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Nach erfolgreicher Etablierung dieser neuen Ringversuchs-Serie wollen wir hier auch für Kolleginnen und Kollegen, die bisher noch nicht an diesen Ringversuchen teilgenommen haben, die Ergebnisse der aktuellen Ringversuche für den PCR/NAT-gestützten Nachweis von Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, EHEC/STEC, Borrelia burgdorferi sensu lato, Legionella pneumophila, Salmonella enterica und Listeria spp., MRSA bzw. cMRSA, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetti, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Brucella spp., Pneumocystis jirovecii (vormals P. carinii), Clostridium difficile (Toxingene), VRE (Vancomycin-resistente Enterokokken) und der molekularen Resistenztestung für Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae sowie dem vor Kurzem neu ins Programm aufgenommenen Multiplex-Panel für Erreger von Urogenitalinfektionen darstellen und kurz diskutieren.

Für nähere Informationen über die Zusammensetzung der Ringversuchsproben, den Sinn und Zweck dieser neuen Möglichkeit zur externen Qualitätskontrolle im Umfeld der Nukleinsäurediagnostik sowie zu den Eckdaten unseres flexiblen Ringversuchskonzepts sei hier auf unsere initiale Veröffentlichung in der Zeitschrift „Der Mikrobiologe“ verwiesen [1]. Gerne werden wir hier auch weiterhin in regelmäßigen Abständen und in ähnlicher Form über die Ergebnislage, Auswertung und Analyse unserer zukünftigen Ringversuche berichten.

Wie bei allen anderen Ringversuchen erfolgt die Anmeldung zu ausgewählten Teilen der Reihe „Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis (PCR/NAT)“ über die Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in Medizinischen Laboratorien (INSTAND e.V.), Düsseldorf (https://www.instand-ev.de). Nach Abschluss des jeweiligen Ringversuchs werden die Ergebnisse der einzelnen Teilnehmer dort zentral erfasst, und anhand von individuellen Bewertungskriterien werden die schriftlichen Zertifikate erstellt. Zusätzlich stehen für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe weiterer Informationen auch im Internet unter http://www.udo-reischl.de, Unterpunkt „INSTAND-Ringversuche (PCR/NAT)“, sowie auf der Webseite von INSTAND e.V. als pdf-Files zum freien Download bereit.

Neben der Aussendung von lyophilisierten Probenmaterialien zur systematischen Abprüfung von NAT-gestützten Testsystemen für derzeit 19 unterschiedliche bakterielle und fungale Zielorganismen bzw. Pathogenitätsfaktoren gab es im Rahmen dieser Ringversuchsrunde auch wieder gewisse „Highlights“.

So wurden beispielsweise im aktuellen RV 539 MRSA/cMRSA eine der vier Proben mit einer Mischung von MSSA und mecA-positiven S. haemolyticus-Isolaten versetzt. Zudem befand sich in einer Probe ein MRSA-Patientenisolat mit der etwas selteneren SCCmec Typ V Genkassette. Erfreulicherweise wurden diesmal auch bei dieser methodisch etwas anspruchsvolleren Konstellation relativ wenig falsch-positive bzw. falsch-negative Ergebnisse berichtet und die DNA von MRSA/cMRSA ließ sich mit den meisten der kommerziellen und Inhouse-PCR-Testsysteme zuverlässig nachweisen.

In einer der 4 Einzelproben des aktuellen Ringversuchs RV 535: Borrelia burgdorferi befanden sich relativ hohe Mengen der Spezies Borrelia lusitaniae. Offenbar bereitete der zuverlässige PCR-gestützte Nachweis dieser dem B. burgdorferi sensu lato-Komplex zugehörigen Spezies nur einem sehr geringen Teil der Teilnehmer (bzw. den von ihnen eingesetzten Testsystemen) gewisse Probleme. Etwas Hintergrundinformation zu dieser Borrelien-Spezies finden Sie in dem ringversuchsspezifischen Teil dieser Diskussion.

Beim RV 537: Salmonella enterica befanden sich diesmal in zwei der drei positiven Proben relativ geringe Mengen an Zielorganismen, die bei der Hälfte der Teilnehmer offenbar unter der Nachweisgrenze der individuell eingesetzten Testsysteme lag. Wir haben daraus gelernt und berücksichtigen diese Beobachtung natürlich in den kommenden Ringversuchsrunden.

Mit der Auswahl eines etwas breiteren Spektrums von relevanten Carbapenemase-Genen bestätigte sich im Rahmen des Ringversuchs RV 544 Carbapenemase-Gene erneut die Vermutung, dass viele der derzeit verwendeten kommerziellen sowie Inhouse-Testsysteme zur molekularen Carbapenemase-Detektion noch gewisse Lücken hinsichtlich der Abdeckung von unterschiedlichen Carbapenemase-Genen aufweisen. Im aktuellen Ringversuch scheint dies insbesondere für GIM-1 zu gelten. Das Citrobacter freundii-Isolat mit GIM-1 wurde lediglich von 18 der insgesamt 90 Teilnehmer detektiert.

Im Umfeld der molekularen Testung von Carbapenemase-Genen unterstützt uns Frau Dr. Agnes Anders vom NRZ für gramnegative Krankenhauserreger weiterhin bei der Auswahl von relevanten „interessanten“ klinischen Isolaten.

Alle Teilnehmer sind natürlich weiterhin dazu aufgerufen, attraktive Parameter für eine zukünftige Erweiterung des Spektrums an Zielorganismen vorzuschlagen und deren mögliche Umsetzung mit dem Ringversuchsleiter zu diskutieren.

Aktueller Hinweis auf neue Ringversuche: Aufgrund einiger Anfragen aus dem Teilnehmer- und Kollegenkreis haben wir zwei zusätzliche Ringversuche etabliert, die nach erfolgreichen Probe-Ringversuchsrunden nun in das reguläre Portfolio „Bakterien- und Pilzgenomnachweis PCR/NAT“ von INSTAND e.V. übernommen werden konnten:

• Der Ringversuch RV 543: Francisella tularensis wurde bereits in der vorherigen Ringversuchsrunde November 2018 um den Zielorganismus Brucella spp. erweitert und wird zukünftig routinemäßig als kombinierter Ringversuch RV 543 F. tularensis & Brucella spp. angeboten.
• Für die externe Qualitätssicherung zukünftig kommerziell verfügbarer (und damit wohl auch vermehrt eingesetzter) PCR/NAT-gestützter Nachweisverfahren für Urogenital-Infektionen haben wir seit Mai 2019 einen neuen Ringversuch routinemäßig etabliert, der vom Konzept her jeweils einige der nachfolgenden Erreger in unterschiedlichen Kombinationen und Mengen innerhalb des 4-er Panels enthält: RV 547 „Urogenital-Panel“ zum Nachweis von Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis und ggf. Treponema pallidum.

Nach 19 Teilnehmern beim Pilotringversuch im November 2018 haben sich diesmal bereits 57 Teilnehmer registriert. Wir werden uns nach Kräften bemühen, der hohen Nachfrage auch mit ausreichenden Mengen an Probenmaterial nachzukommen, und sind sehr neugierig, wie sich die Auswertung der berichteten Ergebnisse zukünftig gestalten wird.

Vorab auch noch eine Anmerkung zu den statistisch ermittelten und in den jeweiligen Tabellen 3 aufgeführten Leistungsdaten von kommerziellen PCR/NAT-Testsystemen. Auffällig bei vielen der aktuellen aber auch bei einigen der früheren Ringversuche ist das unterschiedlich gute Abschneiden von Teilnehmern mit ein und demselben kommerziellen, vorkonfektionierten und teilweise auch automatisierten und/oder kartuschenartig geschlossenen Testsystemen.

Die meisten dieser Assays sind zudem auch noch IVD-zertifiziert – mit allen aufwändigen herstellerseitigen Vorkehrungen zur möglichst zuverlässigen Durchführung und standardisierten Ergebnisinterpretation. Die auffällige „Streuung der Performance“ (bzw. das Auftreten einzelner Ausreißer) unterstreicht umso mehr die Bedeutung der aktuell vorgegebenen Qualitätsstandards, wie beispielsweise das regelmäßige Mitführen von geeigneten Extraktions-, Positiv- und Negativ-Kontrollen sowie Schulungen und kontrollierte Maßnahmen zur Vermeidung von exogenen Kontaminationsmöglichkeiten in PCR/NAT-Arbeitsbereichen, die u.a. im Rahmen der aktuellen RiLiBÄK, der Akkreditierung und der praxisorientiert verfassten MIQ-1 gefordert werden. Deren Sinnhaftigkeit und Stringenz mögen aus Anwendersicht ja gelegentlich bezweifelt werden, werden aber in diesen Ringversuchsrunden (sozusagen von neutraler Warte aus) dennoch immer wieder aufs Neue bestätigt.

Neben den überaus motivierten und engagierten Mitarbeitern der verschiedenen Sollwert-Laboratorien unterstützen uns bei der Konzeption und Auswertung der zahlreichen Ringversuche zum Bakterien- und Pilzgenomnachweis PCR/NAT noch zahlreiche Kolleginnen und Kollegen aus unserem Hause. Allerherzlichsten Dank für ihre spontane Bereitschaft sowie ihr ehrenamtliches Engagement für unsere gemeinsamen Bemühungen zur externen Qualitätssicherung molekularbiologischer Nachweisverfahren in der infektiologischen Diagnostik.

Entsprechend des Grundgedankens unserer Ringversuchsaktivitäten wurde auch bei der Konzeption des aktuellen Ringversuchs zum „Bakteriengenomnachweis mittels PCR oder anderer Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT)“ bei einigen Zielorganismen der Versand von Proben mit relativ niedrigen Erregerzahlen angestrebt.

In den aktuellen Ringversuchssets befanden sich daher erneut einige Proben mit relativ geringer Menge folgender Zielorganismen: Salmonella enterica ser. enteritidis (Proben # 1915371 und # 1915372), Chlamydia pneumoniae (Probe # 1915404), Mycoplasma pneumoniae (Probe # 1915412), Clostridium difficile (Probe # 1915454), Gardnerella vaginalis (Probe # 1915471) sowie Ureaplasma urealyticum (Probe # 1915471).

Im Rahmen der Testentwicklung bzw. Testoptimierung können diese Probensätze, u.a. als Qualitätskontrollen oder als standardisierte Sensitivitätsmarker, für die Austestung der unteren Nachweisgrenze von eigenentwickelten Nukleinsäure-gestützten Testsystemen dienen. An dieser Stelle möchten wir auch darauf hinweisen, dass zahlreiche Rückstell-Probensätze der früheren Ringversuche noch verfügbar sind, und bei Bedarf über den Ringversuchsleiter formlos nachbestellt werden können.

Mit Ausnahme der zuvor erwähnten „grenzwertig positiven“ Einzelproben wurden die Mengen der entsprechenden Zielorganismen in den Probensätzen der aktuellen Ringversuchsrunde wieder relativ deutlich über der Nachweisgrenze von „durchschnittlich sensitiven PCR/NAT-Testkonzepten“ eingestellt. Diese definieren wir wie folgt: als Richtwert für die Bewertung von Ringversuchsergebnissen gilt das 10- bis 50-fache der unteren Nachweisgrenze durchschnittlich sensitiver PCR-Protokolle unter Standardbedingungen (z.B. 50 µl Block-Cycler Reaktionsansätze, 35 PCR-Zyklen, ggf. entsprechende Realtime-PCR-Protokolle; gut evaluierte Primersequenzen).

Bei den meisten Probenmaterialien der aktuellen Ringversuchsrunde stellen falsch-negative Ergebnisse damit einen deutlichen Hinweis auf ernstzunehmende Mängel innerhalb der eingesetzten Verfahren zur Nukleinsäure-Extraktion, Amplifikation und Detektion dar.

Falsch-positive Ergebnisse sind dagegen in der Regel als Hinweis auf eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung und/oder auf mangelnde Spezifität der eingesetzten Testsysteme zu betrachten.

In bewährter Form werden im Folgenden die Ergebnisse der jeweiligen erregerspezifischen Ringversuche dargestellt. Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1]) zeigt dabei die Probenzusammensetzung und das erwartete Ergebnis (Sollwert) mit den entsprechenden Codenummern der Ergebnisbögen. Die von den einzelnen Teilnehmern mitgeteilten Ergebnisse werden in Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1]) nach der Häufigkeit der Mitteilung von positiven oder negativen Ergebnissen, und in Tabelle 3 (Anhang 1 [Anh. 1]) nach der absoluten Anzahl der richtig-positiven und richtig-negativen Ergebnisse sowie deren prozentualem Anteil (Befundhäufigkeit) je Amplifikationssystem bzw. Testkonzept aufgeschlüsselt.

Für die objektive Bewertung von kommerziellen Testsystemen sollten neben der rein statistischen Betrachtung der mitgeteilten Ringversuchsergebnisse auch die Anzahl und vor allem die methodische bzw. technische Qualifikation der individuellen Teilnehmer berücksichtigt werden. Da wir im Zuge unserer Ringversuche aber das gesamte Spektrum von spezialisierten Expertenlabors bis hin zum „Gelegenheitsanwender“ abdecken, müssen die arithmetisch ermittelten Richtigkeitsquoten bei der Bewertung einzelner Testsysteme immer mit einem gewissen Toleranzbereich betrachtet werden.

Auch im Rahmen des hier diskutierten Ringversuchs waren wieder einige Auffälligkeiten hinsichtlich der Spezifität und Sensitivität von bestimmten Testkonzepten und der für den Nachweis verwendeten Zielsequenzen zu beobachten. Diese Aspekte sind bei der Auswertung des jeweiligen Ringversuchs aufgeführt und dort auch kurz diskutiert. Zusätzlich stehen für die früheren, für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe zusätzlicher Informationen (wie die graphisch dokumentierten Ergebnisse unserer quantitativen Realtime-PCR-Testsysteme oder die Ergebnisse einiger kommerzieller PCR-Testsysteme) auch unter der Internetadresse http://www.udo-reischl.de; Unterpunkt „Auswertung der Ringversuche“ und natürlich auch über die Webseite von INSTAND e.V. (https://www.instand-ev.de) als pdf-Files zum freien Download bereit. An dieser Stelle möchte ich mich noch einmal ausdrücklich bei den geschätzten Kolleginnen und Kollegen für ihre zahlreichen und überaus konstruktiven Kommentare und Anregungen zu den Ausführungen in dieser Ringversuchsdiskussion sowie deren tatkräftige Unterstützung bei der Konzeption und dem Aufbau neuer Ringversuche bedanken.

Die Ergebnislage des aktuellen Ringversuchs deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus vorangegangenen Ringversuchen zum kombinierten NAT-gestützten C. trachomatis- und Gonokokken-Nachweis. Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt jeweils zwei Proben mit einer relativ hohen Menge an C. trachomatis (# 1915301 und # 1915302, ~5x10⁵ IFU/mL). Eine Probe (# 1915303) war mit ca. 5x10⁵ CFU/mL an N. gonorrhoeae und eine Probe mit einer 10-fach niedrigeren Mengen an N. gonorrhoeae-Zielorganismen (# 1915304; ~5x10⁴ CFU/mL) versetzt.

Trotz der relativ geringen Erregermenge in manchen der vier unterschiedlich zusammengesetzten positiven Proben und der gleichzeitigen Anwesenheit von C. trachomatis- und N. gonorrhoeae-DNA führte auch diesmal die Verfügbarkeit gut evaluierter und zum Teil automatisierter NAT-gestützter Analysesysteme für Chlamydia trachomatis zu hohen Richtigkeitsquoten sowohl für positive als auch für negative Befunde.

Der Übersichtlichkeit halber werden wir bei diesem kombinierten Ringversuch (CT/NG) die Ergebniskonstellation zukünftig in 7 getrennten Tabellen (Anhang 1 [Anh. 1], S. 1–3) darstellen. Damit wird die diagnostische Performance der jeweiligen Testsysteme beim Nachweis von CT und NG aussagekräftiger (Tabelle 4: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei CT, Tabelle 6: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei NG; jeweils gefolgt von den Richtigkeitsquoten nach aufgeführten Testsystemen in den Tabellen 5 und 7).

Die beiden C. trachomatis-positiven Proben # 1915301 und # 1915302 des aktuellen Ringversuchs wurden diesmal mit relativ hohen Mengen an entsprechenden Zielorganismen versetzt, und unter den von insgesamt 264 Teilnehmern mitgeteilten NAT-Ergebnissen für C. trachomatis befand sich lediglich jeweils ein falsch-negatives Ergebnis für beide Proben. Erwähnenswert sind jedoch die 5 falsch-positiven Ergebnisse für C. trachomatis-DNA bei der Probe # 1915303 und die 3 falsch-positiven Ergebnisse bei der Probe # 1915304. Hierbei handelt es sich vermutlich um Kontaminationsereignisse bei der Probenaufbereitung und -abarbeitung der gleichzeitig prozessierten relativ stark CT-positiven Proben # 1915301 und # 1915302. Den betroffenen Laboratorien sollten diese Ergebnisse Anlass geben, ihren individuellen diagnostischen Workflow hinsichtlich der Kontaminationssicherheit während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik zu überprüfen und gegebenenfalls zu optimieren.

Im Rahmen des NAT-gestützten Gonokokken-Nachweises wurden für die zwei ebenfalls relativ stark positiven Proben # 1915303 und # 1915304 (N. gonorrhoeae; ca. 5x10⁵ bzw. 5x10⁴ CFU/mL) diesmal lediglich von einem der insgesamt 263 Teilnehmer ein falsch-negatives Ergebnis für Probe # 1915303 und von 3 Teilnehmern falsch-negative Ergebnisse und drei als „fraglich“ klassifizierte Ergebnisse für die Probe # 1915304 mitgeteilt. Bei den insgesamt lediglich 4 für GO falsch-negativen Ergebnissen handelt es sich vermutlich um Ringversuchstypische „sporadische Ausreißer“, da von einem Großteil der Anwender mit den unterschiedlichsten Testsystemen hier durchweg korrekte Ergebnisse berichtet wurden.

Da die hier beobachteten Sensitivitäts- und Spezifitätsprobleme angesichts der großen Teilnehmerzahl nur marginale Ausmaße haben, sich offensichtlich nicht auf bestimmte Testkonzepte eingrenzen lassen und sich auch mehr oder weniger sporadisch durch das ganze Portfolio der eingesetzten Testsysteme ziehen, kann dem großen Rest des Teilnehmerfeldes erneut eine erfreulich gute analytische Sensitivität und Spezifität ihrer CT- und GO-spezifischen NAT-Testsysteme sowie der angewandten Prozeduren zur Probenaufarbeitung und -prozessierung attestiert werden.

Wir glauben, es ist auch für den Leser dieser Ringversuchsdiskussion weitgehend nachvollziehbar, dass wir als Organisatoren von Testkonzept- und Testplattform-übergreifenden Ringversuchen bei der Konfektionierung unserer Probenmaterialien leider nicht jede Besonderheit im Abarbeitungsprotokoll von kommerziellen Testsystemen berücksichtigen oder unterschiedliche Arten von Ringversuchsprobenmaterial für bestimmte Testsysteme bereitstellen können.

Auf diesen Umstand wurde bereits bei früheren Ringversuchen mehrfach im Zusammenhang mit den RNA-Zielsequenzen der AMPLIFIED CT Testkits oder der APTIMA COMBO 2 Testkits (Hersteller: Gen-Probe Inc.) hingewiesen. Werden von Teilnehmern bestimmte NAT-Testsysteme eingesetzt, die erregerspezifische RNA-Zielsequenzen nachweisen oder auf einem RNA-basierten Amplifikationsprozess (TMA; Transcription-Mediated Amplification, o.ä.) beruhen, so kann mit dem hier versandten Probenmaterial offiziell keine regelgerechte Abprüfung der entsprechenden Sensitivitäten unter Routinebedingungen gewährleistet werden. Aber selbst wenn das Herstellungsverfahren unserer Ringversuchsproben primär nicht auf die Stabilisierung von RNA-Molekülen hin optimiert und getestet wurde, so konnten dennoch sowohl bei der aktuellen wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchsrunden von vielen Teilnehmern mit RNA-gestützten Testsystemen hohe Richtigkeitsquoten erzielt werden. Aktuell wurden sowohl die C. trachomatis- als auch die Neisseria gonorrhoeae-Zielorganismen von allen der 10 Teilnehmer mit RNA-basierten Gen-Probe Testsystemen in den 4 ausgesandten Proben erfolgreich nachgewiesen und die entsprechenden Zertifikate erlangt.

Entsprechende Inhibitionskontrollen wurden von 263 der insgesamt 264 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal nicht mitgeteilt. Unabhängig von der Art des verwendeten Testsystems soll in diesem Zusammenhang auch noch einmal darauf hingewiesen werden, dass in Gegenwart von relativ hohen Mengen an Zielorganismen (bzw. deren Nukleinsäure) die interne Kontrollreaktion aufgrund der „Konkurrenzsituation“ mit der Amplifikation der eigentlichen Zielsequenz durchaus negativ ausfallen kann, obwohl keine Inhibition der PCR-Reaktion im eigentlichen Sinne vorliegt.

Bei den ermittelten Richtigkeitsquoten für Teilnehmer mit dem Roche COBAS Amplicor, COBAS TaqMan, dem Becton Dickinson ProbeTec, Abbott RealTime CT/NG, Artus CT, LightMix CT/NG oder anderen Testsystemen muss berücksichtigt werden, dass im Rahmen dieser Ringversuchsauswertung in Tabelle 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 1) nicht zwischen dem spezifischen Nachweis von Chlamydien und Gonokokken differenziert wurde. Mit dem Großteil dieser kombinierten Testsysteme wurden insgesamt erfreulich hohe Richtigkeitsquoten sowohl für die positiven als auch für die negativen Ergebnisse beobachtet. Um eine detaillierte Bewertung der C. trachomatis- und GO-spezifischen NAT-Komponenten dieser kombinierten Testsysteme zu ermöglichen, wurden diesmal zusätzlich die Tabellen 4 bis 7 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 2–3) angefertigt. In den Tabellen 4 und 5 sind dabei nur die C. trachomatis (CT)-spezifischen Ergebnisse und in den Tabellen 6 und 7 nur die Neisseria gonorrhoeae (GO)-spezifischen Ergebnisse dargestellt und statistisch ausgewertet.

Anmerkung: Bevor durch einen kurzen Blick auf die prozentualen Richtigkeitsquoten in diesen Tabellen ein eventuell etwas zu voreiliger Rückschluss auf die diagnostische „Performance“ bestimmter kommerzieller Testsysteme gezogen wird, sollten erst die effektiven Teilnehmerzahlen berücksichtigt werden, die den dargestellten Richtigkeitsquoten arithmetisch zugrunde liegen.

Im handschriftlichen Kommentarfeld der Ergebnisformulare wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: BD Max CT/GC/TV assay (15x), Sacace Biotechnologies C. trachomatis/N. gonorrhoeae Real-TM (5x), QIAGEN artus CT/NG QS-RGQ Kit (3x), Urethritis basic von fast-track Diagnostics (4x), Urethritis plus von fast-track Diagnostics (1x), Seegene Allplex STI Essential Assay (5x), Seegene STI 7 Detection (3x), Seegene Anyplex™ II STI-7 Detection (3x), GeneProof C. trachomatis/N. gonorrhoeae PCR Kit (4x), GeneProof CT/NG/MG multiplex PCR Kit (1x), EUROIMMUN Euroarray STI-11 (4x), Hologic Aptima Combo 2 assay (2x), BIORON RealLine single und multiplex CT/NG Kits (2x), AmpliSens C. trachomatis- und N. gonorrhoeae-screen-FRT PCR Kit (1x), Mikrogen Diagenode Kits (7x), Aptima Combo 2 assay CT/GC (1x), VERSANT CT/GC DNA Assay von Siemens (1x), Medac/Goffin CT/NG Assay (1x), Autoimmun Diagnostika Gen ID STD Kit (1x), Immundiagnostik MutaPlex (1x) und Liferiver C. trachomatis/N. gonorrhoeae Real Time PCR Kit (1x).

Das Probenset des aktuellen Ringversuchs enthielt diesmal zwei Proben mit ca. 5x10⁵ IFU/mL an C. trachomatis (# 1915312 und # 1915314), eine Probe mit ca. 5x10⁴ IFU/mL an C. trachomatis (# 1915313), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1915311), die ausschließlich nicht infizierte Zellen und Escherichia coli enthielt.

Wie Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 4) der statistischen Auswertung zu entnehmen ist, wurden von den 66 Teilnehmern bei der C. trachomatis-negativen Probe # 1915311 lediglich ein falsch-positives Ergebnis und bei den drei C. trachomatis-positiven Proben (# 1915312, # 1915313 und # 1915314) diesmal durchwegs korrekt positive Ergebnisse für C. trachomatis-DNA mitgeteilt.

Die markante Übereinstimmung der aktuellen Ergebniskonstellation mit den Beobachtungen und hervorragenden Richtigkeitsquoten vorhergegangener Ringversuche mit ähnlicher Menge an C. trachomatis-Zielorganismen kann erneut als Beleg für eine hohe Zuverlässigkeit und Konstanz der eingesetzten Testsysteme sowie der aktuellen Kits und automatisierten Testplattformen zur Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Prozessierung angesehen werden. Bei dem einen falsch-positiven CT-Ergebnis für Probe # 1915311 handelt es sich vermutlich um ein Kontaminationsereignis bei der Probenaufbereitung und -abarbeitung der gleichzeitig prozessierten CT-positiven Proben. Wie bereits bei den vorhergegangenen Ringversuchsauswertungen bei solchen Konstellationen erwähnt, sollten diese Ergebnisse den betroffenen Laboratorien Anlass geben, ihren individuellen diagnostischen Workflow hinsichtlich der Kontaminationssicherheit während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik zu überprüfen und gegebenenfalls zu optimieren.

Auch wenn mit ca. 5x10⁴ IFU/mL an Zielorganismen im Probenmaterial der Probe # 1915313 die untere Nachweisgrenze hochsensitiver und standardisierter PCR/NAT-gestützter Testsysteme noch nicht erreicht oder unterschritten sein sollte, stehen mit den Rückstellproben des Ringversuchs RV 531 Mai 2019 den Teilnehmern mit hohem Anspruch an die individuelle Testsensitivität wieder geeignete Sets zur Überprüfung und Optimierung ihrer jeweiligen NAT-gestützten Testsysteme zur Verfügung. Angesichts der nach wie vor anhaltenden Diskussion um das „Pooling“ von entsprechendem Untersuchungsmaterial bleibt der Aspekt der analytischen Sensitivität der jeweils eingesetzten Testsysteme bedeutsam.

Inhibitionskontrollen wurden von allen der insgesamt 66 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden dabei von keinem der Teilnehmer beobachtet. In diesem Zusammenhang sei kurz angemerkt, dass wir auch im aktuellen Ringversuch keine der Einzelproben absichtlich mit inhibitorischen Substanzen versetzt haben. Erfreulicherweise waren im Rahmen dieses Ringversuchs im Großen und Ganzen keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität und Spezifität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und den selbstentwickelten Inhouse-Testsystemen zu beobachten. Trotz der relativ geringen Menge an Zielorganismen bewegten sich die Richtigkeitsquoten dabei durchweg auf erfreulich hohem Niveau.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurden hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. folgende Testsysteme aufgeführt: GeneProof C. trachomatis PCR Kit (5x), Sacace Biotechnologies C. trachomatis Real-TM (1x), BD Max CT/GC/TV assay (2x), Seegene Allplex STI Essential Assay (1x), Sansure Biotech C. trachomatis DNA Fluorescence Diagnostic Kit (1x), EUROIMMUN Euroarray STi-11 (1x), HAIN Lifescience GenoQuick CT (1x), Autoimmun Diagnostika GenID STD Kit (1x), AmpliSens C. trachomatis (1x) und Mikrogen Diagenode C. trachomatis Real Time PCR kit (1x).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1915322; B. pertussis, ~1x10⁴ CFU/mL), eine Probe mit einem klinischen Isolat von Bordetella bronchiseptica (# 1915324 mit 1x10⁵ CFU/mL), und eine Probe mit einem klinischen Isolat von Bordetella parapertussis (# 1915321 mit 1x10⁵ CFU/mL) als zum Zielorganismus verwandte Spezies. Die Probe # 1915323 enthielt diesmal keine Bordetellen, sondern lediglich E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen.

Wie schon im letzten Ringversuch bereitete der Nachweis von Bordetella pertussis-DNA in der Probe # 1915322 den Teilnehmern keine allzu großen Schwierigkeiten. Bei einer Erregermenge von ~1x10⁴ CFU/mL wurden hier nur von drei der insgesamt 169 Teilnehmer falsch-negative Ergebnisse berichtet und einer der Teilnehmer klassifizierte sein Ergebnis als „fraglich“. Bei einer Menge von 10⁴ CFU/mL an B. pertussis-Zielorganismen (entspricht ca. 10³ CFU in dem für PCR-Untersuchungen typischerweise prozessierten Probenvolumen von 100 µL) liegt man deutlich über den in früheren Ringversuchsrunden beobachteten unteren Nachweisgrenzen entsprechender PCR-Testsysteme. In der mikrobiologischen Praxis sind vor allem bei Rachenabstrichen gelegentlich auch geringe Erregermengen zu erwarten – daher sollten falsch-negative Ergebnisse bei den betroffenen Teilnehmern durchaus Anlass zur Überprüfung und Optimierung seines jeweiligen NAT-gestützten Testsystems geben.

Für die Proben # 1915321 und # 1915324 mit jeweils ca. 1x10⁵ CFU/mL an Bordetella parapertussis und Bordetella bronchiseptica (IS481-negatives Isolat) wurden insgesamt 5 falsch-positive Ergebnisse beobachtet und auch die nur mit Escherichia coli versetzte Probe # 191533 wurde von drei Teilnehmern als (falsch-)positiv für Bordetella pertussis befundet. Hierbei handelt es sich offensichtlich um mangelnde analytische Spezifität der eingesetzten B. pertussis-spezifischen PCR/NAT-Testsysteme und/oder eventuell auch um laborinterne Kontaminationsereignisse oder Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung. Von den übrigen 166 der insgesamt 169 Teilnehmer wurden ausnahmslos richtig-negative Ergebnisse mitgeteilt.

Von einem Teilnehmer wurde das Ergebnis bei der positiven Probe # 1915322 als „fraglich“ klassifiziert. Anmerkung des Ringversuchsleiters: bei der Mitteilung von fraglichen Ergebnissen werden die entsprechenden Zertifikate nur dann erteilt, wenn diese Teilnehmer bei den übrigen 3 Proben des Ringversuchs korrekte Ergebnisse angegeben haben.

Inhibitionskontrollen wurden von 168 der insgesamt 169 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden dabei von keinem Teilnehmer beobachtet.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: AmpliGnost B. pertussis/parapertussis PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (4x), Seegene Allplex Respiratory Panel 4 (9x), Altona diagnostic RealStar Bordetella PCR Kit (3x), HAIN Lifescience FluoroType Bordetella (9x), Mikrogen ampliCube Respiratory Panel 2 (6x), Quidel Solana Bordetella complete Assay (4x), Luminex ARIES Bordetella Assay (2x), BioGX Bordetella PCR Kit (2x), Sacace Biotechnologies B. pertussis/B. parapertussis/B. bronchiseptica Real-TM (2x), fast-track Diagnostics Bordetella (1x), AmpliSens Bordetella multi FRT PCR Kit (1x), Ingenetix BactoReal B. pertussis/B. parapertussis (1x), Attomol Bordetella Realtime LT (1x), DiaSorin Simplexa Bordetella direct Kit (1x), ARGENE Bordetella r-gene (1x), Meridian Bioscience illumigene Pertussis (1x), Bio-Evolution RT PCR kit B. pertussis/parapertussis (2x), PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x) und Hologic Panther Fusion Bordetella Assay (1x).

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 6) dargestellt, enthielt Probe # 1915331 des aktuellen Ringversuchs eine relativ hohe Menge an Clarithromycin-resistenten H. pylori (~10⁵ Organismen/mL). Die Probe # 1915333 enthielt das gleiche Isolat in einer etwa zehnfach geringeren Menge (~10⁴ CFU/mL). Probe # 1915334 enthielt eine Kultursuspension der Spezies Helicobacter mustelae (~5x10⁴ CFU/mL) und Probe # 1915332 ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli.

Erfreulicherweise wurden beide mit H. pylori-Zielorganismen versetzte Proben (# 1915331 und # 1915333) diesmal von allen Teilnehmern ausnahmslos als richtig-positiv bewertet, was damit einer Richtigkeitsquote von 100% entspricht. Wie bereits in den letzten Ringversuchen zeigte sich erneut die Verfügbarkeit gut evaluierter NAT-gestützter Analysesysteme mit hoher analytischer Sensitivität. Im aktuellen Ringversuch wurde zudem die analytische Spezifität der verwendeten Testsysteme durch die Probe # 1915334 überprüft, welche mit Helicobacter mustelae (~5x10⁴ CFU/mL) eine „non-pylori“ Helicobacter-Spezies enthielt. Für diese Probe wurden sieben falsch-positive Ergebnisse berichtet, wobei falsch-positive Ergebnisse hier zum Anlass genommen werden sollten, die Speziesspezifität der von den betroffenen Anwendern verwendeten PCR/NAT-Testsysteme zu überprüfen. Probe # 1915332 enthielt diesmal keine Helicobacter pylori-DNA, sondern war lediglich mit Escherichia coli K12 versetzt. Diese Probe wurde fälschlicherweise von einem Teilnehmer als positiv gewertet. Hier liegt möglicherweise ein laborinternes Kontaminationsereignis zugrunde und sollte eine Überprüfung der Arbeitsabläufe und ggfs. auch des verwendeten Testsystems nach sich ziehen. Inhibitionskontrollen wurden von 51 der insgesamt 52 Teilnehmer durchgeführt, Inhibitionsereignisse wurden dabei von keinem Teilnehmer beobachtet.

Sowohl die kommerziellen als auch die eigenentwickelten Testsysteme schnitten im aktuellen Ringversuch wieder einmal erfreulich gut ab. So erreichten die Inhouse-Testsysteme wie auch die kommerziellen Assays eine Richtigkeitsqoute von 100%, was die richtig-positiven Ergebnisse betrifft. Auch bei den richtig-negativen Ergebnissen waren keine signifikanten Unterschiede in den Richtigkeitsquoten von Inhouse-Testsystemen und kommerziellen Assays auszumachen.

Bis auf 29 Teilnehmer mit kommerziellen Testsystemen (im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ 3x LightMix Helicobacter Kit von TIB Molbiol, 1x H. pylori Real TM von Sacace Biotechnologies und 1x Modular diagnostic Kit H. pylori von VIASURE CerTest angegeben) verwendeten die Teilnehmer zum NAT-gestützten Nachweis von H. pylori selbstentwickelte, sog. Inhouse-Testsysteme.

Wie in der Testbeschreibung des RV 533 vermerkt, konnten die Teilnehmer auf freiwilliger Basis auch die vermeintliche Clarithromycin-Resistenz der untersuchten H. pylori-Isolate mitteilen. Diese Spezialuntersuchung zur molekularbiologischen Resistenztestung erfolgt in der Regel über die Amplifikation und Sequenzierung von charakteristischen Bereichen, innerhalb der H. pylori 23S rDNA bzw. der Sequenzanalyse dieses Genombereichs, mittels Hybridisierungssonden. Ergebnisse wurden hier von 45 der insgesamt 52 Teilnehmer mitgeteilt, und mit Ausnahme eines einzigen Teilnehmers waren die Ergebnisse der molekularen Resistenztestung auch durchweg korrekt.

Wie bereits bei den vorhergegangenen Runden dieses Ringversuchs mehrfach diskutiert, besteht die eigentliche Herausforderung bei dem Nukleinsäure-gestützten Nachweis von EHEC/STEC prinzipiell nicht so sehr in dem Nachweis sehr geringer Mengen an Zielorganismen, sondern vielmehr in der differenzierten Analyse und der Typisierung unterschiedlicher Shiga-Toxin-Gene und anderer putativer Pathogenitätsfaktoren (wie das für Intimin kodierende eae-Gen oder das für Enterohämolysin kodierende hlyA-Gen).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt daher zwei unterschiedliche, aber relativ stark EHEC-positive Proben: mit ca. 1x10⁵ CFU/mL (# 1915343: E. coli, stx_2c-, eae-, hlyA- und O26:H11-positiv) und mit ca. 1x10⁴ CFU/mL (# 1915341: E. coli, stx₁-, stx₂-, eae-, hlyA- und O157-positiv) sowie eine Probe mit 1x10⁴ CFU/mL eines EPEC-Isolats (# 1915342, eae-positiv) und eine Probe mit 1x10⁴ CFU/mL eines EIEC-Isolats (# 1915344).

In diesem Ringversuch waren keine „exotischen“ Shiga-Toxin-Gene vertreten, sodass, begründet auf die Verfügbarkeit von mittlerweile bestens etablierten NAT-gestützten Testsystemen und molekularbiologischen Differenzierungsstrategien für EHEC, bei allen Proben durchwegs hohe Richtigkeitsquoten – sowohl für positive, als auch für negative Befunde – verzeichnet werden konnten.

Die beiden EHEC-positiven Proben # 1915341 bzw. # 1915343 wurden jeweils von 139 bzw. 137 der insgesamt 139 Teilnehmer als richtig-positiv berichtet. Eine naheliegende Erklärung für die einzelnen falsch-negativen Ergebnisse bei der stx₁-, stx₂-, hly- und eae-positiven Probe # 1915341 und der stx_2c-, hly- und eae-positiven Probe # 1915343 gibt es aus Sicht der Ringversuchsauswertung nicht.

Sowohl das EPEC-Isolat in Probe # 1915342 (E. coli, eae-positiv, hlyA-negativ) als auch das EIEC-Isolat in Probe # 1915344 wurde jeweils von 136 bzw. 138 der insgesamt 139 Teilnehmer korrekterweise als negativ befundet. Die insgesamt 4 falsch-positiven EHEC-Ergebnisse bei den beiden letztgenannten Proben konnten wir auch nach (manueller bzw. visueller) Durchsicht der entsprechenden Ergebnisbögen nicht genauer auflösen.

Die wenigen Teilnehmer mit falsch-negativem Ergebnis für die beiden positiven EHEC-Proben verwenden vermutlich Testsysteme mit geringerer analytischer Sensitivität oder verlieren etwas Sensitivität beim Aufschluss des Probenmaterials. Insgesamt gesehen sollte das aber nicht weiter schlimm sein, da in den meisten der teilnehmenden Laboratorien ein NAT-gestützter Nachweis von Shiga-Toxin-Genen im Umfeld der EHEC-Diagnostik primär als Kulturbestätigungstest eingesetzt wird. Bei zukünftigen Ringversuchen werden wir uns bemühen, dass die meisten der positiven Proben wieder relativ hohe Mengen an Zielorganismen enthalten und der Schwerpunkt somit auf einer Abprüfung der analytischen Spezifität der eingesetzten Testsysteme liegt und weniger auf der dabei erzielten unteren Nachweisgrenze.

Neben Inhouse-Testsystemen werden zunehmend vorkonfektionierte kommerzielle Assays eingesetzt. In den Richtigkeitsquoten zeigte sich keine Über- bzw. Unterlegenheit eines Systems, was für die breite Etablierung PCR-/NAT-gestützter Testsysteme spricht. Inhibitionskontrollen wurden von 137 der 139 Teilnehmer durchgeführt, Inhibitionsereignisse wurden in keinem Fall beobachtet.

Zudem wurden von 122 Teilnehmern die Ergebnisse der molekulargenetischen Shiga-Toxin-Subtypisierung sowie des gezielten Nachweises von Intimin- (eae) und/oder Enterohämolysin (hlyA)-Genen mitgeteilt. Wenn auch die Typisierung nicht immer vollständig durchgeführt wurde, so waren diese Angaben zur Typisierung, zumindest in dem mitgeteilten Umfang, großteils korrekt. Lediglich drei Teilnehmer berichteten hier falsche Ergebnisse.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: BD Max Enteric Bacterial Panel (6x), Seegene Allplex Gastrointestinal Panel Bacteria II Assay (6x), Altona diagnostic RealStar EHEC PCR Kit (4x), TIB Molbiol LightMix modular stx-1/stx-2/eae (6x), TIB Molbiol EHEC Toxin Gene stx1 und stx2 (1x), AmpliGnost Verotoxin 1/2 (Differenzierung) PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), Mast Isoplex VTEC (1x), Biomerieux BioFire GI Panel (1x), Mikrogen ampliCube (1x), Amplex eazyplex EHEC complete (1x) und Biomerieux FILMARRAY GI Panel (1x).

Nachdem die Probenauswahl des letzten Ringversuchs mehr auf die analytische Sensitivität der eingesetzten Testsysteme abzielte, wollten wir uns im aktuellen Ringversuch wieder einmal auf die Prüfung der analytischen Spezifität fokussieren.

Daher wurden bei der Konzeption des Ringversuchs diesmal drei unterschiedliche Borrelien-Spezies an die Teilnehmer versandt. Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt jeweils eine Probe mit ca. 5x10⁵ Organismen/mL an Borrelia recurrentis (# 1915351), eine Probe mit ca. 5x10⁵ Organismen/mL an Borrelia garinii OspA Typ 7 (# 1915352), eine Probe mit ca. 5x10⁵ Organismen/mL an Borrelia lusitaniae (# 1915354) sowie eine Probe ohne Zielorganismen, die jedoch eine relativ hohe Menge an Treponema phagedenis enthielt (# 1915353, ~1x10⁵ Organismen/mL).

Nochmals eine kurze Rekapitulation: Schon die Tatsache, dass mittlerweile mehr als 20 verschiedene dem B. burgdorferi sensu lato-Komplex zugehörige Spezies beschrieben sind, impliziert erhebliches Problempotential für den PCR-/NAT-gestützten Nachweis von B. burgdorferi. B. garinii ist eine seit Langem bekannte, gesichert humanpathogene Spezies, die weit verbreitet in Europa und Asien vorkommt und häufig bei disseminierten Infektionen gefunden wird. Dagegen ist die Humanpathogenität für B. lusitaniae nicht gesichert. Diese Spezies findet sich relativ häufig in Zecken aus dem westlichen Mittelmeerraum incl. Nord-Afrika, wurde aber auch in anderen europäischen Ländern nachgewiesen. Als Wirte konnten Eidechsen identifiziert werden. Obwohl B. lusitaniae seit etwa 30 Jahren bekannt ist, existieren bislang lediglich zwei Humanisolate, beide aus Portugal und beide von atypischer Hauterkrankung. Nachdem bei eigenen Untersuchungen zur Sensitivität verschiedener Amplifikationsprotokolle der Nachweis dieser Spezies z.T. erhebliche Probleme bereitete, ist das Ergebnis des vorliegenden Ringversuchs – von 108 der insgesamt 121 Teilnehmer richtig positiv befundet – besonders erfreulich, sollte aber für die Teilnehmer mit negativem Ergebnis Anlass sein, den eingesetzten Test für den Nachweis von B. lusitaniae zu verbessern.

Einmal mehr muss in diesem Zusammenhang vor der nicht zu empfehlenden Untersuchung von Zecken, um daraus eine Therapieindikation abzuleiten, gewarnt werden: Abgesehen davon, dass die Studienlage keinen signifikanten Informationsgewinn für die Patientenversorgung erwarten lässt, sind diese Untersuchungen ohne weitergehende Identifikation der nachgewiesenen Spezies schlicht als gefährlich für den Patienten einzustufen, nicht zuletzt da die Angabe „B. burgdorferi s.l. nachgewiesen“ grundsätzlich auch nicht-humanpathogene Arten mit einschließt, somit unnötige und potentiell gefährliche therapeutische Interventionen nach sich zieht.

Nach dieser knappen Auffrischung zu den Ringversuchsergebnissen:

Der zuverlässige Nachweis von Borrelia garinii in der Probe mit relativ hoher Erregerlast (# 1915352 mit ~5x10⁵ Organismen/mL) bereitete nahezu keinem der 121 Teilnehmer signifikante Probleme. Da hier von einem Großteil der Anwender mit den unterschiedlichsten Testsystemen durchweg korrekte Ergebnisse berichtet wurden, handelt es sich bei dem einen falsch-negativen Ergebnis vermutlich um einen ringversuchstypischen „sporadischen Ausreißer“.

Auch für die negative Probe # 1915353, die lediglich eine relativ hohe Menge an Treponema phagedenis (1x10⁵ Organismen/mL) enthielt, wurde nahezu von allen Teilnehmern ein korrekt-negatives PCR/NAT-Ergebnis berichtet. Für die beiden übrigen Proben # 1915353 (Borrelia recurrentis, 5x10⁵ Organismen/mL) und # 1915354 (Borrelia lusitaniae, 5x10⁵ Organismen/mL) wurden jedoch deutlich höhere Raten an falschen PCR/NAT-Ergebnissen beobachtet.

Die Borrelia lusitaniae-Zielorganismen konnten dabei nur von 108 Teilnehmern mit ihren B. burgdorferi-spezifischen Testsystemen erkannt werden, und beim Vorliegen von nennenswerten Mengen an Borrelia recurrentis lieferten die PCR/NAT-Testsysteme von 24 Teilnehmern offenbar ein (falsch-)positives Ergebnis. Zumindest bei Probe # 1915354 (Borrelia lusitaniae) sollten falsch-negative Ergebnisse den betroffenen Teilnehmern Anlass zur gelegentlichen Überprüfung und Optimierung ihres jeweiligen NAT-gestützten Testsystems geben. Möglicherweise ist hier die Gesamtsensitivität des analytischen Workflows und/oder die Spezifität bzw. Abdeckung der unterschiedlichen Borrelien-Spezies des verwendeten PCR-NAT-Assays unzureichend.

Interne oder externe Inhibitionskontrollen wurden von nahezu allen Teilnehmern mitgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse der PCR-Reaktion wurden im Rahmen dieser Ringversuchsrunde von keinem Teilnehmer beobachtet.

Wie bei den vorhergehenden Ringversuchsrunden haben auch diesmal weniger als die Hälfte der Teilnehmer selbstentwickelte (Inhouse-)Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von Borrelien-DNA verwendet, kommerzielle Testsysteme wurden von 70 der 121 Teilnehmer eingesetzt.

Im Großen und Ganzen waren im Rahmen dieses Ringversuchs auch keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (Inhouse-)Testsystemen zu beobachten. Dennoch kann angemerkt werden, dass von den insgesamt 43 falsch-positiven bzw. falsch-negativen Ergebnissen für die Proben # 1915351 (B. recurrentis) und # 1915354 (B. lusitaniae) 31 davon durch Inhouse-Testsysteme generiert wurden. Gegebenenfalls sollte also die Sensitivität und/oder Spezifität mancher der hauseigenen Testsysteme überprüft werden. Darüber hinaus wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Mikrogen alphaCube Borrelia (5x), HAIN Lifescience FluoroType Borrelia (4x), BactoReal B. burgdorferi von Ingenetix (4x), BIORON RealLine Borrelien Kit (3x), Sacace Biotechnologies B. burgdorferi Real-TM (2x), Autoimmun Diagnostika GenID Zecken Screening Kit (1x), Diarella Borrelia real time PCR kit LC von Gerbion (1x), EliGene Borrelia RT von Elisabeth Pharmacon (1x), Demeditec GenFlow Borrelia plus PCR (1x) und Attomol B. burgdorferi Realtime LT (1x).

Wie schon beim letzten Mal hier vorab nochmals der Hinweis: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Legionella pneumophila aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Er ist daher NICHT für die Abprüfung von immunologischen Direktnachweisverfahren wie L. pneumophila SG1 Urin-Antigen Testen o.ä. geeignet. Einzelne Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets können daher typischerweise auch relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von L. pneumophila-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal nur eine Legionella pneumophila-positive Probe # 1915361, die mit einer Menge von ca. 10⁵ CFU/mL an L. pneumophila-Serogruppe 1 versetzt war. Die Probe # 1915364 des aktuellen Sets enthielt ca. 10⁵ CFU/mL an Legionella gormanii und Probe # 1915363 enthielt eine ca. zehnfach geringere Menge an L. gormanii (10⁴ CFU/mL). Die dritte für den entsprechenden Zielorganismus „negative“ Probe # 1915362 des aktuellen Probensets enthielt neben humanem Zellmaterial lediglich E. coli.

Die relativ stark positive Probe # 1915361 mit ca. 10⁵ CFU/mL an Legionella pneumophila SG1 wurde dabei von allen bis auf einen der insgesamt 123 Teilnehmer korrekterweise als positiv befundet.

Auch die „richtig-negative“ Probe # 1915362 (nur E. coli) wurde noch von 121 der 123 Teilnehmer als negativ für Legionella pneumophila-DNA befundet. Zwei Teilnehmer berichteten bei dieser Probe jedoch ein falsch-positives Ergebnis für L. pneumophila. Die betroffenen Laboratorien sollten mögliche laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. Kreuzkontaminationen während ihrer individuellen Probenextraktion und -abarbeitung ggf. kontrollieren und bestmöglich korrigieren.

Die beiden mit relativ hohen Mengen an Legionella gormanii (~1x10⁵ bzw. ~1x10⁴ CFU/mL) versetzten Proben # 1915364 bzw. # 1915363 wurden von 108 bzw. 114 der insgesamt 123 Teilnehmer mit ihren L. pneumophila-spezifischen PCR-/NAT-Testsystemen korrekt als negativ befundet. Jeweils 15 bzw. 9 Teilnehmer berichteten bei diesen beiden Proben ein falsch-positives Ergebnis für L. pneumophila-DNA, was auf eine Kreuzreaktion bzw. mangelnde Speziesspezifität der Zielsequenz zurückzuführen sein dürfte. Sechs dieser Teilnehmer gaben jedoch im Kommentarfeld des Befundbogens explizit an, ein Legionella spp. Genus-spezifisches Testsystem für die Analysen zu verwenden. Da mit dieser Art von Testsystemen offenbar nicht zwischen den einzelnen Legionella-Spezies unterscheiden werden kann oder soll, ist in diesen Fällen „positiv“ nachvollziebarerweise auch das wissenschaftlich korrekte Untersuchungsergebnis.

Vor allem Inhouse-Realtime-PCR-Protokolle mit ribosomalen Zielsequenzen zeigten in der Vergangenheit immer wieder Probleme bei der Speziesspezifität. Bei Verwendung von nested Block-Cycler PCR-Protokollen zur Amplifikation von spezifischen Bereichen der 16S rDNA und optionaler DNA-Sequenzierung sollte jedoch der Fehler eher auf Anwenderseite gesucht werden (beispielsweise Kontaminationsereignisse bei der Probenaufbereitung und -abarbeitung), da seriös etablierte 16S rDNA-sequenzbasierte Testkonzepte in jedem Fall die Unterscheidung zwischen Legionella gormanii und Legionella pneumophila erlauben sollten.

Inhibitionskontrollen wurden von 122 der 123 Teilnehmer durchgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse wurden offenbar nicht beobachtet.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs kamen bei insgesamt 86 von 123 Teilnehmern kommerzielle NAT-Testsysteme für den Nachweis von L. pneumophila-DNA im Untersuchungsmaterial zum Einsatz. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Seegene Allplex Respiratory Panel 4 (7x), GeneProof L. pneumophila PCR Kit (6x), AmpliGnost L. pneumophila von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (5x), Mikrogen ampliCube Respiratory Panel 1 (4x), Mikrogen Diagenode Legionella (1x), ARGENE Kits (3x), fast-track Diagnostics Atypical CAP (2x), fast-track Diagnostics Bacterial pneumonia CAP (1x), Biolegio Atypical Pneumonia-1 Assay (2x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (1x), Ingenetix Bacto Real L. pneumophila (2x), Sacace Biotechnologies L. pneumophila Real-TM (2x), BioGX ATYP (2x), Luminex NxTAG Respiratory Pathogen Panel (1x), PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x), Euroclone Duplica Real Time L. pneumophila Detection Kit (1x), AnDiatec Quidel L. pneumophila (1x) und ELITechGroup L. pneumophila Q-PCR Alert Amplimix (1x).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal drei positive Proben. Eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1915373; Salmonella enterica ser. enteritidis, ~1x10⁴ CFU/mL), zwei mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1915371; Salmonella enterica ser. enteritidis, ~5x10³ CFU/mL und (# 1915372; Salmonella enterica ser. enteritidis, ~1x10³ CFU/mL), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1915374), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Die Verfügbarkeit von spezifischen und mittlerweile gut evaluierten selbstentwickelten bzw. kommerziellen NAT-gestützten Analysesystemen führte diesmal zumindest bei einer der drei Salmonella enterica-positiven Proben des Ringversuchssets zu hohen Richtigkeitsquoten. Bei Probe # 1915373, die diesmal ca. 1x10⁴ CFU/mL an Salmonellen enthielt, berichteten zumindest 25 der insgesamt 28 Teilnehmer korrekterweise ein positives PCR/NAT-Ergebnis für Salmonella enterica-DNA. Bezüglich der analytischen Sensitivität wurde es bei den aktuellen Proben # 1915371 (~5x10³ CFU/mL) und # 1915372 (~1x10³ CFU/mL) jedoch „interessant“. Nur mehr 18 bzw. 16 der 28 Teilnehmer konnten hier ein positives Ergebnis beobachten. Auch in vorausgegangenen Ringversuchen waren bei relativ niedrigen Erregerlasten immer wieder falsch-negative Ergebnisse berichtet worden, was im Einzelfall eine Überprüfung der eingesetzten Testsysteme nach sich ziehen sollte. Offenbar lagen wir diesmal mit zwei der drei positiven Proben (ungewollt) ein wenig unter der durchschnittlichen Nachweisgrenze von routinemäßig evaluierten und funktionierenden Testsystemen, die erfahrungsgemäß etwa bei 5x10³ CFU/mL liegt. Daher wurden die Ergebnisse der Probe # 1915372 mit ca. 10³ CFU/mL als „edukativ“ klassifiziert und, ungeachtet des verwendeten Testsystems, bei der Erstellung der Zertifikate nicht als „falsch-negativ“ bewertet. Alle 3 Teilnehmer, die in der aktuellen Ringversuchsrunde leider kein Zertifikat erhielten, hatten bei allen 4 Proben negative Ergebnisse für Salmonella enterica-DNA angegeben. Da in der aktuellen Ringversuchsrunde keine falsch-positiven Befunde für die negative Probe # 1915374 (unmittelbar nach den drei positiven Proben innerhalb des Probensets) mitgeteilt wurden, deutet dies, im Vergleich zu manchen der vorhergehenden Ringversuchsrunden, zumindest auf eine verbesserte Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden diagnostischen Laboratorien hin. Inhibitionskontrollen wurden von allen Teilnehmern durchgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse wurden für keine der Proben berichtet. Kommerzielle Testsysteme kamen in 21 Fällen, selbstentwickelte Testsysteme in 8 Fällen zum Einsatz.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ von den Teilnehmern u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: TIB Molbiol LightMix Modular (2x), TIB Molbiol LightMix Salmonella (1x), BD Max Enteric Bacterial Panel (4x), Seegene Allplex Gastrointestinal Panel Bacteria 2 Assay (2x), Mikrogen Diagenode Gastroenteritis Bacteria Panel I (1x) und Mikrogen ampliCube Gastroenteritis Bacteria Panel I (1x).

Neben der wohl prominentesten Spezies Listeria monocytogenes sind auch eine Reihe weiterer Listerienspezies bekannt, für die inzwischen auch einige selbstentwickelte und kommerzielle NAT-gestützte Nachweisverfahren zur Verfügung stehen. Auch wenn diese Spezies (mit Ausnahme von L. ivanovii) zumeist nicht von humanpathogener Relevanz sind, werden wir uns bei der Konzeption des Probenmaterials für RV 538 vor allem zur Abprüfung der Spezifität individueller Testsysteme nicht nur auf L. monocytogenes beschränken. Daher werden, wie in dieser Ringversuchsrunde, auch andere Listerienspezies in der einen oder anderen Probe zu finden sein.

Im aktuellen Probenset befanden sich diesmal zwei Proben # 1915381 (ca. 1x10⁶ CFU/mL) und # 1915384 (ca. 5x10⁴ CFU/mL), die relativ hohe Mengen an L. monocytogenes-Zielorganismen enthielten und von allen der insgesamt 43 Teilnehmer korrekt erfasst wurden. Erfreulicherweise wurde auch die Probe #1915382, welche ausschließlich E. coli enthielt, von allen Laboratorien als „negativ“ befundet, was für eine sehr gute Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden Laboratorien spricht.

Da von einem Großteil der Teilnehmer die ausschließliche Verwendung von L. monocytogenes-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen angegeben wurde, ist der hohe Anteil an negativen Ergebnissen für die Probe # 1915383 (L. innocua, ca. 5x10⁴ CFU/mL) nicht weiter verwunderlich und konsequenterweise auch nicht als falsch-negativ für den eigentlichen Zielorganismus „Listeria spp.“ dieses Ringversuchs zu bewerten. Im Umkehrschluss spricht diese Datenlage für eine erfreulich hohe Spezifität der eingesetzten L. monocytogenes-spezifischen Testsysteme. Bei diesem Ringversuch besteht nämlich explizit die Option einer differenzierten Befundmitteilung: hält ein Teilnehmer lediglich ein L. monocytogenes-spezifisches NAT-Verfahren vor, so kann er dies über den Zusatzcode [71] im Ergebnisfeld angeben, und für die Erstellung des individuellen Zertifikats seitens INSTAND e.V. werden dann auch nur die L. monocytogenes-spezifischen Ergebnisse zur Bewertung herangezogen.

Von allen 43 Teilnehmern wurden Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen verwendet. Vermeintliche Inhibitionsereignisse bei der Aufarbeitung und Analyse der Ringversuchsproben wurden nicht beobachtet.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Sacace Biotechnologies L. monocytogenes Real-TM (3x), Progenie RealCycler Listeria spp. (2x), Biolegio Meningitis Panel-1 (1x), fast-track Diagnostics Real Time Neonatal sepsis (1x), Biomerieux BioFire FILMARRAY Meningitis/Encephalitis Panel (1x), Biomerieux easyMAG (1x), QIAGEN mericon Listeria spp Kit (1x) und Amplex eazyplex CSF direct (1x).

Zuerst einmal, wie gehabt, eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für den Direktnachweis von MRSA-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise Nasen- oder Wundabstrichen) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen an entsprechenden Zielorganismen. Für interessierte Teilnehmer soll an dieser Stelle noch einmal explizit darauf hingewiesen werden, dass sich mit Testsystemen, die üblicherweise für die Kulturbestätigung von S. aureus und/oder MRSA ausgelegt sind, diese geringen Mengen nicht immer zuverlässig nachweisen lassen werden. Eine Teilnahme an diesem Ringversuch ist daher nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von MRSA etabliert haben bzw. im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie an dieser Stelle bereits mehrfach thematisiert, basieren einige der derzeit etablierten eigenentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum Direktnachweis von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial auf einer getrennten Erfassung von S. aureus-spezifischen Markern, Staphylokokkenspezies-spezifischen Markern und dem mecA-Gen in der entsprechenden Nukleinsäurepräparation. Da sowohl bei S. aureus als auch bei Koagulase-negativen Staphylokokken das mecA-Gen für die phänotypische Ausprägung einer Methicillin-Resistenz verantwortlich ist, ist die Aussagekraft dieser PCR-gestützten Testsysteme für den Direktnachweis von MRSA aus nativem Patientenmaterial eingeschränkt, wenn beim Patienten eine gleichzeitige Besiedelung mit S. aureus und Koagulase-negativen Staphylokokken (die als klinische Isolate zumeist mecA-positiv sind) vorliegt. Einen attraktiven Ansatzpunkt zur Lösung dieses Problems bieten sog. SCCmec-basierte PCR-Testkonzepte, die auf dem Nachweis der SCCmec-Kassette innerhalb eines für S. aureus charakteristischen Genbereiches beruhen und die relativ gut konservierte Integrationsstelle der SCCmec-Kassette im S. aureus-Genom als Zielsequenz verwenden.

Dass aber auch die SCCmec-basierten Testkonzepte gewisse Limitationen haben, konnte im Rahmen einiger früherer Ringversuche eindrucksvoll aufgezeigt werden: hier wurden bereits einige MRSA-Isolate mit selten vorkommenden SCCmec-Subtypen oder MSSA-Isolate mit einer an den jeweiligen Enden typischen SCCmec-Sequenz, aber mit einer natürlichen Deletion des üblicherweise innerhalb der SCCmec-Kassette vorhandenen mecA-Gens versandt. Auch wenn wir uns im Rahmen dieser Ringversuchsserie zum Ziel gesetzt haben, primär die analytische Sensitivität und Spezifität (und somit die Routinetauglichkeit) der jeweils eingesetzten Testsysteme abzuprüfen, befand sich im aktuellen Ringversuch neben einer Mischung aus S. aureus und Koagulase-negativen Staphylokokken mit mecA-Gen und einem typischen CA-MRSA-Patientenisolat aber auch wieder ein in unseren Breiten derzeit noch (bzw. Gott sei Dank) eher seltener vorkommender MRSA-Stamm mit SCCmec-Kassette vom Typ V.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 12) der statistischen Auswertung dargestellt, enthielt die Probe # 1915392 diesmal ein Gemisch aus einem S. aureus-Isolat (MSSA, PVL-negativ, ~5x10⁴ CFU/mL) und einer Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies (S. haemolyticus; mecA-positiv, ~1x10⁵ CFU/mL), die Probe # 1915394 ein CA-MRSA-Patientenisolat (MRSA; PVL-positiv, ~1x10⁵ CFU/mL), Probe # 1915393 eine relativ hohe Menge eines Methicillin-resistenten S. aureus-Patientenisolats SCCmec Typ V (MRSA; PVL-negativ; ~1x10⁵ CFU/mL) und die Probe # 1915391 ein Methicillin-sensibles Staphylococcus epidermidis-Isolat (~1x10³ CFU/mL).

Erfreulicherweise wurden im aktuellen Ringversuch bei der positiven (CA-)MRSA Probe # 1915394 von nahezu allen der 293 Teilnehmer durchweg korrekt positive PCR/NAT-Ergebnisse mitgeteilt. Der technische oder methodische Hintergrund der 2 falsch-negativen Ergebnisse und einem als „fraglich“ klassifizierten Ergebnis bei dieser Probe ist seitens des Ringversuchsleiters nicht näher zu ergründen. Möglicherweise wurden PCR-Testsysteme mit unzureichender analytischer Sensitivität eingesetzt oder es ging während der Probenaufarbeitung ein gewisser Anteil der Template-DNA bei der DNA-Isolierung oder der Komplettierung der PCR-Ansätze verloren. Angesichts der mit 1x10⁵ CFU/mL nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollten falsch-negative Ergebnisse bei Probe # 1915394 den betroffenen Ringversuchsteilnehmern durchaus Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihrer entsprechenden NAT-gestützten Testsysteme geben.

Im Vergleich zu früheren Ringversuchen mit vergleichbarer Probenkonstellation wurde bei Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies (S. haemolyticus) in Probe # 1915392 diesmal eine erfreulicherweise hohe Richtigkeitsquote erzielt. Von 270 der insgesamt 293 Teilnehmer wurde dieses Gemisch mit den jeweils eingesetzten Testsystemen korrekt als „MRSA-negativ“ befundet, weitere 2 Teilnehmer haben ihr Ergebnis bei dieser Probe als „fraglich“ klassifiziert. Von einem dieser beiden Teilnehmer mit fraglichem Befund wurde explizit die Verwendung eines PCR-Testsystems angegeben, das auf einer getrennten Erfassung von S. aureus-spezifischen Markern und dem mecA-Gen beruht. Da mit dieser Art von Testsystemen zwar die Anwesenheit des mecA-Gens nachgewiesen werden kann, dessen Herkunft aber nicht zweifelsfrei dem Genom der ebenfalls nachgewiesenen S. aureus und/oder der Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies zugeordnet werden kann, ist in diesem Fall „fraglich“ auch das wissenschaftlich korrekte Untersuchungsergebnis. Die restlichen Teilnehmer berichteten bei dieser Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies falsch-positive Ergebnisse für MRSA. Diesen 21 Teilnehmern mit falsch-positivem Ergebnis für Probe # 1915392 ist dringend anzuraten, ihre Testsysteme zu überprüfen bzw. die methodische Eignung ihres jeweiligen Testkonzepts zu hinterfragen. In der mikrobiologischen Praxis wird relativ häufig die gleichzeitige Anwesenheit einer Methicillin-resistenten (also mecA-positiven) Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies und eines Methicillin-empfindlichen (also mecA-negativen) S. aureus-Isolates in dem entsprechenden Abstrichmaterial beobachtet. In diesem Fall würden die Testsysteme der letztgenannten 21 Teilnehmer vermutlich fälschlicherweise einen Hinweis auf das Vorliegen einer MRSA-Infektion bzw. -Besiedelung anzeigen (mit allen hinlänglich bekannten Konsequenzen für den betroffenen Patienten!). Wenn man sich die entsprechenden Richtigkeitsquoten für Probe # 1915392 in Tabelle 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 12) nach Testkonzepten differenziert betrachtet, dann wird schnell ersichtlich, dass alle der derzeit etablierten SCCmec-basierten Testsysteme bei diesem Gemisch korrekterweise MRSA-negative Befunde liefern (da das S. aureus-Genom der MSSA-Isolats ja de facto keine integrierte SCCmec-Kassette aufweist).

Insgesamt betrachtet spricht die Ergebnislage jedoch für eine hohe Zuverlässigkeit des NAT-gestützten Direktnachweises von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial. Auch diesmal scheinen die SCCmec-basierten Testkonzepte wieder einen gewissen analytischen Vorteil gegenüber Testsystemen mit einer getrennten Erfassung von speziesspezifischen Markern und dem mecA-Gen zu besitzen.

Wie aber in einigen der vorhergegangenen Ringversuche bereits mehrfach diskutiert, haben auch die erstgenannten Testkonzepte gewisse Limitationen. Dies wird im Rahmen des aktuellen Ringversuchs mit der Probe # 1915393 erneut auf eindrucksvolle Weise aufgezeigt. Denn das hier versandte MRSA-Isolat besitzt eine (in unseren Breiten derzeit noch eher seltener vorkommende bzw. anzutreffende) SCCmec-Kassette vom Typ V, deren terminale Nukleinsäuresequenz sich deutlich von den typischerweise anzutreffenden MRSA-Isolaten mit SCCmec-Kassettentyp I bis IV unterscheidet. Hier wurden lediglich von 248 der insgesamt 293 Teilnehmer richtig-positive Ergebnisse mitgeteilt. Zugegebenermaßen ist dieser SCCmec-Typ unter den MRSA-Patientenisolaten noch relativ selten und die Ergebniskonstellation dieses Ringversuchs sollte den diagnostischen Wert von SCCmec-basierten PCR-Testkonzepten in der mikrobiologischen Praxis nicht schmälern. Ungeachtet des verwendeten Testsystems wurde bei der Erstellung der Zertifikate ein negatives Ergebnis für die Probe # 1915393 auch nicht als „falsch-negativ“ bewertet.

Bei der Probe # 1915391, die ausschließlich Koagulase-negative Staphylokokken (S. epidermidis; mecA-positiv, ~1x10³ CFU/mL) und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt, wurde im Rahmen des aktuellen Ringversuchs dennoch von 2 der 293 Teilnehmer ein falsch-positives MRSA-Ergebnis beobachtet. Hier liegt (angesichts der sequenziellen Folge als erste der vier Einzelproben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets) das Auftreten eines sporadischen laborinternen Kontaminationsereignisses oder einer Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung nicht unmittelbar nahe. Wie bereits mehrfach im Rahmen dieser ausführlichen Ringversuchsdiskussionen erwähnt, sind solche „Ausreißer“ bei technisch aufwändigen Ringversuchen mit nahezu 300 Teilnehmern nichts Ungewöhnliches und bedürfen unseres Erachtens keiner weiteren Diskussion.

Insgesamt bleibt festzuhalten, dass der erfreulich große Anteil von richtig-positiven Ergebnissen bei zumindest einer der beiden positiven Proben, und die überwiegend richtig-negativen Befunde bei den 2 MRSA-negativen Proben, erneut für ein hervorragendes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminations- und Verschleppungsereignissen spricht.

Abgesehen von der besagten Probe mit dem SCCmec-Typ V-positiven MRSA-Isolat spricht die Ergebnislage dieses Ringversuchs erneut für eine hohe Zuverlässigkeit des NAT-gestützten Direktnachweises von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial. Für Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen interessiert sind und/oder überprüfen wollen, ob ihr spezifisches Testsystem MRSA mit SCCmec Typ V erfassen kann, stehen mit den Proben dieses Ringversuchs wieder standardisierte Rückstellproben zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Optional wird im Rahmen unserer Ringversuchsreihe auch der molekulargenetische Nachweis des putativen Pathogenitätsfaktors PVL (Panton-Valentine-Leukozidin) bzw. dessen kodierende Gene lukF/S-PV abgefragt. Entsprechende (PVL-negative) Ergebnisse der molekularbiologischen PVL-Testung wurden von 74 der insgesamt 293 teilnehmenden Laboratorien mitgeteilt, und mit Ausnahme eines Teilnehmers waren diese diesmal durchweg korrekt. Nähere Informationen zu der, nach wie vor hochaktuellen, cMRSA- bzw. CA-MRSA-Problematik finden sich beispielsweise in Linde et al. [2] und Witte et al. [3]. Ein gut evaluiertes Realtime-PCR-Protokoll für den gezielten Nachweis von PVL-positiven S. aureus-Isolaten findet sich beispielsweise in Reischl et al. [4]. Mittlerweile sind auch schon einige kommerzielle Realtime-PCR-Testsysteme für den zuverlässigen molekulargenetischen Nachweis von PVL-Genen bei MRSA- und MSSA-Isolaten verfügbar (z.B. von r-biopharm oder von TIB Molbiol).

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: HAIN Lifescience Genotype Staphylococcus (2x), Diarella MRSA real time PCR Kit TM von Gerbion (2x), Amplex eazyplex MRSA plus (2x), r-biopharm RIDAGENE PVL PCR (1x), GeneProof MRSA PCR Kit (1x), Autoimmun Diagnostika Gen ID MRSA combi (1x), Q-Bioanalytic Kit (1x), Congen SureFast MRSA 4Plex (1x) und Abacus Diagnostica GenomEra MRSA/SA Multi Swab assay kit (1x).

Eine wichtige Anmerkung wie immer vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Chlamydia pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von C. pneumoniae-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 14) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben. Eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1915403; C. pneumoniae, ~5x10⁶ IFU/mL), eine mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1915401; C. pneumoniae, ~1x10⁵ IFU/mL), eine Probe mit geringer Menge (# 1915404; C. pneumoniae, ~5x10³ IFU/mL), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1915402; nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen).

Den in Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 14) aufgeführten Daten ist zu entnehmen, dass im aktuellen Ringversuch erfreulicherweise alle Teilnehmer die Zielorganismen in zwei der insgesamt drei positiven Proben # 1915401 (ca. 1x10⁵ IFU/mL) und # 1915403 (ca. 5x10⁶ IFU/mL) sicher und zuverlässig nachweisen konnten.

Die etwas geringere Menge an C. pneumoniae-Zielorganismen in der Probe # 1915404 (ca. 5x10³ IFU/mL) konnte noch von 137 der insgesamt 139 Teilnehmer korrekt als positiv befundet werden. Auch für die Probe ohne Zielorganismen # 1915402 (Escherichia coli) berichteten alle bis auf drei Teilnehmer ein korrektes negatives Ergebnis. Dies unterstreicht einerseits aufs Neue die hohe analytische Spezifität der eingesetzten PCR/NAT-Testsysteme zum Nachweis von C. pneumoniae-DNA. Andererseits könnte es sich bei den drei falsch-positiven Ergebnissen für die Probe # 1915402 eventuell um sporadische laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung handeln. Kreuzreaktivitäten der C. pneumoniae-spezifischen PCR-Testsysteme mit DNA E. coli erscheinen eher als unwahrscheinlich. Inhibitionskontrollen wurden von 138 der insgesamt 139 Teilnehmer durchgeführt und eine signifikante Inhibition der PCR-Reaktion wurde in keiner der versandten Proben beobachtet. Selbstentwickelte Inhouse-NAT-Testsysteme zur Detektion von C. pneumoniae-DNA wurden von 44 Laboratorien eingesetzt, alle weiteren Teilnehmer vertrauten auf kommerzielle Assays.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: GeneProof C. pneumoniae PCR Kit (10x), ARGENE Chla/Myco pneumo r-gene (8x), Mikrogen ampliCube (6x), fast-track Diagnostics Kits (6x), Seegene Allplex Respiratory Panel 4 (5x), Sacace Biotechnologies C. pneumoniae Real-TM (4x), AmpliSens M. pneumoniae/C. pneumoniae (3x), BioGX ATYP (3x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (2x), BioMerieux C. pneumoniae + M. pneumoniae r-gene Kit (2x), Luminex NxTAG Respiratory Pathogen Panel (1x), Pneumonia für EASY-PLEX 384 System (1x), RespiFinder SMART (1x), Ingenetix Bacto Real Chlamydophila pneumoniae (1x) und Euroclone Duplica Real Time C. pneumoniae Detection Kit (1x).

Aufgrund zahlreicher Rückfragen von Teilnehmern der vergangenen Ringversuche hier eine wichtige Anmerkung vorab: der Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Mycoplasma pneumoniae ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Mycoplasma pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut, wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial, konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Dieses Mal waren jedoch keine Proben mit geringen Mengen an Zielorganismen im ausgesandten Probenset vertreten.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 15) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal zwei positive Proben: Probe # 1915413 mit einer hohen Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x10⁶ Genomkopien/mL) und Probe # 1915412 mit einer niedrigen Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x10⁴ Genomkopien/mL). Um im Rahmen der Möglichkeiten dieses Ringversuchskonzepts auch die Spezifität der eingesetzten Testsysteme abzuprüfen, enthielt Probe # 1915411 (Mycoplasma genitalium; ~1x10⁵ Genomkopien/mL) diesmal nennenswerte Mengen an einer zu dem Zielorganismus verwandten Mykoplasmen-Spezies. Probe # 1915414 enthielt ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli.

Alle 158 Teilnehmer konnten die DNA der M. pneumoniae-Zielorganismen in der relativ stark positiven Probe # 1915413 zuverlässig nachweisen, bei der schwächer positiven Probe # 1915412 war dies noch 153 Teilnehmern möglich. Für die Probe #1915414 ohne Zielorganismus erreichten uns zwei falsch-positive Ergebnisse, ansonsten wurde diese Probe korrekt als „negativ“ klassifiziert. Wie auch in vorausgegangen Ringversuchsrunden wurden diesmal wieder einige (4) falsch-positive Ergebnisse für die zweite „negative“ Probe (# 1915411, ~10⁵ Genomkopien/mL Mycoplasma genitalium) berichtet, 154 Labors befundeten diese Probe korrekt als negativ.

Bei den falsch-positiven Ergebnissen könnte es sich eventuell um sporadische laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung handeln. Eventuelle Kreuzreaktivitäten der M. pneumoniae-spezifischen PCR-Testsysteme mit DNA von anderen Mykoplasmen-Spezies sollten von den betroffenen Teilnehmern abgeprüft und die entsprechenden Testkonzepte ggf. nachgebessert werden. Insgesamt jedoch zeigte die Ergebniskonstellation in einem breiten Teilnehmerfeld mit unterschiedlichsten Testsystemen und PCR-Protokollen eine relativ hohe analytische Spezifität der eingesetzten PCR/NAT-Testsysteme zum Nachweis von M. pneumoniae-DNA. Mit einer Ausnahme wurden von allen Teilnehmern Inhibitionskontrollen mitgeführt, für keine der ausgesandten Proben wurden Inhibitionsereignisse berichtet. Selbstentwickelte PCR-/NAT-Testsysteme kamen bei 45 Teilnehmern zum Einsatz, während in den anderen Laboratorien kommerzielle Testsysteme verwendet wurden.

Die Richtigkeitsquoten lagen bei Inhouse- und vorkonfektionierten Assays auf vergleichbarem Niveau.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs wurde von 51 Teilnehmern die Verwendung von kommerziellen Testkits aufgeführt: LightMix M. pneumoniae [n=15], Autoimmun Diagnostika CAP Bacteria Kit [n=3], AmpliGnost MP PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe [n=6], Diagenode MP/CP [n=6], r-Biopharm RIDAGENE M. pneumoniae [n=9] und GeneProof M. pneumoniae PCR Detection Kit [n=12], sowie „andere kommerzielle Testsysteme“ [n=57]. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: fast-track Kits (7x), Mikrogen ampliCube Respiratory Panel 1 (6x), Sacace Biotechnologies M. pneumoniae/C. pneumoniae Real-TM (5x), Seegene Allplex Respiratory Panel 4 (5x), ARGENE Ch/Myc. pneumoniae (4x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (4x), AmpliSens M. pneumoniae/C. pneumoniae-FRP PCR Kit (3x), BioGX ATYP (2x), Luminex NxTAG Respiratory Pathogen Panel (2x), Euroclone Duplica Real Time M. pneumoniae Detection Kit (1x), Alethia Mycoplasma PCR (1x), PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x) und Ingenetix Bacto Real Mycoplasma pneumoniae (1x).

Auch hier wieder eine Anmerkung vorweg: Der kombinierte Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Coxiella burnetii & Bacillus anthracis ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an C. burnetii- und B. anthracis-DNA aus geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt zwei Proben mit verschiedenen Mengen an C. burnetii (~1x10⁵ Genomkopien/mL in Probe # 1915422 und ~1x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 1915421), eine Probe mit DNA des B. anthracis-„Pasteur“-Isolats (~1x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 1915423), eine Probe mit DNA des B. anthracis-UR-1-Isolats (~1x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 1915421), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1915424), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Der Übersichtlichkeit halber haben wir uns bei diesem kombinierten Ringversuch entschlossen, die Ergebnislage für die beiden unterschiedlichen Erreger auch in zwei getrennten Tabellen darzustellen: für C. burnetii in den Tabellen 2 und 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 16) sowie für B. anthracis in den Tabellen 4 und 5 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 17).

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Life Technologies LSI VetMAX Absolute quant. C. burnetii (4x), Altona diagnostics RealStar Anthrax PCR Kit (2x), Progenie RealCycler Coxiella burnetii (2x), AmpliSens B. anthracis-FRT (1x), AmpliSens C. burnetii-FRT (1x), VIASURE Tick Borne Diseases Real Time PCR Detection Kit (1x), Master Diagnostica Chips (1x) und Gerbion Diarella Q-fieber (1x).

Coxiella burnetii: Wie bereits im vorausgegangenen Ringversuch gestaltet sich auch in der aktuellen Runde die Ergebnislage erfreulich klar. Sowohl die etwas stärker positive Probe # 1915422 mit ca. 10⁵ Genomkopien C. burnetii/mL als auch die zweite positive Probe # 1915421 des Probesets (ca. 5x10⁴ Genomkopien/mL) wurde von allen der insgesamt 53 Teilnehmer mit ihren jeweiligen C. burnetii-spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert.

Diese Ergebnislage deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus den vorherigen Ringversuchen. Bei der Probe ohne Zielorganismus # 1915424 (nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen) sowie der zweiten „negativen“ Probe # 1915423, welche ca. 1x10⁴ Genomkopien/mL B. anthracis-DNA enthielt, wurden ebenfalls mehrheitlich korrekt-negative Ergebnisse berichtet.

Mit 42 diagnostischen Labors, welche Inhouse-Testsysteme zum spezifischen Nachweis von C. burnetii verwenden, waren die selbstentwickelten Assays den vorkonfektionierten kommerziellen Testkits zahlenmäßig überlegen. Mit zwei Ausnahmen enthielten die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von C. burnetii-DNA aller Teilnehmer eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Lediglich von zwei Teilnehmern wurden bei je 2 Einzelproben des 4-er Sets Inhibitionsereignisse beobachtet.

Bacillus anthracis: Die Ergebnislage des Ringversuchs „Bacillus anthracis-DNA“ ist ebenfalls relativ schnell dargestellt. Mit nur einer Ausnahme konnten alle 28 Teilnehmer mit ihren jeweils vor Ort etablierten B. anthracis-spezifischen PCR/NAT-gestützten Testsystemen die beiden negativen Proben ohne entsprechende Zielorganismen # 1915422 (nur C. burnetii mit ca. 10⁵ Genomkopien/mL in einer Suspension aus humanen Zellen) sowie # 1915424 (nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen) korrekt als negativ befunden.

Ebenfalls von allen der 28 Teilnehmer wurden korrekt positive Ergebnisse für die Probe # 1915421 (B. anthracis-Stamm UR-1, ~1x10⁴ Genomkopien/mL und C. burnetii ~1x10⁴ Genomkopien/mL) berichtet. Die zweite „positive“ Probe (# 1915423) enthielt den B. anthracis-Stamm Pasteur: dieser ist zwar positiv für das Virulenzplasmid pXO2 und die B. anthracis-spezifischen chromosomalen Sequenzmarker rpoB und dhp61, jedoch (im Gegensatz zum Stamm UR-1) negativ für das „lethal- und edema-factor, sowie protective antigen-(pagA)-“tragende Virulenzplasmid pXO1. 24 der 28 Teilnehmer berichteten für diese Probe korrekt positive Befunde. Die vier Teilnehmer mit falsch-negativem bzw. fraglichem Ergebnis sollten den Ringversuch zum Anlass nehmen, die Performance der verwendeten Testsysteme sowie die laborinternen Prozessabläufe zu evaluieren.

Wie immer stehen nach erfolgreichem Abschluss der aktuellen Ringversuchsrunde den Kolleginnen und Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen für C. burnetii-DNA und B. anthracis-DNA interessiert sind, mit den Proben dieses Ringversuchs auch gewissermaßen „standardisierte Rückstellproben“ zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Francisella tularensis & Brucella spp.“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Francisella tularensis-DNA und Brucella spp.-DNA aus geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben (Tabelle 1, Anhang 1 [Anh. 1], S. 18) enthielt zwei Proben mit ähnlichen Mengen an F. tularensis subsp. holarctica-DNA (~1x10⁴ CFU/mL in Probe # 1915431 und # 1915432), zwei Proben mit verschiedenen Mengen an Brucella melitensis-DNA (~1x10⁵ CFU/mL in Probe # 1915434 und ~1x10⁴ CFU/mL in Probe # 1915432), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1915433), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Master diagnostica Tick-borne bacterial flow chip (1x), AmpliSens Brucella-FRT (1x) und Biotecon Diagnostics foodproof Brucella Detection Kit (1x).

Francisella tularensis: Kurz und knapp: alle 33 Teilnehmer haben sowohl die beiden positiven Proben (# 1915431 und # 1915432) als auch die beiden negativen Proben (# 1915433 und # 1915434) korrekt klassifiziert. Inhibitionskontrollen wurden durchwegs mitgeführt, jedoch keine inhibitorischen Ereignisse berichtet.

Brucella spp: Hier das gleiche Bild wie bei Francisella tularensis: Alle ausgesandten Proben wurden von allen 30 Teilnehmern korrekt als positiv (# 1915432 und # 1915434) oder negativ (# 1915431 und # 1915433) berichtet. Mit einer Ausnahme wurden Inhibitionskontrollen mitgeführt, Inhibitionsereignisse wurden jedoch nicht beobachtet.

Der seit 2015 in das reguläre Ringversuchsprogramm von INSTAND e.V. aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Carbapenemase-Gene“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zur molekularen Resistenztestung bzw. dem Direktnachweis von charakteristischen Carbapenemase-Genen aus DNA-Präparationen von Reinkulturen an Enterobacteriaceae konzipiert. Zum orientierenden Herantasten an die technische Eignung und die „Praktikabilität“ der versandten Probenmaterialien werden wir uns in den ersten Runden dieses methodisch anspruchsvollen Ringversuchs zur molekularen Resistenztestung auf die Abprüfung eines kleinen Spektrums der derzeit häufigsten Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae beschränken: KPC, VIM, OXA-48-ähnliche Gene, GES-Carbapenemasen, NDM, IMP und GIM.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 20) der Auswertung dargestellt, enthielt das aktuelle Set drei Proben mit Carbapenem-resistenten Enterobacteriaceae: Probe # 1915441 enthielt Klebsiella pneumoniae-Zielorganismen mit dem KPC-3-Gen (ca. 1x10⁶ Genomkopien/mL), Probe # 1915442 enthielt Citrobacter freundii-Zielorganismen mit dem GIM-1-Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL) und Probe # 1915444 enthielt Serratia marcescens-Zielorganismen mit dem VIM-1-Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL). Die vierte Probe # 1915443 war als eine Art von Negativkontrolle ausgelegt – sie enthielt lediglich E. coli ohne Carbapenemase-Gene.

87 der 90 Teilnehmer stellten erfreulicherweise ein Carbapenemase-Gen in der Probe # 1915441 fest. Für die Probe mit VIM-1-positiver Serratia marcescens (# 1915444) wurden mit einer Ausnahme korrekte Ergebnisse berichtet. Hoch lag die Richtigkeitsquote auch für die Probe # 1915443, hier berichteten 88 Teilnehmer die Probe als „Carbapenemase-negativ“. Schwächen zeigten sich bei der Detektion der GIM-1-positiven Citrobacter freundii in Probe # 1915442, die 72 Teilnehmern „durchrutschte“. Grund hierfür ist möglicherweise, dass das GIM-1-Gen gerade in einigen ‚Multiplex‘-Testformaten nicht enthalten ist.

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Direktnachweis von Carbapenemase-Genen aller Teilnehmer enthielten durchwegs eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Seegene Allplex Entero-DR Assay (3x), Autoimmun Diagnostika Gen ID Carbapenemase (2x), AmpliGnost Carbapenemase PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x) und MAST Isoplex creart (1x).

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Clostridium difficile“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Clostridium difficile-DNA aus geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert.

Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 21) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben drei positive Proben. Probe # 1915452 mit einer relativ hohen Menge an Clostridium difficile, (~1x10⁵ CFU/mL), Probe # 1915451 mit ca. zehnfach geringerer Menge (~1x10⁴ CFU/mL), Probe # 1915454 mit ca. hundertfach geringerer Menge (~1x10³ CFU/mL) sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1915453), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Die beiden „positiven“ Clostridium difficile-Proben # 1915451 und # 1915452 wurden erfreulicherweise von 168 bzw. 167 der 168 teilnehmenden Laboratorien korrekt als „positiv“ klassifiziert. Falsch-negative Ergebnisse sollten auch hier zum Anlass genommen werden, das verwendete Testsystem bzgl. analytischer Sensitivität und Spezifität zu evaluieren und auch die laborinternen Prozesse der Probenaufbereitung und -abarbeitung kritisch zu hinterfragen. Letzteres gilt insbesondere für Teilnehmer mit falsch-positiven Ergebnissen für die lediglich E. coli-enthaltende Probe # 1915453. Eine Kreuzreaktion der verwendeten Testsysteme mit E. coli erscheint unwahrscheinlich, am ehesten sind Kreuzkontaminationen im Prozess der Probenbearbeitung ursächlich. Die Probe mit dem geringsten Gehalt an Clostridium difficile (# 1915454, ~1x10³ CFU/mL) konnte noch von 145 Teilnehmern als positiv klassifiziert werden. Die Teilnehmer mit falsch-negativem Ergebnis sollten dies zum Anlass nehmen, die Sensitivität des verwendeten Testsystems zu evaluieren. Inhibitionskontrollen wurden von allen Teilnehmern mitgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse wurden für keine der Proben berichtet.

Wie in Tabelle 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 21) angegeben, verwendete der Großteil der Teilnehmer kommerzielle Testsysteme. In dieser Ringversuchsrunde zeigten sich (vergleichbar mit der vorausgegangenen) zwischen den kommerziellen Testsystemen und den Eigenentwicklungen keine signifikanten Unterschiede bezüglich Sensitivität und Spezifität.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Altona diagnostic RealStar C. difficile PCR Kit (7x), r-Biopharm RIDAGENE CD Toxin A/B (6x), r-Biopharm RIDAGENE Hospital Stool Panel (4x), Meridian Bioscience illumigene C. difficile (3x), HAIN Lifescience Kits (6x), AmpliGnost C. difficile Toxin A und B von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (2x), Seegene Allplex GI Bacteria Assay (3x), Cobas Liat C. diff (2x), Abacus Diagnostica GenomEra C. difficile (1x), Illumipro C. difficile (1x) und Quidel Solana C. difficile Toxines (1x).

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Vancomycin-resistente Enerokokken“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an DNA Vancomycin-resistenter Enterokokken aus geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 22) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben drei Vancomycin-resistente Enterococcus-Stämme: Probe # 1915461 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen Enterococcus faecalis vanA-resistent, ~1x10⁵ CFU/mL), Probe # 1915462 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen Enterococcus faecium vanB-resistent, ~1x10⁵ CFU/mL) und Probe # 1915463 (Enterococcus gallinarum vanA- und vanC-resistent, ~1x10⁵ CFU/mL). Im Ringversuchsprobenset befand sich zudem eine Probe ohne Zielorganismen (# 1915464), die nur humane Zellen und E. coli enthielt.

Erfreulicherweise wurden die beiden „positiven“ Proben # 1915461 und # 1915462 mit vanA- bzw. vanB-tragenden Enterokokken mit lediglich einer Ausnahme von allen Teilnehmern als „VRE-positiv“ klassifiziert. Auch der vanA- und vanC-tragende E. gallinarum (# 1915463) wurde zuverlässig als VRE identifiziert. Wie bereits im vorangegangenen Ringversuch waren alle eingereichten vanA/vanB-Differenzierungen korrekt.

Aus Sicht der Krankenhaushygiene und der Auswirkungen auf das Patientenmanagement mag der Nachweis eines intrinsisch Vancomycin-resistenten Enterococcus gallinarum aufgrund der (zumeist) chromosomalen Kodierung des Resistenzgens unproblematisch erscheinen, und ein positiver Befund nicht immer ein klassischer „VRE im Sinne der Krankenhaushygiene“ sein. Im Falle einer Infektion mit dem Erreger kommt dem korrekten Nachweis einer Vancomycin-Resistenz natürlich eine hohe Bedeutung zu. Einige Testsysteme bieten neben dem Nachweis von vanA/B/C-Resistenzgenen auch Informationen über die zugehörige Enterokokken-Spezies und können bei bestimmten Befundkonstellationen die Interpretation erleichtern bzw. das erforderliche Hygienemanagement eines Patienten konkretisieren.

Die „negative“ Probe # 1915464 war erfreulicherweise durchwegs als „VRE-negativ“ berichtet worden. Bei den eingesetzten Testsystemen zeigt sich in den letzten Jahren ein Trend hin zu kommerziell erhältlichen, vorkonfektionierten Systemen. Unterschiede in Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu Inhouse-Assays waren jedoch nicht zu erkennen. Insgesamt war die Ergebnislage dieser Probenaussendung sehr erfreulich.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: GeneProof VRE PCR Kit (2x), BioGX auf BD Max (1x), Roche LightCycler VRE Detection Kit (1x), AmpliGnost Vancomycin A/B Resistenz differenz. von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), VIASURE Vancomicin Resistente Real Time PCR Detection Kit (1x) und Seegene (1x).

Nach intensiven Vorarbeiten zum Proben-Design, zur praktischen Umsetzung und der Aussendung von zwei sogenannten „Piloten“ wird der komplexe Ringversuch RV 547 „Urogenital-Panel“ in der aktuellen Ringversuchsrunde erstmalig im Rahmen des regulären Ringversuchsprogramms von INSTAND e.V. durchgeführt und die Ergebniskonstellation hier diskutiert. Das überaus heterogene Spektrum an eingesetzten Testsystemen erschwert natürlich nach wie vor eine strukturierte und übersichtliche Auswertung der auf den Report-Formularen mitgeteilten Ergebnisse. Daher haben wir im Vergleich zu den übrigen Ringversuchen der hier diskutierten Ringversuchsreihe „Bakterien- und Pilzgenomnachweis PCR/NAT“ die Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 23) etwas modifiziert. Dort ist der Übersicht halber nun die Anzahl an positiven und negativen Ergebnissen für die in den jeweiligen Proben anwesenden Pathogene aufgeführt. Mit dieser Lösung sollte man eine einigermaßen informative Darstellung über das erfasste Erregerspektrum und über die Leistungsdaten einzelner Testsysteme erhalten können.

Im Großen und Ganzen haben die 57 aktuell registrierten Teilnehmer die Erreger in den 4 Einzelproben entsprechend den methodischen Möglichkeiten ihrer Testsysteme zufriedenstellend nachweisen können. Dies spricht zum einen für die Praktikabilität unseres innovativen Multiplex-Ringversuchskonzepts und zum anderen für die zuverlässige Erfassung der Zielorganismen innerhalb der jeweils testspezifisch abgedeckten Erregerspektren der eingesetzten kommerziellen oder eigenentwickelten PCR/NAT-Verfahren. Je ein Teilnehmer konnte in den Proben # 1915471 bzw. # 1915473 keine Zielorgansimen nachweisen und bei einem weiteren Teilnehmer wurde die Ureplasma urealyticum-„Komponente“ in der Kombination mit Gardnerella vaginalis (Probe # 1915471) offenbar nicht zuverlässig detektiert.

Wie bereits in der vorhergehenden Ringversuchsdiskussion erwähnt, haben wir für die aktuelle und für kommende Aussendungen des RV 547 ein einfaches Schema in Form einer 7-stelligen Zahlenkombination entwickelt, über das die einzelnen Teilnehmer das erfasste Erregerspektrum ihrer individuellen Testsysteme und Multiplex-Assays auf dem Report-Formular vorab mitteilen. Für die Erteilung von Zertifikaten macht es nachvollziehbarerweise nur Sinn, dass diejenigen Parameter bewertet und testiert werden, die von den individuellen Teilnehmern im Rahmen ihres diagnostischen Workflows prinzipiell auch als positiv bzw. negativ erfasst werden können.

Der Ringversuchsleiter ist natürlich stets für weitere konstruktive Kommentare und Vorschläge aus dem Teilnehmerkreis dankbar. Trotz des relativ vielfältigen Spektrums an unterschiedlichen Testsystemen und -konzepten werden wir uns nach Kräften bemühen, die Teilnehmer bei den zukünftigen Ringversuchsrunden mit aussagekräftigen Zertifikaten versorgen zu können.

Unter Code [20] „Multiplex Kit“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Seegene Allplex STI Essential Assay (9x), Seegene Allplex Genital ulcer Assay (1x), Seegene Anyplex STI-7 Detection (1x) und EUROIMMUN Euroarray STI-7 (1x).

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: fast-track Diagnostics Urethritis plus (6x), r-Biopharm RIDAGENE STI Mycoplasma panel (5x), BIORON RealLine single und multiplex Kits (3x), BioGX Mycoplasma/Ureaplasma (2x), AmpliSens C. trachomatis, Ureaplasma, M. genitalium und M. hominis (1x), AmpliGnost Kits von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x) und Sacace Biotechnologies T. pallidum Real-TM (1x).

Der Ringversuch Nr. 560 „Pilzgenomnachweis PCR/NAT Pneumocystis jirovecii“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis von Pneumocystis jirovecii-DNA in geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Das aktuelle Set enthielt zwei positive Proben (siehe Tabelle 1, Anhang 1 [Anh. 1], S. 24): eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1915602; Pneumocystis jirovecii, ca. 1x10⁵ CFU/mL), eine Probe mit einer geringeren Menge (# 1915603; Pneumocystis jirovecii, ca. 1x10⁴ CFU/mL), sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 1915601 und # 1915604) aber mit E. coli und einer Suspension aus humanen Zellen.

Der Nachweis des Zielorganismus aus der stärker positiven Probe (# 1915602, ca. 1x10⁵ Genomkopien/mL) gelang allen 117 Teilnehmern. Probe # 1915603 mit einer zehnfach geringeren Erregermenge wurde diesmal immerhin noch von 114 der insgesamt 117 Teilnehmer korrekt als „positiv“ identifiziert. Für die Kolleginnen und Kollegen mit falsch-negativen/fraglichen Befunden in dieser Ringversuchsrunde bleibt unser Appell unverändert bestehen, die Sensitivität der verwendeten Testsysteme zu hinterfragen, da eine Erregermenge von 1x10⁴ nicht als „äußerst gering“ einzuschätzen ist.

Bei den Proben ohne Zielorganismen (# 1915601 und # 1915604), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielten, wurde im Rahmen des aktuellen Ringversuchs erfreulicherweise von keinem Teilnehmer ein falsch-positives bzw. fragliches Ergebnis berichtet (Tabelle 2, Anhang 1 [Anh. 1], S. 24). Insgesamt betrachtet sprechen die durchwegs richtig-negativen Ergebnisse für ein hervorragendes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationsereignissen im Teilnehmerkreis. Alle eingesetzten Testsysteme beinhalteten offenbar auch Inhibitionskontrollen, und eine nennenswerte Inhibition wurde von keinem der Teilnehmer berichtet. Bei den verwendeten Testsystemen wurden von ca. einem Drittel Inhouse-Assays eingesetzt und bei zwei Drittel der teilnehmenden Laboratorien kamen kommerzielle Testsysteme zum Einsatz. Unterschiede in Sensitivität, Spezifität oder Kontaminationsanfälligkeit waren nicht zu erkennen.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [26] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Altona diagnostics RealStar P. jirovecii PCR Kit (8x), fast-track Diagnostics P. jirovecii PCR Kit (5x), Biolegio Atypical Pneumonia-1 Assay (3x), BioGX P. jirovecci (1x) und Amplex eazyplex P. jirovecii (1x).