jedem Fall die Unterscheidung der Spezies erlauben sollte. Da die damit erzielten Ergebnisse hinsichtlich der Anwesenheit von Legionella spp. ja prinzipiell korrekt waren, werden wir ein auf den „Nachweis von Legionella spp. auf Genusebene“ eingeschränktes Zertifikat erwägen.

Insgesamt sprechen die Ergebnisse für die gute Sensitivität der verwendeten Testsysteme. Die allenfalls vereinzelt berichteten falsch-negativen Ergebnisse beruhen vermutlich eher auf anwendungstechnischen Problemen als auf unzureichender analytischer Sensitivität.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs kamen bei insgesamt 91 Teilnehmern kommerzielle NAT-Testsysteme für den Nachweis von L. pneumophila-DNA im Untersuchungsmaterial zum Einsatz. Signifikante Unterschiede bezüglich der analytischen Sensitivität zwischen kommerziellen und selbstentwickelten Testsystemen (von 29 Teilnehmern verwendet) fanden sich nicht. Inhibitionskontrollen wurden von allen der 120 Teilnehmer durchgeführt, wobei von keinem der Teilnehmer ein signifikantes Inhibitionsereignis in den Einzelproben des aktuellen Probensatzes beobachtet wurde.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testskits aufgeführt: MIKROGEN ampliCube Respiratory Bacterial Panel 1(7x), BioFire FILMARRAY Pneumonia Panel (3x), BioGx Atypical pneumonia (4x), Fast Track Diagnostics FTD Atypical CAP (1x), Diagenode Legionella real time PCR Kit (1x), Gerbion diarella Legionella real time PCR Kit TM (1x), Ingenetix Bacto Real L. pneumophila (2x), Biolegio Atypical Pneumonia-1 Assay (2x), ReadyMax B-CAP Assay (1x), Luminex Respiratory Pathogen Panel Multiplex (2x), Seegene Allplex PneumoBacter Assay (1x), ARGENE Legio pneumo/Cc r-gene (3x), BD Max (1x), AnDiatec Quidel L. pneumophila (1x), ELITechGroup L. pneumophila Q-PCR Alert Amplimix (1x), Euroclone Duplica Real Time L. pneumophila Detection Kit (1x) und Sacace Biotechnologies L. pneumophila Real-TM (1x).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt eine Probe mit einer relativ hohen Menge an Salmonella enterica ser. Typhimurium (# 2015371; ~1x10⁵ CFU/mL), eine Probe mit dem gleichen Isolat in einer etwa zehnfach geringeren Menge (# 2015372, ~1x10⁴ CFU/mL), und zwei Proben ohne Zielorganismen (# 2015373 und # 2015374), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Die Verfügbarkeit von spezifischen und mittlerweile gut evaluierten selbstentwickelten bzw. kommerziellen NAT-gestützten Analysesystemen führte diesmal bei allen 4 Proben des Ringversuchssets zu sehr hohen Richtigkeitsquoten. Vergleichbar mit der guten Ergebnislage bei manch früheren Salmonella enterica PCR/NAT-Ringversuchen, war diesmal nur ein falsch-negatives Ergebnis bei der etwas schwächer positiven Probe # 2015372 zu beobachten.

Das Fehlen von falsch-positiven Ergebnissen deutet wieder einmal auf eine verbesserte Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden diagnostischen Laboratorien hin. Hoffentlich bestätigt sich diese erfreuliche Beobachtung auch in den zukünftigen Ringversuchsrunden.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: Seegene Allplex GI-Bacteria (I) Assay (3x), Seegene Allplex GI-EB Screening (2x), Fast Track Diagnostics FTD Bacterial gastroenteritis(1x), MIKROGEN ampliCube Gastrointestinal Bacterial Panel 1 (1x), eazyplex TyphiTyper (1x) und r-Biopharm SureFast Salmonella PLUS (1x).

In enger Abstimmung mit unserem Sollwert-Laboratorium (Dr. U. Messelhäußer, Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Oberschleißheim) werden wir weiterhin versuchen, ab und an ein etwas exotischeres Serovar von Salmonella enterica zu versenden und zumindest eine der 4 Proben mit einer relativ geringen Menge an Zielorganismen zu versetzen – auch wenn im Rahmen der gesetzlichen Vorschriften und/oder Richtlinien der einzelnen Fachgesellschaften derzeit noch keine genauen unteren Nachweisgrenzen für den NAT-gestützten Salmonellen-Nachweis festgelegt wurden.

Neben der wohl prominentesten Spezies Listeria monocytogenes sind auch eine Reihe weiterer Listerienspezies bekannt, für die inzwischen auch einige selbstentwickelte und kommerzielle NAT-gestützte Nachweisverfahren zur Verfügung stehen. Auch wenn diese Spezies (mit Ausnahme von L. ivanovii) zumeist nicht von humanpathogener Relevanz sind, werden wir uns bei der Konzeption des Probenmaterials für RV 538 vor allem zur Abprüfung der Spezifität individueller Testsysteme nicht nur auf L. monocytogenes beschränken.

Daher werden, wie in dieser Ringversuchsrunde, auch andere Listerienspezies in der einen oder anderen Probe zu finden sein – so wie im Fall der Probe # 2015384, die diesmal ca. 1x10⁴ CFU/mL an Listeria ivanovii enthielt. Probe # 2015381 des aktuellen Sets enthielt eine relativ hohe Menge an L. monocytogenes (ca. 1x10⁵ CFU/mL), die erfreulicherweise von nahezu allen der insgesamt 42 Teilnehmer korrekt erfasst wurde.

Zur Abprüfung von möglichen Kreuzreaktivitäten wurde in der aktuellen Ringversuchsrunde auch eine der 4 Proben (# 2015382) mit einer nennenswerten Menge an Streptococcus pneumoniae versetzt. Hier zeigte sich lediglich bei einem der insgesamt 42 Teilnehmer ein falsch-positives Ergebnis, das vermutlich eher durch Kontaminationsereignisse aus der Probe „1“ als durch analytische Kreuzreaktionen mit den eingesetzten Listeria spp.- oder L. monocytogenes-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen verursacht worden war.

Erfreulicherweise wurde auch die Probe # 2015383, welche ausschließlich humanes Zellmaterial und E. coli enthielt, von allen Laboratorien korrekterweise als „negativ“ befundet, was erneut für eine sehr gute Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden Laboratorien spricht.

Wie bereits in vorangegangenen Ringversuchsrunden wurden von den Teilnehmern ganz überwiegend Listeria monocytogenes-spezifische Testsysteme eingesetzt (n=38). Dies spiegelte sich auch in der Ergebniskonstellation bei Probe # 2015384 wider, die diesmal eine signifikante Menge an L. ivanovii (1x10⁴ CFU/mL) enthielt. Fünf der insgesamt 42 Teilnehmer mit explizit Listeria spp.-spezifischen Testsystemen berichteten diese Probe korrekt als positiv. Im Umkehrschluss spricht diese Datenlage jedoch für eine erfreulich hohe Spezifität der eingesetzten L. monocytogenes-spezifischen Testsysteme. Bei diesem Ringversuch besteht nämlich explizit die Option einer differenzierten Befundmitteilung: Hält ein Teilnehmer lediglich ein L. monocytogenes-spezifisches NAT-Verfahren vor, so kann er dies im Online-Ergebnisformular spezifizieren, und für die Erstellung des individuellen Zertifikats seitens INSTAND e.V. werden dann auch nur die L. monocytogenes-spezifischen Ergebnisse zur Bewertung herangezogen.

Von allen 42 Teilnehmern wurden Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen verwendet. Vermeintliche Inhibitionsereignisse bei der Aufarbeitung und Analyse der Ringversuchsproben wurden nicht beobachtet.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: Progenie RealCycler L. monocytogenes (3x), Amplex eazyplex CSF direct (2x), Liferiver L. monocytogenes Real Time PCR Kit (1x), Sacace Biotechnologies L. monocytogenes Real-TM (2x), Seegene Allplex Meningitis-B Assay (1x), AmpliSens L. monocytogenes (1x), BioGx (1x) und QIAGEN mericon Listeria spp Kit (1x).

Zuerst einmal, wie gehabt, eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für den Direktnachweis von MRSA-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise Nasen- oder Wundabstrichen) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen an entsprechenden Zielorganismen. Für interessierte Teilnehmer soll an dieser Stelle noch einmal explizit darauf hingewiesen werden, dass sich mit Testsystemen, die üblicherweise für die Kulturbestätigung von S. aureus und/oder MRSA ausgelegt sind, diese geringen Mengen nicht immer zuverlässig nachweisen lassen werden. Eine Teilnahme an diesem Ringversuch ist daher nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von MRSA etabliert haben bzw. im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Nach den zugegebenermaßen etwas umfangreichen und ausführlichen Diskussionen der Ergebniskonstellationen vorhergegangener MRSA-Ringversuche kann die Auswertung des aktuellen Ringversuchs wieder einmal erfreulich kurz gehalten werden. Da wir diesmal, abgesehen von einem „interessanten“ mecC-positiven MRSA-Isolat und einer Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies (eine Konstellation die in der täglichen Praxis nicht gerade selten beobachtet wird), keine besonders „schwierigen“ oder komplexen Probenkonstellationen versandt haben, wurden von den insgesamt 281 Teilnehmern mit ihren unterschiedlichsten NAT-gestützten Testsystemen nahezu durchweg korrekte PCR-Ergebnisse für 3 der insgesamt 4 Proben des aktuellen Panels berichtet.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 13) der statistischen Auswertung dargestellt, enthielt die Probe # 2015391 diesmal ein Gemisch aus einem S. aureus-Isolat (MSSA, PVL-negativ, ~10⁵ CFU/mL) und einer Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies (S. epidermidis, mecA-positiv, ~10⁵ CFU/mL), die Probe # 2015393 ein typisches MRSA-Patientenisolat (MRSA, PVL-negativ, ~5x10⁴ CFU/mL) und Probe # 2015392 eine relativ hohe Menge eines mecC-positiven Methicillin-resistenten S. aureus-Patientenisolats (MRSA, PVL-negativ, spa: spa:t10009, ~5x10⁵ CFU/mL). Die letzte der 4 Proben, # 2015394, enthielt neben humanem Zellmaterial lediglich eine nennenswerte Menge an E. coli.

Erfreulicherweise wurden im aktuellen Ringversuch bei der positiven MRSA-Probe # 2015393 von nahezu allen der 281 Teilnehmer durchweg korrekt-positive PCR/NAT-Ergebnisse mitgeteilt. Der technische oder methodische Hintergrund der 3 falsch-negativen und des einen als „fraglich“ klassifizierten Ergebnisses bei dieser Probe ist seitens des Ringversuchsleiters nicht näher zu ergründen. Möglicherweise wurden von diesen Teilnehmern, die die Verwendung von kommerziellen und zum Teil auch geschlossenen, sog. Kartuschen-Tests, angaben, Fehler bei der Probenvorbereitung oder -abarbeitung gemacht. Angesichts der mit 5x10⁴ CFU/mL ehrlicherweise nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollten falsch-negative Ergebnisse bei Probe # 2015393 den betroffenen Ringversuchsteilnehmern durchaus Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihrer entsprechenden NAT-gestützten Testsysteme geben.

Im Vergleich zu früheren Ringversuchen mit vergleichbarer Probenkonstellation wurde bei Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies in Probe # 2015391 diesmal eine erfreulicherweise hohe Richtigkeitsquote erzielt. Von 252 der insgesamt 281 Teilnehmer wurde dieses Gemisch mit den jeweils eingesetzten Testsystemen korrekt als „MRSA-negativ“ befundet, weitere 8 Teilnehmer haben ihr Ergebnis bei dieser Probe als „fraglich“ klassifiziert. Von 5 dieser 8 Teilnehmer mit fraglichem Befund wurde explizit die Verwendung eines PCR-Testsystems angegeben, das auf einer getrennten Erfassung von S. aureus-spezifischen Markern und dem mecA-Gen beruht. Da mit dieser Art von Testsystemen zwar die Anwesenheit des mecA-Gens nachgewiesen werden kann, dessen Herkunft aber nicht zweifelsfrei dem Genom der ebenfalls nachgewiesenen S. aureus- und/oder der Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies zugeordnet werden kann, ist in diesem Fall „fraglich“ auch das wissenschaftlich korrekte Untersuchungsergebnis.

Die restlichen Teilnehmer berichteten bei dieser Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies falsch-positive Ergebnisse für MRSA. Diesen 21 Teilnehmern mit falsch-positivem Ergebnis für Probe # 2015391 ist dringend anzuraten, ihre Testsysteme zu überprüfen bzw. die methodische Eignung ihres jeweiligen Testkonzepts zu hinterfragen. In der mikrobiologischen Praxis wird relativ häufig die gleichzeitige Anwesenheit einer Methicillin-resistenten (also mecA-positiven) Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies und eines Methicillin-empfindlichen (also mecA-negativen) S. aureus-Isolates im entsprechenden Abstrichmaterial beobachtet. In diesem Fall würden die Testsysteme der letztgenannten 21 Teilnehmer vermutlich fälschlicherweise einen Hinweis auf das Vorliegen einer MRSA-Infektion bzw. -Besiedelung anzeigen (mit allen hinlänglich bekannten Konsequenzen für den betroffenen Patienten!). Wenn man sich die entsprechenden Richtigkeitsquoten für Probe # 2015391 in Tabelle 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 14) nach Testkonzepten differenziert betrachtet, dann wird ersichtlich, dass zumindest alle der derzeit etablierten SCCmec-basierten Testsysteme bei diesem Gemisch korrekterweise MRSA-negative Befunde liefern (da das S. aureus-Genom der MSSA-Komponente ja de facto keine integrierte SCCmec-Kassette aufweist). Die Gründe für einzelne „Ausreißer“ sollten dabei eher auf Seiten der Testdurchführung in den betroffenen Laboratorien gesucht werden und nicht auf Seiten des Testkonzepts oder der präkonfektionierten PCR-Testkits.

Die augenscheinlich „schlechte Datenlage“ bei der MRSA-positiven Probe # 2015392 ist bei näherer Betrachtung schnell erklärt. Hier handelt es sich um ein S. aureus-Patientenisolat, dessen phänotypische Oxacillin-Resistenz nicht über die Anwesenheit des „üblichen“ mecA-Gens sondern vielmehr über das mecC-Gen kodiert bzw. vermittelt wird. In den letzten Jahren wurden solche MRSA-Stämme in der Patientenversorgung mittlerweile zwar mehrfach, jedoch nach wie vor noch relativ sporadisch beobachtet. Es sind Oxacillin-resistente S. aureus-Isolate, die auf Gesamtgenom-Ebene alle üblicherweise verwendeten S. aureus-Speziesmarker aufweisen, sich in der SCCmec-orfX-Region aber auf Sequenzebene von den „typischen“ MRSA-Isolaten deutlich unterscheiden und zusätzlich noch anstatt des „populären“ mecA-Gens ein resistenzvermittelndes mecC-Gen mit stark abweichender Gensequenz tragen. Bei den mit diesem mecA-Homolog ausgestatteten Bakterienisolaten erfolgt die Integration des mecC-Gens innerhalb einer neuartigen SCCmec-Genkassette vom Typ XI in das S. aureus-Genom (selbst auf Aminosäureebene weisen das mecA- und mecC-Genprodukt eine Homologie von weniger als 63% auf). Diese signifikanten Sequenzunterschiede führen noch bei einigen kommerziellen oder Inhouse-SCCmec-basierten PCR-Testsystemen, die nicht auf die speziellen Gensequenzen des mecC-Gens hin optimiert wurden, zwangsläufig zur „Nichterkennung“ solcher mecC-positiven MRSA-Isolate. Das MRSA-Isolat in Probe # 2015392 konnte daher (erwartungsgemäß) nur von Teilnehmern mit speziell auf dieses „neue“ Methicillin-Resistenzgen abgestimmten Testsystemen detektiert werden. Auch wenn solche mecC-positiven MRSA-Isolate derzeit zumindest in unseren Breiten noch sehr selten nachgewiesen werden, so soll mit der Mitführung dieses Isolats bei den Teilnehmern und innerhalb der Leserschaft dieser Ringversuchsdiskussion zumindest das Bewusstsein für das mögliche Vorkommen solcher mecC-positiven MRSA-Isolate geweckt werden. Derzeit beschränkt sich der Nachweis von mecC-positiven MRSA-Isolaten (methoden- oder prävalenzbedingt) noch auf einige wenige Einzelfälle. Inwieweit jedoch die Entwicklung und das zusätzliche Mitführen von mecC-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen erforderlich sein wird, kann sich erst im Rahmen zukünftiger systematischer Prävalenzstudien zeigen. Aufgrund des derzeit noch sehr seltenen Auftretens mecC-positiver MRSA-Isolate wurden die mitgeteilten Ergebnisse diesmal nicht in die Bewertung für die Zertifikate mit einbezogen. Dies ist, wie gehabt, durch die drei grau schraffierten Felder in Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 13) gekennzeichnet.

Bei der Probe ohne Zielorganismen (# 2015394), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt, wurde im Rahmen des aktuellen Ringversuchs nur von drei der 281 Teilnehmer ein falsch-positives MRSA-Ergebnis beobachtet. Dabei liegt das Auftreten eines sporadischen laborinternen Kontaminationsereignisses oder einer Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung nahe. Solche „Ausreißer“ sind bei technisch aufwendigen Ringversuchen mit nahezu 300 Teilnehmern nichts Ungewöhnliches und bedürfen unseres Erachtens keiner weiteren Diskussion.

Insgesamt bleibt festzuhalten, dass der erfreulich große Anteil von richtig-positiven Ergebnissen bei der einen positiven Probe und die überwiegend richtig-negativen Befunde bei den 2 MRSA-negativen Proben erneut für ein hervorragendes Funktionieren von test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminations- und Verschleppungsereignissen spricht.

Abgesehen von der besagten Probe mit dem mecC-positiven MRSA-Isolat spricht die Ergebnislage dieses Ringversuchs erneut für eine hohe Zuverlässigkeit des NAT-gestützten Direktnachweises von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial. Für Kolleginnen und Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen interessiert sind, stehen mit den Proben dieses Ringversuchs wieder standardisierte Rückstellproben zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Optional wird im Rahmen unserer Ringversuchsreihe auch der molekulargenetische Nachweis des putativen Pathogenitätsfaktors PVL (Panton-Valentine-Leukozidin) bzw. dessen kodierende Gene lukF/S-PV abgefragt. Entsprechende (PVL-negative) Ergebnisse der molekularbiologischen PVL-Testung wurden von 87 der insgesamt 281 teilnehmenden Laboratorien mitgeteilt, und mit Ausnahme eines Teilnehmers waren diese diesmal durchweg korrekt. Nähere Informationen zu der nach wie vor hochaktuellen cMRSA- bzw. CA-MRSA-Problematik finden sich beispielsweise in Linde et al. [2] und Witte et al. [3]. Ein gut evaluiertes Realtime-PCR-Protokoll für den gezielten Nachweis von PVL-positiven S. aureus-Isolaten findet sich beispielsweise in Reischl et al. [4]. Mittlerweile sind auch schon einige kommerzielle Realtime-PCR-Testsysteme für den zuverlässigen molekulargenetischen Nachweis von PVL-Genen bei MRSA- und MSSA-Isolaten verfügbar.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: Immundiagnostik MutaPlex MRSA (3x), Hologic Panther Fusion MRSA Assay (2x), BD Max StaphSR assay Kit (1x), BD Max MRSA XT (1x), MIKROGEN alphaCube MRSA (1x), Gerbion (1x), GenID MRSA combi (1x), GeneProof MRSA PCR Kit (1x), GenomEra MRSA/SA Multi Swab (1x) und ELITechGroup MRSA/SA Kit (1x).

Eine wichtige Anmerkung wie immer vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Chlamydia pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von C. pneumoniae-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 15) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal eine Probe mit einer relativ hohen Menge an entsprechenden Zielorganismen (# 2015402, Chlamydia pneumoniae, ~5x10⁵ IFU/ml) und eine Probe mit etwa hundertfach geringerer Menge (# 2015403, Chlamydia pneumoniae, ~1x10⁴ IFU/ml), eine Probe mit ca. ~1x10⁵ CFU/mL an Haemophilus influenzae (# 2015404), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 2015401), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Aus den in Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 15) aufgeführten Daten ist ersichtlich, dass im aktuellen Ringversuch erfreulicherweise alle der insgesamt 138 Teilnehmer die C. pneumoniae-Zielorganismen in der sehr stark positiven Probe # 2015402 (ca. 5x10⁵ IFU/mL) und in der 50-fach schwächer positiven Probe # 2015403 (ca. 1x10⁴ IFU/mL) sicher und zuverlässig nachweisen konnten.

Für die beiden Proben ohne C. pneumoniae-Zielorganismen # 2015401 (E. coli) und # 2015404 (Haemophilus influenzae) ist im Vergleich zu den vorhergegangenen Ringversuchen die Anzahl falsch-positiver Befunde erneut deutlich zurückgegangen. Bei diesen beiden Proben fand sich lediglich ein Teilnehmer, der die Haemophilus influenzae-positive Probe fälschlicherweise als positiv für C. pneumoniae-DNA bewertet hat. Hierbei dürfte es sich aber am ehesten um ein laborinternes Kontaminationsereignis bzw. eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung gehandelt haben. Systematische Kreuzreaktivitäten der mitterweile gut etablierten und evaluierten C. pneumoniae-spezifischen PCR/NAT-Testsysteme mit DNA von H. influenzae erscheinen aus methodischer Sicht eher als unwahrscheinlich.

Diesmal wiesen nahezu alle der von den Teilnehmern eingesetzten Testsysteme oder PCR/NAT-Protokolle die im Rahmen der regulatorischen Vorgaben geforderten Inhibitionskontrollen auf; eine nennenswerte Inhibition wurde aktuell von keinem der Teilnehmer berichtet.

Selbstentwickelte Inhouse-PCR/NAT-Testsysteme zur Detektion von C. pneumoniae-DNA wurden von 36 Laboratorien eingesetzt, von den restlichen 102 Teilnehmern wurde die Verwendung von kommerziellen Assays aufgeführt.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: AmpliSens M. pneumoniae/C. pneumoniae FRT PCR (4x), Seegene PneumoBacter assay (1x), Fast Track Diagnostics FTD Atypical CAP Kit (1x), BioGx atypical pneumonia (5x), MIKROGEN ampliCube Respiratory Bacterial Panel 1 (9x), Luminex NxTAG Respiratory Pathogen Panel (2x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (2x), Sacace Biotechnologies M. pneumoniae/C. pneumoniae Real-TM (4x), Ingenetix Bacto Real C. pneumoniae (2x), ARGENE Chla/Myco pneumo r-gene (4x), BioFire FILMARRAY respiratory Panel (3x), Eazyplex PneumoBug expert (1x), RespiFinder (1x), Euroclone Duplica Real Time C. pneumoniae Kit (1x) und AusDiagnostics Atypical Pneumonia MT-PCR (2x).

Aufgrund zahlreicher Rückfragen von Teilnehmern des vergangenen Ringversuchs hier eine wichtige Anmerkung vorab: der Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Mycoplasma pneumoniae ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Mycoplasma pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut, wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial, konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 16) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal zwei positive Proben: Probe # 2015411 mit einer hohen Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~5x10⁵ Genomkopien/mL) und Probe # 2015414 mit einer etwa hundertfach geringeren Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~5x10³ Genomkopien/mL). Um zur Abwechslung auch einmal die analytische Spezifität der M. pneumoniae-spezifischen PCR/NAT-Testsysteme abzuprüfen, enthielt Probe # 2015413 diesmal eine nennenswerte Menge an Chlamydia pneumoniae. Im Ringversuchsprobenset befand sich auch eine weitere Probe ohne Zielorganismen (# 2015412), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen in der üblichen Matrix enthielt.

Alle bis auf zwei der insgesamt 160 Teilnehmer konnten die DNA der M. pneumoniae-Zielorganismen in der relativ stark positiven Probe # 2015411 problemlos und zuverlässig nachweisen. Bei der etwa hundertfach schwächer positiven Probe # 2015414 (ca. 5x10³ Genomkopien/mL) gelang diesmal nur noch 154 Teilnehmern der erfolgreiche Nachweis von M. pneumoniae-DNA. Fünf Teilnehmer berichteten hier ein negatives Ergebnis, und einer klassifizierte sein PCR/NAT-Ergebnis als „fraglich“ (dieser Teilnehmer berichtete übrigens bei bei allen 4 Proben ein fragliches Ergebnis und wir konnten ihm leider kein Zertifikat erteilen).

Bei den betroffenen Laboratorien sollte dies zum Anlass genommen werden, die Sensitivität des verwendeten Testsystems sowie gegebenenfalls die Prozesse der Probenaufarbeitung zu evaluieren.

Bei den beiden Proben # 2015413 (mit nennenswerten Mengen an Chlamydia pneumoniae) und # 2015412 (die „nur“ E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt) wurden jeweils von 153 Teilnehmern korrekt-negative Ergebnisse mit ihren jeweiligen M. pneumoniae-spezifischen Testsystemen beobachtet. Bei den je 6 falsch-positiven Ergebnissen für letztere beide Einzelproben handelt es sich entweder um laborinterne Kontaminationsereignisse, um eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung oder um Kreuzreaktivitäten, die möglicherweise in der Verwendung von Testsystemen mit unzureichender Spezies-Spezifität begründet sind. Daher sollten vor allem diejenigen Teilnehmer mit falsch-positiven Ergebnissen bei der Probe mit Haemophilus influenzae versuchen, die analytische Spezifität ihrer jeweiligen NAT-Testsysteme zu überprüfen und gegebenenfalls nachzubessern.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs wurde von 119 Teilnehmern die Verwendung von kommerziellen Testkits aufgeführt und gravierende Unterschiede in den Richtigkeitsquoten von kommerziellen Testsystemen und Inhouse-Assays waren, soweit in den entsprechenden Angaben ersichtlich, nicht auffällig.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: MIKROGEN ampliCube Respiratory Bacterial Panel 1 (9x), Meridian Bioscience Alethia Mycoplasma direct (8x), Sacace Biotechnologies M. pneumoniae/C. pneumoniae Real-TM (4x), AmpliSens M. pneumoniae/C. pneumoniae FRT PCR (4x), Seegene PneumoBacter assay (1x), BioGx auf BD Max (3x), BioGx atypical pneumonia (2x), BioFire FILMARRAY respiratory Panel (3x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (2x), Euroclone Duplica Real Time M. pneumoniae Kit (1x), Luminex NxTAG Respiratory Pathogen Panel (3x), Luminex MagPix Respiratory Pathogen Panel Assay (1x), Sartorius Microsart ATMP Mycoplasma (2x), Ingenetix Bacto Real M. pneumoniae (1x), RespiFinder (1x), AusDiagnostics Respiratory panel C (1x), AusDiagnostics Atypical Pneumonia MT-PCR (1x), Hibergene HG M. pneumoniae (1x) und Minerva Venor GeM qEP (1x).

Auch hier wieder eine Anmerkung vorweg: Der kombinierte Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Coxiella burnetii & Bacillus anthracis ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Coxiella burnetii- und Bacillus anthracis-DNA aus geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben (Tabelle 1, Anhang 1 [Anh. 1], S. 17) enthielt zwei Proben mit verschiedenen Mengen an C. burnetii (~1x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 2015423 und ~1x10⁵ Genomkopien/mL in Probe # 2015421), eine Probe mit DNA des B. anthracis „STI“-Impfstammes (~1x10⁵ Genomkopien/mL in Probe # 2015424), eine Probe mit DNA des Bacillus anthracis UR-1-Isolats (~1x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 2015421), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 2015422), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Der Übersichtlichkeit halber haben wir uns bei diesem kombinierten Ringversuch entschlossen, die Ergebnislage für die beiden unterschiedlichen Erreger auch in zwei getrennten Tabellen darzustellen: für C. burnetii in den Tabellen 2 und 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 17), für B. anthracis in den Tabellen 4 und 5 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 18).

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: Progenie RealCycler Kits (3x), a-Cube (1x), AmpliSens C. burnetii/B. anthracis (1x), Life Technologies LSI VetMAX Absolute quant. C. burnetii (1x), Sacace Biotechnologies C. burnetii Real-TM (1x), Master diagnostica Tick-borne bacterial flow chip (1x), BioGx (1x) und Adiagene ADIAVET C. burnetii (1x),

Coxiella burnetii: Wie bereits in vorausgegangenen Ringversuchsrunden dieser Serie gestaltet sich die Ergebnislage auch in der aktuellen Aussendung sehr erfreulich. Die etwas stärker positive Probe # 2015421 (mit ca. 1x10⁵ Genomkopien C. burnetii/mL) wurde von allen der insgesamt 48 Teilnehmer mit ihren jeweiligen C. burnetii-spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert. Die zweite positive Probe # 2015423 des Probesets (ca. 1x10⁴ Genomkopien/mL an C. burnetii) wurde von 47 Laboratorien korrekt befundet. Hier wurde allerdings von einem Teilnehmer ein falsch-negatives Ergebnis beobachtet. Die beiden Proben ohne C. burnetii-Zielorganismen bzw. -DNA (# 2015422 und # 2015424) wurden jeweils von allen Teilnehmern bis auf einen korrekt als „negativ“ bewertet und zwei Teilnehmer klassifizierten ihr Ergebnis hier als „fraglich“. Sowohl falsch-positive als auch falsch-negative Ergebnisse sollten in den betroffenen Laboratorien zum Anlass genommen werden, die Performance des verwendeten Testsystems nochmals zu evaluieren und gegebenenfalls die spezifischen Prozesse der Probenaufarbeitung sowie den diagnostischen Ablauf zu optimieren.

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von C. burnetii-DNA der Teilnehmer enthielten durchwegs eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bis auf zwei „isolierte“ Inhibitionsereignisse bei Einzelproben wurden bei den jeweils eingesetzten PCR/NAT-Assays keine signifikanten Inhibitionsereignisse beobachtet.

Bacillus anthracis: Die Ergebnislage des Ringversuchs Bacillus anthracis-DNA ist ebenfalls relativ schnell dargestellt. Alle bis auf einen der insgesamt 27 Teilnehmer konnten die beiden Proben mit Zielorganismen (# 2015421 und # 2015424) sowie die beiden Proben ohne Zielorganismen (# 2015422 und # 2015423) richtig klassifizieren.

Zur kurzen Rekapitulation: B. anthracis-Stamm STI ist positiv für die B. anthracis-spezifischen chromosomalen Sequenzmarker rpoB oder dhp61 und das Virulenzplasmid pXO1 (kodiert für Letal- und Ödem-Faktor sowie Protektives Antigen pagA), jedoch negativ für das Virulenzplasmid pXO2. Wie immer stehen nach erfolgreichem Abschluss der aktuellen Ringversuchsrunde den Kolleginnen und Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen für C. burnetii-DNA und B. anthracis-DNA interessiert sind, mit den Proben dieses Ringversuchs auch gewissermaßen „standardisierte Rückstellproben“ zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Francisella tularensis & Brucella spp.“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an F. tularensis-DNA und Brucella spp.-DNA aus geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben (Tabelle 1, Anhang 1 [Anh. 1], S. 19) enthielt zwei Proben mit verschiedenen Mengen an F. tularensis subsp. tularensis-DNA (~1x10⁵ CFU/mL in Probe # 2015433 und ~1x10⁴ CFU/mL in Probe # 2015434), zwei Proben mit verschiedenen Mengen an Brucella melitensis-DNA (~1x10⁵ CFU/mL in Probe # 2015432 und ~1x10⁴ CFU/mL in Probe # 2015434), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 2015431), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: Sacace Biotechnologies Brucella Real-TM (1x), AmpliSens Brucella spp. (1x) und Master diagnostica Tick-borne bacterial flow chip (1x).

Francisella tularensis: Im aktuellen Probenset befanden sich jeweils zwei positive Proben (# 2015433 und # 2015434) sowie zwei negative Proben (# 2015431 und # 2015432), die diesmal von allen der insgesamt 33 Teilnehmer durchwegs korrekt mit ihren F. tularensis-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen analysiert und befundet wurden. Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum PCR/NAT-gestützten Nachweis von F. tularensis-DNA enthielten entsprechende Inhibitions- und/oder Extraktionskontrollen und bei keiner der aktuellen Proben wurden Inhibitionsereignisse beobachtet.

Brucella spp.: Die Ergebnislage für die Brucella spp.-spezifische Komponente des RV 543 deckt sich diesmal komplett mit der zuvor diskutierten Konstellation für F. tularensis. Auch hier wurden die beiden Brucella spp.-positiven Proben (# 2015432 und # 2015434) und die beiden negativen Proben (# 2015431 und # 2015433) von allen der diesmal 30 Teilnehmer durchweg korrekt mit ihren Brucella spp.-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen analysiert und befundet.

Bei den selbstentwickelten oder kommerziellen Testsystemen zum PCR/NAT-gestützten Nachweis von Brucella spp.-DNA wurden durchweg geeignete Inhibitions- und/oder Extraktionskontrollen mitgeführt und bei keiner der aktuellen Proben Inhibitionsereignisse mitgeteilt.

Der seit 2015 in das reguläre Ringversuchsprogramm von INSTAND e.V. aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Carbapenemase-Gene“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zur molekularen Resistenztestung bzw. dem Direktnachweis von charakteristischen Carbapenemase-Genen aus DNA-Präparationen von Reinkulturen an Enterobacterales konzipiert.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 21) der Auswertung dargestellt, enthielt das aktuelle Set drei Proben mit Carbapenem-resistenten Enterobacterales: Probe # 2015441 enthielt Klebsiella pneumoniae-Zielorganismen mit dem OXA-232-Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL), Probe # 2015442 Enterobacter cloacae-Komplex-Zielorganismen mit dem IMI-2-Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL) und Probe # 2015444 enthielt eine NDM-1-positive Serratia marcescens (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL). Die vierte Probe # 2015443 war als eine Art von Negativkontrolle ausgelegt – sie enthielt lediglich E. coli ohne Carbapenemase-Gene.

87 der 89 Teilnehmer stellten erfreulicherweise ein Carbapenemase-Gen in der Probe # 2015441 fest. Für die Probe mit NDM-1-positiver Serratia marcescens (# 2015444) wurden sogar ausnahmslos korrekte Ergebnisse berichtet. Hoch lag die Richtigkeitsquote auch für die Probe # 2015443, hier berichteten 86 Teilnehmer die Probe als „Carbapenemase-negativ“; zudem wurden 2 falsch-positive und ein fragliches Ergebnis eingereicht. Schwächen zeigten sich allerdings bei der Detektion des IMI-2-positiven Enterobacter cloacae-Komplex in Probe # 2015442. Nur 14 Teilnehmer reichten für diese Probe ein korrektes, positives Ergebnis ein. Da das IMI-2-Gen gerade in einigen Multiplex-PCR/NAT-Testformaten (noch) nicht als Target enthalten ist, wurden die mitgeteilten Ergebnisse auch nicht in die Bewertung für die Zertifikate mit einbezogen. Dies ist der Übersichtlichkeit halber durch die drei grau schraffierten Felder in Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 21) gekennzeichnet.

Hier noch ein kurzer Kommentar von Frau Dr. Agnes Anders vom NRZ für gramnegative Krankenhauserreger: Besonders auffällig ist bei dieser Carbapenamse IMI-2, die zu den Serin-Carbapenemasen gehört und deren Nachweisrate in den letzten Jahren zugenommen hat, eine häufige Colistin-Resistenz. Diese liegt nach Daten des Nationalen Referenzzentrums bei etwa 50%. IMI-2 kommt am häufigsten in Enterobacter spp. vor.

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Direktnachweis von Carbapenemase-Genen der Teilnehmer enthielten mit einer Ausnahme eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: Check-Points Check direct CPE oder MDR (2x), AID Carbapenemase (2x), GenID Carbapenemase (2x), Seegene eazyplex SuperBug expert (1x), AmpliGnost Carbapenemase PCR Kit (1x), BD Max CPO Kit (1x), Mast Group Mast Isoplex CRE-ART (1x), HAIN Lifescience Check-Direct CPE (1x) und hylabs Hy-CRE-(KPC/OXA-48/NDM-1) Detection Kit (1x).

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Clostridium difficile“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Clostridium difficile-DNA aus geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 22) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben drei positive Proben: Probe # 2015452 mit einer relativ hohen Menge an Clostridium difficile (~5x10⁵ CFU/mL), Probe # 2015453 mit ca. zehnfach geringerer Menge (~5x10⁴ CFU/mL), Probe # 2015451 mit ca. hundertfach geringerer Menge (~5x10³ CFU/mL) sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 2015454), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Die beiden relativ stark positiven Clostridium difficile-Proben # 2015452 und # 2015453 wurden erfreulicherweise von 179 bzw 177 der insgesamt 181 teilnehmenden Laboratorien korrekt als „positiv“ klassifiziert. Falsch-negative Ergebnisse sollten hier zum Anlass genommen werden, das verwendete Testsystem bezüglich der analytischen Sensitivität und Spezifität zu evaluieren und auch die laborinternen Prozesse der Probenaufbereitung und -abarbeitung kritisch zu hinterfragen. Letzteres gilt insbesondere für den Teilnehmer mit falsch-positivem Ergebnis für die lediglich E. coli enthaltende Probe # 2015454. Eine Kreuzreaktion der verwendeten Testsysteme mit E. coli erscheint unwahrscheinlich, am ehesten sind Kreuzkontaminationen im Prozess der Probenbearbeitung ursächlich. Probe # 2015451 enthielt mit ~5x10³ CFU/mL die geringste Menge an Zielorganismen und wurde immerhin von 177 (also nahezu von allen) Teilnehmern korrekt als positiv für C. difficile befundet. Bei den 3 Teilnehmern mit falsch-negativem Ergebnis sollte gegebenenfalls die analytische Sensitivität des eingesetzten PCR/NAT-Testsystems hinterfragt werden. Bis auf 2 Teilnehmer haben diesmal alle die vorschriftsmäßigen Extraktions- und/oder Inhibitionskontrollen mitgeführt, und signifikante Inhibitionsereignisse wurden für keine der ausgesandten Proben berichtet.

Wie in Tabelle 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 22) angegeben, verwendete der Großteil der Teilnehmer kommerzielle Testsysteme, während selbstentwickelte Testkonzepte in 12 Laboratorien zum Einsatz kamen. In dieser Ringversuchsrunde zeigten sich (vergleichbar mit der vorausgegangenen) zwischen den kommerziellen Testsystemen und den Eigenentwicklungen keine signifikanten Unterschiede bezüglich Sensitivität und Spezifität. Für eine verlässlichere Beurteilung sollten jedoch die folgenden Ringversuchsrunden abgewartet werden.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: QUIDEL Solana C. difficile Assay (5x), Amplex eazyplex C. difficile (4x), r-Biopharm RIDAGENE Hospital Stool Panel (1x), Seegene Allplex GI-EB Screening (2x), AmpliGnost C. difficile Toxin A und B (2x), Seegene Allplex GI Bacteria Assay (1x), TIB Molbiol LightMix Kits (2x), Abacus Diagnostica GenomEra C. difficile (1x), Altona diagnostic RealStar C. difficile PCR Kit (1x), Fast Track Diagnostics C. difficile (1x) und Aries Luminex C. difficile (1x).

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Vancomycin-resistente Enerokokken“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an DNA Vancomycin-resistenter Enterokokken aus geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 23) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben zwei positive Proben: Probe # 2015464 mit einer relativ hohen Menge an Zielorganismen (Enterococcus faecium vanA-resistent, ~1x10⁴ CFU/mL), Probe # 2015461 mit einer etwa fünffach höheren Menge (Enterococcus faecium vanB-resistent, ~5x10⁴ CFU/mL) und Probe # 2015463 mit ca. ~1x10⁵ CFU/mL an Enterococcus faecalis. Im Ringversuchsprobenset befand sich zudem eine Probe ohne Zielorganismen (# 2015462), die nur humane Zellen und E. coli enthielt.

Erfreulicherweise wurden die beiden „positiven“ Proben mit vanB- bzw. vanA-tragenden Enterococcus faecium (# 2015461 und # 2015464) mit drei bzw. keiner Ausnahme von allen Teilnehmern als „VRE-positiv“ klassifiziert.

Das heißt aber auch, immerhin 3 falsch-negative Ergebnisse wurden für den vanB-tragenden E. faecium-Stamm (# 2015461) eingereicht. Im Falle einer Infektion mit dem Erreger kommt dem korrekten Nachweis einer Vancomycin-Resistenz natürlich eine hohe Bedeutung zu. Wie bereits im vorangegangenen Ringversuch waren mit lediglich einer Ausnahme die eingereichten vanA/vanB-Differenzierungen korrekt. Von den VRE-negativen Proben wurde # 2015462 von 67 der 68 Teilnehmer korrekt klassifiziert, für die Probe # 2015463 waren drei falsch-positive Befunde zu verzeichnen.

Bei den eingesetzten Testsystemen zeigt sich in den letzten Jahren ein Trend hin zu kommerziell erhältlichen, vorkonfektionierten Systemen. Unterschiede in Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu Inhouse-Assays waren jedoch nicht zu erkennen.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: BD GeneOhmTM VanR (1x), Amplex eazyplex VRE (1x), BioGx Vancomycin resistance (2x), GeneProof VRE PCR Kit (1x), Roche LightCycler VRE Detection Kit (1x), TIB Molbiol (1x) und AmpliGnost Vancomycin A/B Resistenz Differenzierung (1x).

Nach intensiven Vorarbeiten zum Proben-Design, zur praktischen Umsetzung und der Aussendung von zwei sogenannten „Piloten“ wird der komplexe Ringversuch RV 547 „Urogenital-Panel“ zukünftig im Rahmen des regulären Ringversuchsprogramms von INSTAND e.V. durchgeführt und die Ergebniskonstellation hier diskutiert. Das überaus heterogene Spektrum an eingesetzten Testsystemen erschwert natürlich nach wie vor eine strukturierte und übersichtliche Auswertung der auf den Report-Formularen mitgeteilten Ergebnisse. Daher haben wir im Vergleich zu den übrigen Ringversuchen der hier diskutierten Ringversuchsreihe „Bakterien- und Pilzgenomnachweis PCR/NAT“ die ursprüngliche Tabelle 3 etwas differenzierter dargestellt (jetzt: „erregerspezifische“ Auswertung in den Tabellen 2 bis 9, Anhang 1 [Anh. 1], S. 24–28). Dort ist der Übersicht halber nun die Anzahl an positiven und negativen Ergebnissen für die in den jeweiligen Proben anwesenden Pathogene aufgeführt. Mit dieser Lösung sollte man, trotz der enormen und vermutlich zukünftig auch noch zunehmenden Heterogenität des Erreger- und Testspektrums einzelner Multiplex-PCR-Testkonzepte, eine einigermaßen informative Darstellung über das erfasste Erregerspektrum und über die Leistungsdaten einzelner Testsysteme erhalten können.

Im Großen und Ganzen haben die 88 aktuell registrierten Teilnehmer die Erreger in den 4 Einzelproben entsprechend den methodischen Möglichkeiten ihrer Testsysteme zufriedenstellend nachweisen können. Wie aus den Tabellen 2 bis 9 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 24–28) zu entnehmen, wurden insgesamt nur sehr wenige (sporadische) falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse berichtet.

So wurden in der aktuellen Ringversuchsrunde vereinzelt falsch-positive sowie falsch-negative Ergebnisse für Trichomonas vaginalis oder Gardnerella vaginalis beobachtet, und von einem Teilnehmer wurde innerhalb des aktuellen Sets bei der Mycoplasma genitalium-positiven Probe # 2015474 ein positives Ergebnis für Treponema pallidum-DNA und Gardnerella-DNA berichtet. Bei den falsch-positiven Befunden könnte es sich eventuell um labor- oder testinterne Kontaminationsereignisse bzw. Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung gehandelt haben. Inhibitionskontrollen wurden von allen der 88 Teilnehmer mitgeführt, und von keinem Teilnehmer wurden Inhibitionsereignisse beobachtet.

Dies spricht zum einen für die Praktikabilität unseres innovativen Multiplex-Ringversuchskonzepts und zum anderen für die relativ zuverlässige Erfassung der Zielorganismen innerhalb der jeweils testspezifisch abgedeckten Erregerspektren der eingesetzten kommerziellen oder eigenentwickelten PCR/NAT-Verfahren.

Wie bereits in der vorhergehenden Ringversuchsdiskussion erwähnt, haben wir im Rahmen der Online-Ergebnisübermittlung des RV 547 eine Option in der Eingabemaske entwickelt, über die die einzelnen Teilnehmer das aktuell erfasste Erregerspektrum ihrer individuellen Testsysteme und Multiplex-Assays während der Ergebniseingabe mitteilen. Für die Erteilung von Zertifikaten macht es nachvollziehbarerweise nur Sinn, dass diejenigen Parameter bewertet und testiert werden, die von den individuellen Teilnehmern im Rahmen ihres diagnostischen Workflows prinzipiell auch als positiv bzw. negativ erfasst werden können.

Wie bereits eingangs kurz erwähnt, werden wir uns aufgrund des zunehmend heterogenen Spektrums von differenziert erfassten oder auch nicht zu differenzierenden Spezies einiger Erregergruppen (z.B. Ureaplasma spp. vs. U. parvum/U. urealyticum) bei vielen der aktuellen PCR-Testsysteme zeitnah bemühen, bei den Online-Eingabemasken die Möglichkeit einer differenzierten Befundung auf Spezies- oder eben nur auf Genus-Ebene schaffen.

Der Ringversuchsleiter ist natürlich stets für weitere konstruktive Kommentare und Vorschläge aus dem Teilnehmerkreis dankbar. Trotz des relativ vielfältigen Spektrums an unterschiedlichen Testsystemen und -konzepten werden wir uns nach Kräften bemühen, die Teilnehmer bei den zukünftigen Ringversuchsrunden mit aussagekräftigen Zertifikaten versorgen zu können.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: Seegene Allplex Genital ulcer (7x), Mikrogen ampliCube STD Panels (6x), Amplex eazyplex STD complete (3x), AmpliGnost M. hominis (2x), Seegene Anyplex STI-7 Detection (2x), AB Analytica UU/UP (1x), AmpliSens UU/UP/TV/MG/MH/GV (1x), AID RDB 2110 STD (1x), aprimeo Vivalytic STI (1x), AusDiagnostics Urogenital (1x), BIORON diagnostics RealLine U.urealyt./U. parvum (1x), BioGx T. vaginalis (1x), BD Max T. vaginalis (1x), Fast-track Diagnostics T. pallidum (1x), Fast Track Diagnostics FTD Urethritis basic (1x), GeneProof Ureaplasma/TV/TP Kits (1x), GeneProof CT/NG/MG/MH Multiplex PCR Kit (1x), Genedia M. genitalium (1x), HAIN Lifescience FluoroType STI (1x), Progenie RealCycler TPHD Kit (1x), Roche COBAS TV/MG (1x), Sacace Biotechnologies UU/UP/TV/TP/MG/MH/GV (1x), TIB Molbiol LightMix modular T. pallidum (1x) und VIASURE (1x).

Dieser Ringversuch „RV 560 Pilzgenomnachweis PCR/NAT Pneumocystis jirovecii“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis von Pneumocystis jirovecii-DNA in geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Zum orientierenden Herantasten an die unteren Nachweisgrenzen der im Anwenderkreis etablierten PCR/NAT-gestützten Testsysteme enthielt das aktuelle Set zwei positive Proben (Tabelle 1, Anhang 1 [Anh. 1], S. 29): eine Probe mit einer relativ hohen Menge an Zielorganismen (# 2015601, Pneumocystis jirovecii, ca. 1x10⁵ Organismen/mL), eine Probe mit einer geringeren Menge (# 2051604, Pneumocystis jirovecii, ca. 1x10⁴ Organismen/mL), sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 2015602 und # 2015603), aber mit E. coli und einer Suspension aus humanen Zellen.

Die beiden negativen Proben # 2015603 und # 2015602 wurden erfreulicherweise mit einer bzw. zwei Ausnahmen von allen Teilnehmern korrekt als negativ für Pneumocystis jirovecii-DNA befundet. Im Vergleich zu den vorausgegangenen Ringversuchsrunden hat sich die Rate an falsch-positiven Ergebnissen damit erneut leicht reduziert. Einer der Teilnehmer hat seine Ergebnisse bei allen 4 Proben des aktuellen Sets als „fraglich“ klassifiziert. Bei den positiven Proben wurde Probe # 2015601 mit ~1x10⁵ Organismen/mL diesmal von nahezu allen der insgesamt 118 Teilnehmer korrekt als positiv befundet.

Etwas schlechter war die Ergebnislage für die ca. zehnfach schwächere positive Probe # 2015604 (ca. 1x10⁴ Organismen/mL). Immerhin 107 von insgesamt 118 teilnehmenden Laboratorien berichteten hier ein korrektes, positives Ergebnis. Bei einer Menge von 1x10⁴ Organismen/mL an P. jirovecii (entspricht ca. 100 Zielorganismen in dem für PCR-Untersuchungen typischerweise prozessierten Probenvolumen von 100 µl) nähert man sich offenbar der unteren Nachweisgrenze aktueller, durchschnittlich sensitiver PCR/NAT-Testsysteme und den entsprechenden Arbeitsabläufen zur Probenaufarbeitung und Template-DNA-Präparation an. Aufgrund der relativ geringen Menge an Zielorganismen in Probe # 2015604 wurden die mitgeteilten Ergebnisse diesmal nicht in die Bewertung für die Zertifikate mit einbezogen. Dies ist auch durch die durchgehend grau schraffierten Felder in Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 29) gekennzeichnet.

Inhibitionskontrollen wurden von allen 118 Teilnehmern mitgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse waren auch diesmal nicht zu beobachten.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung der folgenden Testkits aufgeführt: AmpliSens P. jirovecii FRT (2x), PathoNostics PneumoGenius (1x), VIASURE P. jirovecii Real Time PCR Detection (2x) und Ademtec MYCOgenie (1x).