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Nach erfolgreicher Etablierung dieser neuen Ringversuchs-Serie wollen wir hier auch für Kolleginnen und Kollegen, die bisher noch nicht an diesen Ringversuchen teilgenommen haben, die Ergebnisse der aktuellen Ringversuche für den PCR/NAT-gestützten Nachweis von Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, EHEC/STEC, Borrelia burgdorferi sensu lato, Legionella pneumophila, Salmonella enterica und Listeria spp., MRSA bzw. cMRSA, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetti, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Brucella spp., Pneumocystis jirovecii (vorm. P. carinii), Clostridium difficile (Toxingene), VRE (Vancomycin-resistente Enterokokken) und der molekularen Resistenztestung für Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae sowie dem vor kurzem neu ins Programm aufgenommenen Multiplex-Panel für Erreger von Urogenitalinfektionen darstellen und kurz diskutieren.

Für nähere Informationen über die Zusammensetzung der Ringversuchsproben, dem Sinn und Zweck dieser neuen Möglichkeit zur externen Qualitätskontrolle im Umfeld der Nukleinsäurediagnostik sowie zu den Eckdaten unseres flexiblen Ringversuchskonzepts sei hier auf unsere initiale Veröffentlichung in der Zeitschrift „Der Mikrobiologe“ verwiesen [1]. Gerne werden wir hier auch weiterhin in regelmäßigen Abständen und in ähnlicher Form über die Ergebnislage, Auswertung und Analyse unser zukünftigen Ringversuche berichten.

Wie bei allen anderen Ringversuchen erfolgt die Anmeldung zu ausgewählten Teilen der Reihe „Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis (PCR/NAT)“ über die Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in Medizinischen Laboratorien (INSTAND e.V.), Düsseldorf (https://www.instand-ev.de). Nach Abschluß des jeweiligen Ringversuchs werden die Ergebnisse der einzelnen Teilnehmer dort zentral erfasst und anhand von individuellen Bewertungskriterien werden die schriftlichen Zertifikate erstellt. Zusätzlich stehen für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe weiterer Informationen auch im Internet unter „http://www.udo-reischl.de“, Unterpunkt „INSTAND-Ringversuche (PCR/NAT)“, sowie auf der Homepage von INSTAND e.V. als pdf-Files zum freien Download bereit.

Neben der Aussendung von lyophilisierten Probenmaterialien zur systematischen Abprüfung von NAT-gestützten Testsystemen für derzeit 19 unterschiedliche bakterielle und fungale Zielorganismen bzw. Pathogenitätsfaktoren gab es im Rahmen dieser Ringversuchsrunde auch wieder gewisse „Highlights“. So wurden beispielsweise im aktuellen RV 530 Chlamydia trachomatis & Neisseria gonorrhoeae zwei Proben mit Mischungen von unterschiedlichen Mengen an C. trachomatis und Mengen an N. gonorrhoae Zielorganismen versandt. Interessanterweise ließ sich auch bei diesen Konstellationen die DNA von C. trachomatis im Gemisch mit N. gonorrhoeae DNA mit den meisten der kommerziellen und in-house PCR-Testsysteme zuverlässig nachweisen. In einer Probe befanden sich dabei relativ geringe Mengen an Gonokokken DNA in komplexer Mischung mit C. trachomatis infizierten Zellen. Hier konnten einige kommerzielle und in-house PCR-Testsysteme nur die DNA von C. trachomatis im Gemisch zuverlässig nachweisen.

In einer der 4 Einzelproben des aktuellen Ringversuchs RV 532: Bordetella pertussis befanden sich relativ hohe Mengen eines klinischen Bordetella holmesii Isolats, das eine Genkopie des üblicherweise für den B. pertussis-Nachweis verwendeten IS481 Insertionselements aufweist. Auch solche Varianten können in unseren Breiten durchaus vorkommen und führten im Rahmen des aktuellen Ringversuchs bei zahlreichen Teilnehmern (bzw. bei den von ihnen eingesetzten Testsystemen) zu falsch-positiven PCR Ergebnissen für B. pertussis.

Innerhalb der aktuellen Ringversuchsrunde wurde in einer der 4 Einzelproben des RV 539 MRSA/cMRSA erneut eine Mischung aus einem Methicillin-empfindlichen S. aureus-Isolat (MSSA) und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies ausgesandt, das methodenbedingt bei einem Teil der aktuell eingesetzten PCR/NAT Testsysteme zu falsch-positiven oder zu „fraglichen” MRSA Ergebnissen führte. In der mikrobiologischen Praxis der PCR/NAT-gestützten MRSA Direktnachweisverfahren wird relativ häufig die gleichzeitige Anwesenheit einer Methicillin-resistenten (also mecA-positiven) Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies und eines Methicillin-empfindlichen (also mecA-negativen) S. aureus-Isolates in dem entsprechenden Abstrichmaterial beobachtet. Obwohl bei dieser Probe, im Vergleich zu früheren Ringversuchen mit ähnlicher Probenkonstellation, diesmal erfreulicherweise eine etwas höhere Richtigkeitsquote erzielt werden konnte, bestätigt die Beobachtung von knapp 8% falsch-positiven MRSA Ergebnissen erneut die Sinnhaftigkeit und auch Notwendigkeit des im Rahmen der PCR/NAT-Ringversuchsdiskussionen bereits mehrfach thematisierten begleitenden kulturellen Nachweises von MRSA. Denn selbst diejenigen Anwender, die mit ihren PCR-Testsystemen alle Proben des aktuellen MRSA Ringversuchs zuverlässig detektieren und korrekt befunden konnten, sollten sich aufgrund der bekannten Vielfalt und der Dynamik von „exotischeren” SCCmec Kassettentypen (oder dem Auftreten von mecA Gen-negativen aber dafür mecC Gen-tragenden MRSA Isolaten) nie wirklich sicher sein dass sie auch zukünftig alle der zirkulierenden Varianten problemlos und zuverlässig erfassen.

Mit der Auswahl eines etwas breiteren Spektrums von relevanten Carbapenemase-Genen bestätigte sich im Rahmen des Ringversuchs RV 544 Carbapenemase-Gene erneut die Vermutung, dass viele der derzeit verwendeten kommerziellen sowie in-house Testsysteme zur molekularen Carbapenemase Detektion noch gewisse Lücken hinsichtlich der Abdeckung von unterschiedlichen Carbapenemase-Genen aufweisen. Im aktuellen Ringversuch scheint dies insbesondere für Isolate mit dem etwas exotischeren GES-5 zu gelten. Das Isolat aus dem Citrobacter freundii-complex mit GES-5 wurde lediglich von 11 der insgesamt 88 Teilnehmer detektiert.

Alle Teilnehmer sind natürlich weiterhin dazu aufgerufen, attraktive Parameter für eine zukünftige Erweiterung des Spektrums an Zielorganismen vorzuschlagen und deren mögliche Umsetzung mit dem Ringversuchsleiter zu diskutieren.

Aktueller Hinweis auf neue Ringversuche: Aufgrund einiger Anfragen aus dem Teilnehmer- und Kollegenkreis haben wir zwei zusätzliche Ringversuche etabliert, die nach erfolgreichen Probe-Ringversuchsrunden in 2018 im kommenden Jahr nun in das reguläre Portfolio „Bakterien- und Pilzgenomnachweis PCR/NAT“ von INSTAND e.V. übernommen werden:

• Der Ringversuch RV 543: Francisella tularensis wurde in der aktuellen Aussendung bereits optional um den Zielorganismus Brucella spp. erweitert und wird zukünftig routinemäßig als kombinierter Ringversuch angeboten.
• Für die externe Qualitätssicherung zukünftig kommerziell verfügbarer (und damit wohl auch vermehrt eingesetzten) PCR/NAT-gestützten Nachweisverfahren für Urogenital-Infektionen haben wir mit der aktuellen Aussendung bereits einen neuen Ringversuch etabliert, der vom Konzept her jeweils einige der nachfolgenden Erreger in unterschiedlichen Kombinationen und Mengen innerhalb des 4-er Panels enthält: RV 547 „Urogenital-Panel“ zum Nachweis von Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis und ggf. Treponema pallidum. Nach dem großen Interesse innerhalb der Teilnehmerschaft und dem erfolgreichem Abschluss der beiden Pilotringversuchsrunden im Mai und November diesen Jahres wird RV 547 im kommenden Jahr nun ebenfalls in das reguläre Portfolio „Bakterien- und Pilzgenomnachweis PCR/NAT“ von INSTAND e.V. übernommen.

Vorab auch noch eine Anmerkung zu den statistisch ermittelten und in den jeweiligen Tabellen 3 aufgeführten Leistungsdaten von kommerziellen PCR/NAT-Testsystemen. Auffällig bei vielen der aktuellen aber auch bei einigen der früheren Ringversuche ist das unterschiedlich gute Abschneiden von Teilnehmern mit ein und demselben kommerziellen, vorkonfektionierten und teilweise auch automatisierten und/oder kartuschenartig geschlossenen Testsystemen.

Die meisten dieser Assays sind zudem auch noch IVD zertifiziert – mit allen aufwändigen herstellerseitigen Vorkehrungen zur möglichst zuverlässigen Durchführung und standardisierten Ergebnisinterpretation. Die auffällige „Streuung der Performance“ (bzw. das Auftreten einzelner Ausreißer) unterstreicht umso mehr die Bedeutung der aktuell vorgegebenen Qualitätsstandards, wie beispielsweise das regelmäßige Mitführen von geeigneten Extraktions-, Positiv- und Negativ-Kontrollen sowie Schulungen und kontrollierte Maßnahmen zur Vermeidung von exogenen Kontaminationsmöglichkeiten in PCR/NAT-Arbeitsbereichen, die u.a. im Rahmen der aktuellen RiLiBÄK, der Akkreditierung und der praxisorientiert verfassten MIQ-1 gefordert werden. Deren Sinnhaftigkeit und Stringenz mag aus Anwendersicht ja gelegentlich bezweifelt werden, wird aber in diesen Ringversuchsrunden (sozusagen von neutraler Warte aus) dennoch immer wieder aufs Neue bestätigt.

Neben den überaus motivierten und engagierten Mitarbeitern der verschiedenen Sollwert-Laboratorien unterstützen uns bei der Konzeption und Auswertung der zahlreichen Ringversuche zum Bakterien- und Pilzgenomnachweis PCR/NAT noch zahlreiche Kolleginnen und Kollegen aus unserem Hause. Allerherzlichsten Dank für ihre spontane Bereitschaft sowie ihr ehrenamtliches Engagement für unsere gemeinsamen Bemühungen zur externen Qualitätssicherung molekularbiologischer Nachweisverfahren in der infektiologischen Diagnostik.

Entsprechend des Grundgedankens unserer Ringversuchsaktivitäten wurde auch bei der Konzeption des aktuellen Ringversuchs zum „Bakteriengenomnachweis mittels PCR oder anderer Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT)“ bei einigen Zielorganismen der Versand von Proben mit relativ niedrigen Erregerzahlen angestrebt.

In den aktuellen Ringversuchssets befanden sich daher erneut einige Proben mit relativ geringer Menge folgender Zielorganismen: Neisseria gonorrhoeae (Probe # 1825303), Borrelia burgdorferi (Probe # 1825353), Legionella pneumophila (Probe # 1825364), Listeria spp. (Probe # 1825384), Coxiella burnetii (Probe # 1825421), Ureaplasma parvum (Probe # 1825472) sowie Pneumocystis jirovecii (Probe # 1815603).

Im Rahmen der Testentwicklung bzw. Testoptimierung können diese Probensätze, u.a. als Qualitätskontrollen oder als standardisierte Sensitivitätsmarker, für die Austestung der unteren Nachweisgrenze von eigenentwickelten Nukleinsäure-gestützten Testsystemen dienen. An dieser Stelle möchten wir auch darauf hinweisen, dass zahlreiche Rückstell-Probensätze der früheren Ringversuche noch verfügbar sind, und bei Bedarf über den Ringversuchsleiter formlos nachbestellt werden können.

Mit Ausnahme der zuvor erwähnten „grenzwertig positiven“ Einzelproben wurden die Mengen der entsprechenden Zielorganismen in den Probensätzen der aktuellen Ringversuchsrunde wieder relativ deutlich über der Nachweisgrenze von „durchschnittlich sensitiven PCR/NAT-Testkonzepten“ eingestellt. Diese definieren wir wie folgt: als Richtwert für die Bewertung von Ringversuchsergebnissen gilt das 10- bis 50-fache der unteren Nachweisgrenze durchschnittlich sensitiver PCR-Protokolle unter Standardbedingungen (z.B. 50 µl Block-Cycler Reaktionsansätze, 35 PCR-Zyklen, ggf. entsprechende real-time PCR-Protokolle; gut evaluierte Primersequenzen).

Bei den meisten Probenmaterialien der aktuellen Ringversuchsrunde stellen falsch-negative Ergebnisse damit einen deutlichen Hinweis auf ernstzunehmende Mängel innerhalb der eingesetzten Verfahren zur Nukleinsäure-Extraktion, Amplifikation und Detektion dar.

Falsch-positive Ergebnisse sind dagegen in der Regel als Hinweis auf eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung und/oder auf mangelnde Spezifität der eingesetzten Testsysteme zu betrachten.

In bewährter Form werden im Folgenden die Ergebnisse der jeweiligen erregerspezifischen Ringversuche dargestellt. Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1]) zeigt dabei die Probenzusammensetzung und das erwartete Ergebnis (Sollwert) mit den entsprechenden Codenummern der Ergebnisbögen. Die von den einzelnen Teilnehmern mitgeteilten Ergebnisse werden in Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1]) nach der Häufigkeit der Mitteilung von positiven oder negativen Ergebnissen, und in Tabelle 3 (Anhang 1 [Anh. 1]) nach der absoluten Anzahl der richtig positiven und richtig negativen Ergebnisse, sowie deren prozentualem Anteil (Befundhäufigkeit) je Amplifikationssystem bzw. Testkonzept aufgeschlüsselt.

Für die objektive Bewertung von kommerziellen Testsystemen sollten neben der rein statistischen Betrachtung der mitgeteilten Ringversuchsergebnisse auch die Anzahl und vor allem die methodische bzw. technische Qualifikation der individuellen Teilnehmer berücksichtigt werden. Da wir im Zuge unserer Ringversuche aber das gesamte Spektrum von spezialisierten Expertenlabors bis hin zum „Gelegenheitsanwender“ abdecken, müssen die arithmetisch ermittelten Richtigkeitsquoten bei der Bewertung einzelner Testsysteme immer mit einem gewissen Toleranzbereich betrachtet werden.

Auch im Rahmen des hier diskutierten Ringversuchs waren wieder einige Auffälligkeiten hinsichtlich der Spezifität und Sensitivität von bestimmten Testkonzepten, und der für den Nachweis verwendeten Zielsequenzen, zu beobachten. Diese Aspekte sind bei der Auswertung des jeweiligen Ringversuchs aufgeführt und dort auch kurz diskutiert. Zusätzlich stehen für die früheren, für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe zusätzlicher Informationen (wie die graphisch dokumentierten Ergebnisse unserer quantitativen real-time PCR-Testsysteme oder die Ergebnisse einiger kommerzieller PCR-Testsysteme) auch unter folgender Internetadresse: http://www.udo-reischl.de; Unterpunkt „Auswertung der Ringversuche“ und natürlich auch über die Homepage von INSTAND e.V. (https://www.instand-ev.de) als pdf-Files zum freien Download bereit. An dieser Stelle möchte ich mich noch einmal ausdrücklich bei den geschätzten Kolleginnen und Kollegen für ihre zahlreichen und überaus konstruktiven Kommentare und Anregungen zu den Ausführungen in dieser Ringversuchsdiskussion sowie deren tatkräftige Unterstützung bei der Konzeption und dem Aufbau neuer Ringversuche bedanken.

Die Ergebnislage des aktuellen Ringversuchs deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus vorangegangenen Ringversuchen zum kombinierten NAT-gestützten C. trachomatis- und Gonokokken-Nachweis. Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt jeweils eine Probe mit einer relativ hohen Menge an C. trachomatis (# 1825303 ~5x10⁵ IFU/mL), und zwei Proben mit einer 10-fach niedrigeren Menge an C. trachomatis (# 1825301 und # 1825304, ~5x10⁴ IFU/mL und ~1x10⁵ IFU/mL). Eine der C. trachomatis-positiven Proben (# 1825304) war dabei zugleich mit ca. 5x10⁵ CFU/mL an N. gonorrhoeae und eine mit einer sehr geringen Menge an N. gonorrhoeae Zielorganismen (# 1825303; ~5x10² CFU/mL) versetzt. Die Probe # 1825302 enthielt diesmal keine Zielorganismen, sondern lediglich E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen.

Trotz der relativ geringen Erregermenge in einigen der drei unterschiedlich zusammengesetzten positiven Proben und der gleichzeitigen Anwesenheit von C. trachomatis und N. gonorrhoeae DNA führte auch diesmal die Verfügbarkeit gut evaluierter und zum Teil automatisierter NAT-gestützter Analysesysteme für Chlamydia trachomatis zu hohen Richtigkeitsquoten sowohl für positive, als auch für negative CT und GO Befunde.

Der Übersichtlichkeit halber werden wir bei diesem kombinierten Ringversuch (CT/NG) die Ergebniskonstellation zukünftig in 7 getrennten Tabellen (Anhang 1 [Anh. 1], S. 1–4) darstellen. Damit wird die diagnostische Performance der jeweiligen Testsysteme beim Nachweis von CT und NG aussagekräftiger (Tabelle 4: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei CT, Tabelle 6: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei NG; jeweils gefolgt von den Richtigkeitsquoten nach aufgeführten Testsystemen in den Tabellen 5 und 7).

Auch wenn die schwächer positive Probe # 1825301 des aktuellen Ringversuchs nur mit einer relativ geringen Menge an C. trachomatis-Zielorganismen versetzt worden waren, fanden sich unter den von insgesamt 250 Teilnehmern mitgeteilten NAT-Ergebnissen für C. trachomatis erfreulicherweise keine falsch-negativen Ergebnisse. Bei den beiden ca. 2-fach bzw. 10-fach stärker CT-positiven Proben # 1825304 bzw. # 1825303 des aktuellen Ringversuchs wurde lediglich von je einem der 250 Teilnehmer bei Probe # 1825303 und Probe # 1825304 ein falsch-negatives Ergebnis mitgeteilt. Bei den insgesamt 5 falsch-positiven CT Ergebnissen für Probe # 1825302 handelt es sich vermutlich um Kontaminationsereignisse bei der Probenaufbereitung und -abarbeitung der gleichzeitig prozessierten CT-positiven Proben. Den betroffenen Laboratorien sollten diese Ergebnisse Anlass geben, ihren individuellen diagnostischen Workflow hinsichtlich der Kontaminationssicherheit während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik zu überprüfen und gegebenenfalls zu optimieren.

Im Rahmen des NAT-gestützten Gonokokken-DNA Nachweises wurden für die zwei positiven Proben # 1825303 und # 1825304 (N. gonorrhoeae; ca. 5x10² bzw. 5x10⁵ CFU/mL) diesmal von 12 der insgesamt 250 Teilnehmer falsch-negative Ergebnisse für Gonokokken DNA mitgeteilt.

Auffällig war die Häufung von falsch-negativen Ergebnissen (n=10) bei Probe # 1825303, die neben einer relativ geringen Menge an Gonokokken zugleich signifikante Mengen an C. trachomatis infizierten Zellen enthielt. Wie bereits bei einigen früheren Ringversuchsrunden beobachtet, sind offenbar einige der im Teilnehmerkreis eingesetzten kommerziellen und in-house PCR/NAT Testsysteme etwas störanfällig was den sensitiven Nachweis von Gonokokken bei gleichzeitiger Anwesenheit von C. trachomatis betrifft. Da sich das hier beobachtete „Sensitivitätsproblem“ offenbar weitgehend auf solche NAT-Testsysteme beschränkt, die erregerspezifische RNA-Zielsequenzen nachweisen oder auf einem RNA-basierten Amplifikationsprozess (TMA; Transcription-Mediated Amplification, o.ä.) beruhen (s.u.), kann dem großen Rest des Teilnehmerfeldes erneut eine erfreulich gute analytische Sensitivität und Spezifität ihrer CT- und GO-spezifischen NAT Testsysteme, sowie der angewandten Prozeduren zur Probenaufarbeitung und -prozessierung attestiert werden. Aufgrund der relativ geringen Menge an N. gonorrhoeae Zielorganismen in Probe # 1825303 wurden die mitgeteilten Ergebnisse diesmal nicht in die Bewertung für die Zertifikate mit einbezogen. Dies ist auch durch die beiden grau schraffierten Felder in Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 1) und Tabelle 6 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 3) gekennzeichnet.

Selbst wenn mit der schwach-positiven Probe # 1825303 die untere Nachweisgrenze der meisten hochsensitiven und standardisierten PCR/NAT-gestützten Testsysteme zum Nachweis von N. gonorrhoeae DNA noch nicht erreicht oder unterschritten wurde, stehen mit den Rückstellproben des Ringversuchs RV 531 November 2018 den Teilnehmern mit hohem Anspruch an die individuelle Testsensitivität wieder geeignete Sets zur Überprüfung und Optimierung ihrer jeweiligen NAT-gestützten Testsysteme zur Verfügung. Auch angesichts der nach wie vor anhaltenden Diskussion um das „Pooling“ von entsprechendem Untersuchungsmaterial bleibt der Aspekt der analytischen Sensitivität der jeweils eingesetzten Testsysteme bedeutsam.

Bei den insgesamt 7 falsch-positiven GO Ergebnissen bei den beiden N. gonorrhoeae-negativen Proben # 1825301 und # 1825302 handelt es sich vermutlich nicht um unspezifische Kreuzreaktionen sondern vielmehr um isolierte Kontaminationsereignisse oder Ringversuchstypische „sporadische Ausreißer“, da von einem Großteil der Anwender mit den unterschiedlichsten Testsystemen hier durchweg korrekte Ergebnisse berichtet wurden.

Angesichts der streng normierten und standardisierten Abarbeitungsprotokolle von kommerziellen Testsystemen bleibt es für den Ringversuchsleiter jedes Mal aufs Neue verwunderlich, dass ein nennenswerter Anteil der teilnehmenden Laboratorien mit den betroffenen Testsystemen erfolgreich die vorgegebenen Zielwerte erreicht. Ohne denjenigen Teilnehmern, die mit bestimmten kommerziellen Testsystemen die Zielwerte nicht erreichen, zu nahe treten zu wollen, deutet dieser Umstand in diesen Fällen dann wohl eher auf individuelle Abweichungen vom Protokoll oder bestimmte Fehler bei der Probenabarbeitung, als auf intrinsische Unzulänglichkeiten, der in der Regel gut evaluierten Testsysteme hin.

Ich glaube, es ist auch für den Leser dieser Ringversuchsdiskussion weitgehend nachvollziehbar, dass wir als Organisatoren von Testkonzept- und Testplattform-übergreifenden Ringversuchen bei der Konfektionierung unserer Probenmaterialien leider nicht jede Besonderheit im Abarbeitungsprotokoll von kommerziellen Testsystemen berücksichtigen oder unterschiedliche Arten von Ringversuchsprobenmaterial für bestimmte Testsysteme bereitstellen können.

Auf diesen Umstand wurde bereits bei früheren Ringversuchen mehrfach im Zusammenhang mit den RNA-Zielsequenzen der AMPLIFIED CT Testkits oder der APTIMA COMBO 2 Testkits (Hersteller: Gen-Probe Inc.) hingewiesen. Werden von Teilnehmern bestimmte NAT-Testsysteme eingesetzt, die erregerspezifische RNA-Zielsequenzen nachweisen oder auf einem RNA-basierten Amplifikationsprozess (TMA; Transcription-Mediated Amplification, o.ä.) beruhen, so kann mit dem hier versandten Probenmaterial offiziell keine regelgerechte Abprüfung der entsprechenden Sensitivitäten unter Routinebedingungen gewährleistet werden. Aber selbst wenn das Herstellungsverfahren unserer Ringversuchsproben primär nicht auf die Stabilisierung von RNA-Molekülen hin optimiert und getestet wurde, so konnten dennoch sowohl bei der aktuellen, wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchsrunden, von vielen Teilnehmern mit RNA-gestützten Testsystemen hohe Richtigkeitsquoten erzielt werden. Aktuell wurden sowohl die C. trachomatis Zielorganimsen in allen drei CT-positiven Einzelproben als auch die Neisseria gonorrhoeae Zielorganismen in der Probe # 1825304 von allen der 8 Teilnehmer mit RNA-basierten Gen-Probe Testsystemen erfolgreich nachgewiesen und die entsprechenden Zertifikate erlangt.

Entsprechende Inhibitionskontrollen wurden von allen der 250 Teilnehmern durchgeführt (bzw. deren regelgerechte Durchführung und Auswertung in Protokollbogen angegeben). Inhibitionsereignisse wurden diesmal nicht mitgeteilt.

Bei den ermittelten Richtigkeitsquoten für Teilnehmer mit dem Roche COBAS Amplicor, COBAS TaqMan, dem Becton Dickinson ProbeTec, Abbott RealTime CT/NG, Artus CT, LightMix CT/NG oder anderen Testsystemen muss berücksichtigt werden, dass im Rahmen dieser Ringversuchsauswertung in Tabelle 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 2) nicht zwischen dem spezifischen Nachweis von Chlamydien und Gonokokken differenziert wurde. Mit dem Großteil dieser kombinierten Testsysteme wurden insgesamt erfreulich hohe Richtigkeitsquoten sowohl für die positiven als auch für die negativen Ergebnisse beobachtet. Um eine detaillierte Bewertung der C. trachomatis- und GO-spezifischen NAT-Komponenten dieser kombinierten Testsysteme zu ermöglichen, wurden diesmal zusätzlich die Tabellen 4 bis 7 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 2–4) angefertigt. In den Tabellen 4 und 5 sind dabei nur die C. trachomatis (CT)-spezifischen Ergebnisse und in den Tabellen 6 und 7 nur die Neisseria gonorrhoeae (GO)-spezifischen Ergebnisse dargestellt und statistisch ausgewertet.

Anmerkung: Bevor durch einen kurzen Blick auf die prozentualen Richtigkeitsquoten in diesen Tabellen ein eventuell etwas zu voreiliger Rückschluss auf die diagnostische „Performance“ bestimmter kommerzieller Testsysteme gezogen wird, sollten erst die effektiven Teilnehmerzahlen berücksichtigt werden, die den dargestellten Richtigkeitsquoten arithmetisch zugrunde liegen.

Im handschriftlichen Kommentarfeld der Ergebnisformulare wurden unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: BD Max CT/GC/TV assay (15x), Seegene Allplex STI Essential Assay (5x), Seegene Anyplex™ II STI-7 Detection (4x), QIAGEN artus CT/NG QS-RGQ Kit (4x), GeneProof N. gonorrhoeae/C. trachomatis PCR Kit (3x), Sacace Biotechnologies N. gonorrhoeae/C. trachomatis Real-TM (3x), VERSANT CT/GC DNA Assay von Siemens (2x), EUROIMMUN Euroarray STI-11 (2x), BIORON RealLine single und multiplex CT/NG Kits (2x), fast-track Diagnostics Urethritis plus (3x), fast-track Diagnostics Urethritis basic (1x), fast-track Diagnostics Kits (2x), Diagenode N. gonorrhoeae (S-DiaGono) (2x), Diagenode (S-Dia CT) (1x), Diagenode N. gonorrhoeae Real Time PCR kit (1x), Diagenode C. trachomatis Real Time PCR kit (1x), Mikrogen ampliCube STD Panel 1 (2x), AmpliSens C. trachomatis-FRT PCR Kit (1x), AmpliSens N. gonorrhoeae-screen-FRT PCR Kit (1x), HAIN Lifescience FluoroType CT/NG (1x), Aptima Combo 2 assay CT/GC (1x), Medac/Goffin CT/NG Assay (1x), VIASURE sexually transmitted diseases RT PCR Detetion Kit (1x), DiagCor GenoFlow STD array test kit (1x), Autoimmun Diagnostika Kit (1x) und Autoimmun Diagnostika Gen ID RDB2110 STD (1x).

Unabhängig von der Art des verwendeten Testsystems soll in diesem Zusammenhang auch noch einmal darauf hingewiesen werden, dass in Gegenwart von relativ hohen Mengen an Zielorganismen (bzw. deren Nukleinsäure) die interne Kontrollreaktion aufgrund der „Konkurrenzsituation“ mit der Amplifikation der eigentlichen Zielsequenz durchaus negativ ausfallen kann, obwohl keine Inhibition der PCR-Reaktion im eigentlichen Sinne vorliegt.

Das Probenset des aktuellen Ringversuchs enthielt diesmal eine Probe mit ca. 5x10⁵ IFU/mL an C. trachomatis (# 1825313), eine Probe mit ca. 1x10⁵ IFU/mL an C. trachomatis (# 1825314), eine Probe mit ca. 5x10⁴ IFU/mL an C. trachomatis (# 1825311), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1825312), die ausschließlich nicht infizierte Zellen und Escherichia coli enthielt.

Wie Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 5) der statistischen Auswertung zu entnehmen ist, wurden von den 70 Teilnehmern bei der C. trachomatis-negativen Probe # 1825312 nur ein falsch-positive Ergebnis und bei den drei C. trachomatis-positiven Proben (# 1825311, # 1825313 und # 1825314) diesmal auch nur ein falsch-negatives Ergebnis mitgeteilt. Das ist doch insgesamt eine sehr erfreuliche Datenlage, die keiner großen Diskussion bedarf.

Die markante Übereinstimmung der aktuellen Ergebniskonstellation mit den Beobachtungen und hervorragenden Richtigkeitsquoten vorhergegangener Ringversuche mit ähnlicher Menge an C. trachomatis-Zielorganismen kann erneut als Beleg für eine hohe Zuverlässigkeit und Konstanz der eingesetzten Testsysteme sowie der aktuellen Kits und automatisierten Testplattformen zur Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Prozessierung angesehen werden.

Inhibitionskontrollen wurden von allen der insgesamt 70 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal von keinem der Teilnehmer beobachtet. In diesem Zusammenhang sei kurz angemerkt, dass wir auch im aktuellen Ringversuch keine der Einzelproben absichtlich mit inhibitorischen Substanzen versetzt haben. Erfreulicherweise waren im Rahmen dieses Ringversuchs im Großen und Ganzen keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität und Spezifität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und den selbstentwickelten in-house-Testsystemen zu beobachten. Trotz der relativ geringen Menge an Zielorganismen bewegten sich die Richtigkeitsquoten dabei durchweg auf erfreulich hohem Niveau.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. folgende Testsysteme aufgeführt: GeneProof C. trachomatis PCR Kit (2x), BD Max CT/GC/TV assay (2x), Seegene Allplex STI Essential Assay (1x), Sansure Biotech C. trachomatis DNA Fluorescence Diagnostic Kit (1x), VERSANT CT/GC DNA Assay von Siemens (1x), EUROIMMUN Euroarray STI-11 (1x), Autoimmun Diagnostika GenID RDB2110-STD (1x), Autoimmun Diagnostika Kit (1x), AmpliSens C. trachomatis-FRT (1x), BIORON RealLine C. trachomatis (1x) und IAB C. trachomatis RG detect (1x).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine Probe mit relativ hoher Menge an B. pertussis Zielorganismen (# 1825322 mit 5x10⁴ CFU/ml), eine Probe mit einem klinischen Isolat von Bordetella holmesii (# 1825324 mit 1x10⁴ CFU/mL), und eine Probe mit einem klinischen Isolat von Bordetella parapertussis (# 1825323 mit 1x10⁵ CFU/mL) als „verwandte“ Spezies. Die Probe # 1825321 enthielt diesmal keine Zielorganismen, sondern lediglich E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen.

Die Verfügbarkeit von offensichtlich inzwischen sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesystemen für den Nachweis von Bordetella pertussis DNA führte diesmal erneut sowohl bei den positiven als auch bei den negativen Proben zu relativ hohen Richtigkeitsquoten.

Der spezifische Nachweis von Bordetella pertussis-DNA in der Probe # 1825322 bereitete den insgesamt 146 Teilnehmern offenbar keine allzu großen Schwierigkeiten. Lediglich von 2 Teilnehmern wurde hier ein falsch-negatives Ergebnis berichtet und ein Teilnehmer klassifizierte seinen Befund als „fraglich“. Für die Probe # 1825323 des aktuellen Sets mit einer hohen Menge von ~1x10⁵ CFU/mL an Bordetella parapertussis wurden ebenfalls überwiegend korrekt negative Ergebnisse mitgeteilt. Vier der insgesamt 146 Teilnehmer beobachteten mit ihren B. pertussis-spezifischen PCR/NAT Testsystemen hier jedoch ein falsch-positives Ergebnis.

Im RV 532 befand sich diesmal wieder ein IS481-positives Bordetella holmesii-Isolat, das (Methoden- bzw. Zielsequenz-bedingt) mit vielen der B. pertussis-spezifischen NAT-Testsysteme kreuzreagierte. Diese Problematik spiegelt sich beispielsweise in einer Veröffentlichung aus Frankreich wider [2].

Insgesamt betrachtet scheint aber der Vorteil einer hochsensitiven Detektion von B. pertussis und B. holmesii über die Verwendung der repetitiven IS481-Zielsequenz die Nachteile einer (eher aus akademischer Sicht wünschenswerten) Differenzierungsmöglichkeit zwischen den beiden Spezies in der PCR-Routinediagnostik mehr als aufzuwiegen. Zudem scheint in unseren Breiten B. holmesii eher selten aufzutreten (siehe [3]) und Infektionen mit beiden Spezies scheinen eine gleichermaßen „behandlungsbedürftige“ Symptomatik hervorzurufen. Eine Abgrenzung zu den übrigen (IS481-negativen) Bordetella-Spezies muß jedoch aus diagnostischer Sicht stets gewährleistet sein. Angesichts der sehr hohen Richtigkeitsquote für die B. pertussis-positive Probe # 1825322 und der technisch bzw. methodisch bei der Verwendung der IS481-Zielsequenz zu erwartenden Kreuzreaktion mit dem aktuellen B. holmesii Isolat in Probe # 1825324 hat sich der Ringversuchsleiter (in enger Abstimmung mit dem Sollwertlabor) dazu entschlossen, bei der Erteilung der Zertifikate die falsch-positiven Ergebnisse bei B. holmesii nicht als falsch zu bewerten.

Die 4 Teilnehmer mit falsch-positivem Ergebnis bei der B. parapertussis-positiven Probe # 1825323 sollten jedoch intensiv daran arbeiten, die Kontaminationssicherheit und/oder die analytische Spezifität ihrer jeweiligen Testsysteme zu verbessern.

Im Rahmen der genaueren Auswertung der mitgeteilten Ergebnisse sollte der Vollständigkeit halber noch angemerkt werden, dass der RIDAGENE Borrelia PCR Testkit (r-biopharm) neben dem qualitativen Nachweis auch eine spezifische Differenzierung von B. pertussis, B. parapertussis und B. holmesii leisten kann. Von den entsprechenden Teilnehmern wurde hier zumindest durchwegs die korrekte Speziesinformation mitgeteilt.

Inhibitionskontrollen wurden von 144 der insgesamt 146 Teilnehmer durchgeführt und Inhibitionsereignisse wurden bei dem aktuellen Probenset bei keinem der Teilnehmer innerhalb der jeweils ausgesandten vier Einzelproben beobachtet.

Wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchen verwendete ungefähr die Hälfte der Teilnehmer (n=46) selbstentwickelte (in house) Testsysteme oder auf dem Ergebnisformular nicht näher spezifizierte kommerzielle Testkits (n=52) mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von B. pertussis. In diesem Zusammenhang wurde von 44 Teilnehmern explizit die Verwendung der Insertionssequenz IS481, von 6 Teilnehmern die Verwendung die pertussis Toxin Gen und von 2 Teilnehmern die Verwendung eines ribosomalen Gens als B. pertussis-spezifische Zielsequenz angegeben.

Darüber hinaus wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: HAIN Lifescience FluoroType Bordetella (7x), HAIN Lifescience Genoquick Bordetella (1x), AmpliGnost B. pertussis/parapertussis PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (5x), Altona diagnostic RealStar Bordetella PCR Kit (4x), Seegene Allplex Respiratory Panel 4 (3x), Meridian Bioscience illumigene Pertussis (2x), Mikrogen ampliCube RB Panel 2 (2x), fast-track Diagnostics Bordetella (1x), AmpliSens Bordetella multi FRT PCR Kit (1x), Ingenetix Bacto Real B. pertussis/B. parapertussis (1x), DiaSorin Simplexa Bordetella direct Kit (1x), BioGX Bordetella PCR Kit (1x), QUIDEL Solana Bordetella Complete Assay (1x), QUIDEL AmpliVue Bordetella Assay (1x), Sacace Biotechnologies B.pertussis/B.parapertussis/B.bronchiseptica Real-TM (1x), ARGENE Bordetella r-gene (1x), Biomerieux Kit (1x), PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x) und Gerbion diarella Bordetella PCR Kit (1x).

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 7) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben in einer Art Verdünnungsreihe. Eine Probe mit einer sehr hohen Menge an Clarithromycin-sensiblen H. pylori (# 1825333; ~10⁶ CFU/mL), eine mit ca. zehnfach geringerer Menge (# 1825331; ~10⁵ CFU/mL), eine Probe mit ca. hundertfach geringerer Menge (# 1825332, ~10⁴ CFU/mL), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1825334), die nur humanes Zellmaterial und E. coli enthielt.

Die Verfügbarkeit gut evaluierter NAT-gestützter Analysesysteme und die relativ hohe Menge an Zielorganismen in zwei der drei positiven Proben (#1825333 mit ~1x10⁶ CFU/mL und # 1825331 mit ~1x10⁵ CFU/mL) führte beim Nachweis von H. pylori-DNA im aktuellen Ringversuch erfreulicherweise zu Richtigkeitsquoten von 100%. Lediglich bei der Probe mit der geringsten Menge an Zielorganismen (#1825332 mit ~1x10⁴ CFU/mL) wurde von einem der insgesamt 47 Teilnehmer ein falsch-negatives PCR/NAT Ergebnis für H. pylori-DNA berichtet.

Auch wenn diesmal keine „non-pylori“ Helicobacter-Spezies in einzelnen Proben des 4-er Sets versandt wurden, deutet die Ergebniskonstellation dennoch auf eine gute analytische Spezifität und analytische Sensitivität der eingesetzten PCR-Testsysteme hin. Sowohl die kommerziellen, als auch die eigenentwickelten Testsysteme schnitten im aktuellen Ringversuch wieder einmal erfreulich gut ab.

Neben den 30 Teilnehmern mit spezifizierten kommerziellen Testsystemen und 15 Teilnehmer mit selbstentwickelten, sog. in-house Testsystemen zum NAT-gestützten Nachweis von H. pylori DNA wurden im Kommentarfeld des Ergebnisformulars unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: 2 x LightMix Helicobacter Kit von TIB Molbiol und 1 x AmpliSens H. pylori.

Inhibitionskontrollen wurden von allen der insgesamt 47 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden dabei von keinem Teilnehmer beobachtet.

Wie in der Testbeschreibung des RV 533 vermerkt, konnten die Teilnehmer auf freiwilliger Basis auch die vermeintliche Clarithromycin-Resistenz der untersuchten H. pylori-Isolate mitteilen. Diese Spezialuntersuchung zur molekularbiologischen Resistenztestung erfolgt in der Regel über die Amplifikation und Sequenzierung von charakteristischen Bereichen, innerhalb der H. pylori 23S rDNA bzw. der Sequenzanalyse dieses Genombereichs, mittels Hybridisierungssonden. Ergebnisse wurden hier von 45 der insgesamt 47 Teilnehmer mitgeteilt, und mit Ausnahme eines einzigen Teilnehmers waren die mitgeteilten (Clarithromycin-sensiblen bzw. „Wildtyp-“) Ergebnisse der molekularen Resistenztestung auch durchweg korrekt.

Wie auch bereits bei den vorhergegangenen Runden dieses Ringversuchs mehrfach diskutiert, besteht die eigentliche Herausforderung bei dem Nukleinsäure-gestützten Nachweis von EHEC/STEC prinzipiell nicht so sehr in dem Nachweis sehr geringer Mengen an Zielorganismen, sondern vielmehr in der differenzierten Analyse und der Typisierung unterschiedlicher Shiga-Toxin-Genen und anderer putativer Pathogenitätsfaktoren (wie das für Intimin kodierende eae-Gen oder das für Enterohämolysin kodierende hlyA-Gen).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt daher zwei unterschiedliche, aber relativ stark EHEC positive Proben mit ca. 1x10⁵ CFU/mL (# 1825341: E. coli, stx₁-positiv) und mit ca. 1x10⁵ CFU/mL (# 1825342: E. coli, stx₁-, stx₂- und O157-positiv) sowie eine Probe mit 1x10⁴ CFU/ml eines ST- und LT-positiven ETEC Isolats (# 1825344). Probe # 1825343 enthielt einen E. coli Stamm (eae-, hlyA-negativ).

In diesem Ringversuch waren keine „exotischen“ Shiga-Toxin-Gene vertreten, sodass, begründet auf die Verfügbarkeit von mittlerweile bestens etablierten NAT-gestützten Testsystemen und molekularbiologischen Differenzierungsstrategien für EHEC, bei allen Proben durchwegs hohe Richtigkeitsquoten – sowohl für positive, als auch für negative Befunde – verzeichnet werden konnten. Die beiden EHEC-positiven Proben # 1825341 und # 1825342 wurden von 133 bzw. 134 der insgesamt 134 Teilnehmer als richtig-positiv berichtet. Eine naheliegende Erklärung für das eine isolierte falsch-negative Ergebnis bei der stx₁-, hly- und eae-positiven Probe # 1825341 gibt es aus Sicht der Ringversuchsauswertung nicht. Einzelne, sporadisch beobachtete falsche Ergebnisse sind aber im Rahmen dieser umfangreichen Ringversuchsserien mit hunderten von Teilnehmern nichts wirklich Aussergewöhnliches. Die Probe # 1825343 (E. coli K12 Stamm, eae-, hlyA-negativ) wurde diesmal von allen der insgesamt 134 Teilnehmer korrekterweise als negativ befundet. Probe # 1825344, welche in der aktuellen Ringversuchsrunde ca. 1x10⁴ CFU/ml eines ST- und LT-positiven ETEC Isolats enthielt, wurde erfreulicherweise ebenfalls von nahezu allen der insgesamt 134 Teilnehmer korrekt als negativ für EHEC/STEC befundet. Lediglich einer der Teilnehmer klassifizierte sein Ergebnis hier als „fraglich“.

Da in den meisten der teilnehmenden Laboratorien ein NAT-gestützter Nachweis von Shiga-Toxin-Genen im Umfeld der EHEC-Diagnostik primär als Kulturbestätigungstest eingesetzt wird, werden bei zukünftigen Ringversuchen auch die meisten der positiven Proben wieder relativ hohe Mengen an Zielorganismen enthalten, und der Schwerpunkt bleibt auf der Abprüfung der analytischen Spezifität der eingesetzten Testsysteme, und weniger auf der dabei erzielten unteren Nachweisgrenze.

Neben in-house Testsystemen werden zunehmend vorkonfektionierte kommerzielle Assays eingesetzt. In den Richtigkeitsquoten zeigte sich keine Über- bzw. Unterlegenheit eines Systems, was für die breite Etablierung PCR-/NAT-gestützter Testsysteme spricht. Inhibitionskontrollen wurden von 132 der 134 Teilnehmer durchgeführt, Inhibitionsereignisse wurden in keinem Fall beobachtet.

Zudem wurden von 115 Teilnehmern die Ergebnisse der molekulargenetischen Shiga-Toxin-Subtypisierung sowie des gezielten Nachweises von Intimin- (eae) und/oder Enterohämolysin (hlyA)-Genen mitgeteilt. Wenn auch die Typisierung nicht immer vollständig durchgeführt wurde, so waren diese Angaben zur Typisierung, zumindest in dem mitgeteilten Umfang, großteils korrekt. Lediglich ein Teilnehmer berichtete hier falsche Ergebnisse.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: BD Max Enteric Bacterial Panel (5x), Seegene Allplex Gastrointestinal Panel Bacteria II Assay (4x), TIB Molbiol LightMix modular stx-1/stx-2/eae (4x), TIB Molbiol EHEC Toxin Gene stx1 und stx2 (1x), Altona diagnostic RealStar EHEC PCR Kit (2x), Biomerieux BioFire GI Panel (2x), Amplex eazyplex EHEC complete (2x), Amplex Vanplex (1x), Sacace Biotechnologies EHEC Real-TM (1x), AmpliGnost Verotoxin 1/2 (Differenzierung) PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), fast-track Diagnostics (1x), Mikrogen ampliCube GB2 (1x) und VIASURE E.coli Real Time PCR Detection Kit (1x).

Nachdem die Probenauswahl des letzten Ringversuchs mehr auf die analytische Spezifität der eingesetzten Testsysteme abzielte, wollen wir im aktuellen Ringversuch auch wieder einmal die analytische Sensitivität abprüfen. Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt daher eine Probe mit einer relativ hohen Menge (# 1825354, ~5x10⁵ Organismen/mL), eine Probe mit etwas geringerer Menge (# 1825351, ~5x10⁴ Organismen/mL) und eine Probe mit relativ geringer Menge (# 1825353, ~5x10³ Organismen/mL) an Borrelia bavariensis. Probe # 1825352 wurde diesmal lediglich mit einer signifikanten Menge an Treponema phagedenis (~1x10⁵ Organismen/mL) versetzt.

Zu Beginn der Ergebnisdiskussion nochmal eine kurze Rekapitulation: Mittlerweile sind 21 verschiedene dem B. burgdorferi sensu lato-Komplex zugehörige, genetisch eindeutig unterscheidbare Spezies beschrieben. Unterschiede in den zur Diagnostik herangezogenen Zielgenen können ein Problem für den PCR-/NAT-gestützten Nachweis darstellen. Gesichert humanpathogen und weit in Europa verbreitet sind B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii sowie die als neue Spezies akzeptierte B. bavariensis. Ebenfalls gesichert humanpathogen ist B. spielmanii, allerdings wurde diese Spezies bislang nur selten bei Erkrankungen (insbesondere Haut) oder in Zecken nachgewiesen. Als möglicherweise humanpathogen werden die in Einzelfällen bei europäischen Patienten isolierten B. bissettiae und B. lusitaniae eingestuft, während die häufig in europäischen Zecken nachweisbare B. valaisiana nicht mehr als humanpathogen gilt. Zu betonen ist auch die erhebliche genetische Heterogenität von B. garinii die allein für das OspA zumindest fünf serologisch und genetisch differenzierbare Typen in Europa zeigt.

Nun aber zu den eigentlichen Ringversuchsergebnissen: die Detektion von Borrelia bavariensis Zielorganismen in den Proben mit relativ hoher Erregerlast (#1825354 mit ~5x10⁵ Organismen/mL bzw. # 1825351 mit ~5x10⁴ Organismen/mL) bereitete lediglich je einem der insgesamt 97 Teilnehmer gewisse Probleme, sodass für beide Proben erfreulich hohe Quoten richtig-positiver Ergebnisse erreicht werden konnten. Bei einer erneut ca. zehnfach geringeren Erregerlast von ~5x10³ Borrelia bavariensis Organismen/mL (Probe 1825353) wurde bereits von 3 der insgesamt 97 Teilnehmer ein falsch-negatives Ergebnis berichtet. Bei der „negativen“ Probe # 1825352, die diesmal lediglich eine nennenswerte Menge an Treponema phagedenis als „non-Borrelia Spirochäten“ neben humanem Zellmaterial enthielt, beobachteten nur 2 der insgesamt 97 Teilnehmer mit ihren Borrelien-spezifischen PCR/NAT Testsystemen ein positives Ergebnis. Hier könnte es sich eventuell um eine Verschleppung von Borrelien-positivem Material aus der positiven Probe „1“ während der Aufarbeitung und DNA-Isolierung handeln.

Interne oder externe Inhibitionskontrollen wurden von allen 97 Teilnehmern mitgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse der PCR-Reaktion wurden im Rahmen dieser Ringversuchsrunde von keinem Teilnehmer beobachtet.

Wie bei den vorhergehenden Ringversuchsrunden haben auch diesmal wieder ungefähr knapp die Hälfte der Teilnehmer selbstentwickelte (in-house) Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von Borrelien-DNA verwendet, kommerzielle Testsysteme wurden von 50 der 97 Teilnehmer eingesetzt.

Im Großen und Ganzen waren im Rahmen dieses Ringversuchs keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen (durchschnittliche Sensitivität ca. 98%) zu beobachten. Darüber hinaus wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: HAIN Lifescience FluoroType Borrelia (3x), BIORON RealLine Borrelien Kit (3x), Demeditec GenFlow Borrelia plus PCR (2x), Autoimmun Diagnostika Tick Screening RDB 2225 (1x), EliGene Borrelia RT von Elisabeth Pharmacon (1x), Mikrogen alphaCube Borrelia (1x), BactoReal B. burgdorferi von Ingenetix (1x), Attomol B. burgdorferi Realtime LT (1x), Attomol Borrelia PCR Kit (1x) und VIASURE Tick Borne Diseases Real Time PCR Detection Kit (1x).

Wie schon beim letzten Mal hier vorab nochmals der Hinweis: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Legionella pneumophila aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Er ist daher NICHT für die Abprüfung von immunologischen Direktnachweisverfahren wie L. pneumophila SG1 Urin-Antigen Testen o.ä. geeignet. Einzelne Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets können daher typischerweise auch relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von L. pneumophila-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 10) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal zwei positive Proben: Probe # 1825361 mit einer relativ hohen Menge an Zielorganismen (L. pneumophila SG2, ~5x10⁵ CFU/mL), und Probe # 1825364 mit einer etwa hundertfach geringeren Menge an Zielorganismen (L. pneumophila SG2, ~5x10³ CFU/mL). Probe # 1825362 und # 1825363 enthielten ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli.

Die beiden negativen Einzelproben # 1825362 und # 1825363 aus dem aktuellen Set wurden erfreulicherweise von 118 bzw. 119 der insgesamt 120 Teilnehmer korrekterweise als negativ für Legionella pneumophila-DNA befundet. Insgesamt 3 Teilnehmer berichteten hier ein falsch-positives Ergebnis. Da diese Probe lediglich E. coli-Zellen enthielt, ist eine Kreuzreaktion aufgrund mangelnder Spezifität des entsprechenden Testsystems bei dieser Konstellation sehr unwahrscheinlich. Vermutlich sind die falsch-positiven L. pneumophila Befunde hier durch laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung bedingt.

Die relativ stark positive Probe # 1825361 mit ca. 5x10⁵ CFU/mL an Legionella pneumophila SG2 wurde von allen 120 Teilnehmern korrekterweise als positiv befundet. Die etwa 100-fach geringere Menge an Legionella pneumophila-Zielorganismen in Probe # 1825364 (ca. 5x10³ CFU/mL) konnte immerhin noch von 85 Teilnehmern als positiv identifiziert werden, allerdings wurden hier bereits schon 35 falsch-negative Ergebnisse berichtet. Da wir ja bereits aus früheren Ringversuchsrunden um die unteren Grenzen der analytischen Sensitivität von durchschnittlich sensitiven PCR/NAT Testsystemen für L. pneumophila von ca. 5x10² CFU/mL an Zielorganismen wissen, haben wir diese Probe als „edukativ“ betrachtet und die Ergebnisse bei der Erteilung der Zertifikate hier nicht als „falsch-negativ“ gewertet. Allerdings sollte der aktuelle Ringversuch und insbesondere falsch-positive Ergebnisse bei den Proben # 1825362 und # 1825363 zum Anlass genommen werden, die diagnostische Sicherheit bezüglich einer Kontaminations- bzw. Amplikonverschleppungs-Problematik der verwendeten Testsysteme kritisch zu hinterfragen und gegebenenfalls zu optimieren.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs kamen bei insgesamt 81 Teilnehmern kommerzielle NAT-Testsysteme für den Nachweis von L. pneumophila DNA im Untersuchungsmaterial zum Einsatz. Im handschriftlichen Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: GeneProof L. pneumophila PCR Kit (5x), AmpliGnost L. pneumophila von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (5x), Seegene Allplex Respiratory Panel 4 (5x), Seegene Anyplex II RB5 Detection (1x), ARGENE Kits (4x), fast-track Diagnostics Kits (3x), Mikrogen Diagenode Legionella (3x), Mikrogen ampliCube Respiratory Panel 1(3x), Mikrogen FTD Atypical CAP (1x), r-Biopharm RIDAGENE CAP BAC (1x),Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (1x), Biolegio Atypical Pneumonia-1 Assay (1x), Biolegio Kit (1x), BioGX Atypical Pneumonia (1x), PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x), Vircell Speed-oligo Legionella (1x), Eurobio Respiratory multiplex Panel RV4 (1x), Ingenetix Bacto Real L. pneumophila (1x), BioMerieux real-time PCR R-gene Kit (1x) und VIASURE L. pneumophila Real Time PCR Detection (1x).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine Probe mit relativ hoher Menge an Salmonella enterica Serovar enteritidis (# 1825372 mit ~1x10⁴ CFU/mL), eine Probe mit Salmonella enterica Serovar typhi (# 1825374 mit ~1x10⁴ CFU/mL), eine Probe mit EHEC stx₁-positiv (# 1825371 mit ~1x10⁵ CFU/mL) und eine Probe ohne Zielorganismen (# 1825373), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Die Verfügbarkeit von spezifischen und mittlerweile gut evaluierten selbstentwickelten bzw. kommerziellen NAT-gestützten Analysesystemen führte erfreulicherweise bei allen 4 Proben des Ringversuchssets zu sehr hohen Richtigkeitsquoten. Insgesamt war lediglich je ein falsch-positives PCR/NAT Ergebnis bei den beiden Salmonella DNA negativen Proben # 1825371 und # 1825373 zu beobachten. Bei den beiden positiven Proben innerhalb des aktuellen Sets, # 1825372 und # 1825374, wurden im Rahmen dieses Ringversuchs zum NAT-gestützten Nachweis von Salmonellen von den insgesamt 25 Teilnehmern durchwegs korrekt positive Ergebnisse berichtet. Im direkten Vergleich zu manchen der vorhergehenden Ringversuchsrunden deutet dies auf eine verbesserte Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden diagnostischen Laboratorien hin. Hoffentlich bestätigt sich diese erfreuliche Beobachtung auch in den zukünftigen Ringversuchsrunden.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ von einem Teilnehmer die Verwendung des folgenden Kits aufgeführt: BD Max Enteric Bacterial Panel (3x), TIB Molbiol LightMix Modular (1x), fast-track Diagnostics (1x), Mikrogen ampliCube Gastroenteritis Bacteria Panel I (1x) und Seegene Allplex Gastrointestinal Panel Bacteria Assay (1x).

In enger Abstimmung mit unserem Sollwert-Laboratorium am Bayerischen Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Oberschleißheim, werden wir weiterhin versuchen, ab und an ein etwas exotischeres Serovar von Salmonella enterica zu versenden und zumindest eine der 4 Proben mit einer relativ geringen Menge an Zielorganismen zu versetzen – auch wenn im Rahmen der gesetzlichen Vorschriften und/oder Richtlinien der einzelnen Fachgesellschaften derzeit noch keine genauen unteren Nachweisgrenzen für den NAT-gestützten Salmonellen-Nachweis festgelegt wurden.

Neben der wohl prominentesten Spezies Listeria monocytogenes sind auch eine Reihe weiterer Listerienspezies bekannt, für die inzwischen auch einige selbstentwickelte und kommerzielle NAT-gestützte Nachweisverfahren zur Verfügung stehen. Auch wenn diese Spezies (mit Ausnahme von L. ivanovii) zumeist nicht von humanpathogener Relevanz sind, werden wir uns bei der Konzeption des Probenmaterials für RV 538 vor allem zur Abprüfung der Spezifität individueller Testsysteme nicht nur auf L. monocytogenes beschränken. Daher werden in zukünftigen Ringversuchsrunden auch wieder andere Listerienspezies in der einen oder anderen Probe zu finden sein.

Probe # 1825382 des aktuellen Sets enthielt eine relativ hohe Menge an L. monocytogenes (ca. 5x10⁴ CFU/mL), die erfreulicherweise von allen der insgesamt 40 Teilnehmer korrekt erfasst wurde. Probe # 1825384 enthielt mit ca. 1x10³ CFU/mL eine etwa fünfzigfach geringere Menge an Zielorganismen, die ebenfalls von nahezu allen Teilnehmern mit ihren jeweiligen spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert werden konnte. Lediglich 4 Teilnehmer berichteten hier ein falsch-negatives Ergebnis und einer der Teilnehmer klassifizierte sein Ergebnis als „fraglich bzw. grenzwertig“. Aufgrund der geringen Menge an Zielorganismen haben wir Probe # 1825384 diesmal als „edukativ“ betrachtet und die Ergebnisse bei der Erteilung der Zertifikate hier nicht als falsch-negativ bewertet.

Erfreulicherweise wurden auch die beiden negativen Proben des aktuellen Sets #1825381 und #1825383, welche ausschließlich humanes Zellmaterial und E. coli enthielten, von allen Laboratorien als „negativ“ befundet, was erneut für eine sehr gute Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden Laboratorien spricht.

Wie bereits in vorangegangenen Ringversuchsrunden wurden von den Teilnehmern ganz überwiegend Listeria monocytogenes-spezifische Testsysteme eingesetzt (n=34). Auch wenn dieser Ringversuch ja von seiner Bezeichnung her formell auf die Abprüfung von Listeria spp.-spezifischen PCR/NAT Testverfahren abzielt, besteht hier die explizite Option einer differenzierten Befundmitteilung: Hält ein Teilnehmer lediglich ein L. monocytogenes-spezifisches NAT-Verfahren vor, so kann er dies über den Zusatzcode [71] im Ergebnisfeld angeben, und für die Erstellung des individuellen Zertifikats seitens INSTAND e.V. werden dann auch nur die L. monocytogenes-spezifischen Ergebnisse zur Bewertung herangezogen.

Von allen 32 Teilnehmern wurden Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen verwendet. Vermeintliche Inhibitionsereignisse bei der Aufarbeitung und Analyse der Ringversuchsproben wurden nicht beobachtet.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: DYNEX Real Time PCR MeningoPlex (1x), Liferiver L. monocytogenes Real Time PCR Kit (1x), VIASURE S. agalactiae, L. monocytogenes, E.coli Real Time PCR Detection (1x), Biolegio Meningitis Panel-1 (1x), Progenie RealCycler Listeria spp. (1x), AmpliSens L. monocytogenes PCR Kit (1x) und QIAGEN mericon Listeria spp Kit (1x).

Zuerst einmal, wie gehabt, eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für den Direktnachweis von MRSA-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise Nasen- oder Wundabstrichen) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen an entsprechenden Zielorganismen. Für interessierte Teilnehmer soll an dieser Stelle noch einmal explizit darauf hingewiesen werden, dass sich mit Testsystemen, die üblicherweise für die Kulturbestätigung von S. aureus und/oder MRSA ausgelegt sind, diese geringen Mengen nicht immer zuverlässig nachweisen lassen werden. Eine Teilnahme an diesem Ringversuch ist daher nur für solche diagnostischen Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von MRSA etabliert haben bzw. im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie an dieser Stelle bereits mehrfach thematisiert basieren einige der derzeit etablierten eigenentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum Direktnachweis von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial auf einer getrennten Erfassung von S. aureus-spezifischen Markern, Staphylokokkenspezies-spezifischen Markern und dem mecA-Gen in der entsprechenden Nukleinsäurepräparation. Da sowohl bei S. aureus als auch bei Koagulase-negativen Staphylokokken das mecA-Gen für die phänotypische Ausprägung einer Methicillin-Resistenz verantwortlich ist, ist die Aussagekraft dieser PCR-gestützten Testsysteme für den Direktnachweis von MRSA aus nativem Patientenmaterial eingeschränkt, wenn beim Patienten eine gleichzeitige Besiedelung mit S. aureus und Koagulase-negativen Staphylokokken (die als klinische Isolate zumeist mecA-positiv sind) vorliegt. Einen attraktiven Ansatzpunkt zur Lösung dieses Problems bieten sog. SCCmec-basierte PCR-Testkonzepte, die auf dem Nachweis der SCCmec-Kassette innerhalb eines für S. aureus charakteristischen Genbereiches beruhen und die relativ gut konservierte Integrationsstelle der SCCmec-Kassette im S. aureus-Genom als Zielsequenz verwenden. Dass aber auch die SCCmec-basierten Testkonzepte gewisse Limitationen haben, konnte im Rahmen einiger früherer Ringversuche eindrucksvoll aufgezeigt werden: hier wurden bereits einige MRSA-Isolate mit selten vorkommenden SCCmec-Subtypen oder MSSA-Isolate mit einer an den jeweiligen Enden typischen SCCmec-Sequenz, aber mit einer natürlichen Deletion des üblicherweise innerhalb der SCCmec-Kassette vorhandene mecA-Gens versandt.

Da wir diesmal, abgesehen von einer Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies (eine Konstellation die in der täglichen Praxis nicht gerade selten beobachtet wird), keine „interessanten“, „schwierigen“ oder komplexen Probenkonstellationen versandt haben, wurden von den insgesamt 294 Teilnehmern mit ihren unterschiedlichsten NAT-gestützten Testsystemen nahezu durchweg korrekte PCR Ergebnisse für 3 der insgesamt 4 Proben des aktuellen Panels berichtet.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 13) der statistischen Auswertung dargestellt, enthielt die Probe # 1825391 diesmal ein Gemisch aus einem S. aureus-Isolat (MSSA, PVL-negativ, ~5x10⁴ CFU/mL) und einer Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies (S. epidermidis; mecA-positiv, ~5x10⁴ CFU/mL), die Probe # 1825394 eine nennenswerte Menge eines Methicillin-resistenten S. aureus-Patientenisolats (MRSA; PVL-positiv; ~1x10⁴ CFU/mL), die Probe # 1825392 eine deutlich höhere Menge eines weiteren Methicillin-resistenten S. aureus-Patientenisolats (MRSA; PVL-positiv; ~5x10⁵ CFU/mL), und die Probe # 1825393 ein „ganz gewöhnliches“ mecA-negatives Staphylococcus epidermidis Isolat (~1x10³ CFU/ml).

Erfreulicherweise wurden im aktuellen Ringversuch bei der relativ stark positiven MRSA Probe # 1825392 von 292 der insgesamt 294 Teilnehmer durchweg korrekt positive PCR/NAT-Ergebnisse mitgeteilt. Auch wenn sich in der zweiten MRSA-positiven Probe 1825394 eine etwa 50-fach geringere Menge an entsprechenden Zielorganismen befand, so kann die dabei beobachtete Richtigkeitsquote von 96% noch als durchaus zufriedenstellend betrachtet werden. Für diese Probe wurden von 283 Teilnehmern korrekt positive Ergebnisse mitgeteilt. Der technische oder methodische Hintergrund der 11 falsch-negativen Ergebnisse bei dieser Probe ist seitens des Ringversuchsleiters nicht näher zu ergründen. Möglicherweise wurden von diesen beiden Teilnehmern selbstentwickelte (in-house) PCR-Testsysteme mit unzureichender analytischer Sensitivität eingesetzt oder es ging während der Probenaufarbeitung ein gewisser Anteil der Template-DNA bei der DNA-Isolierung oder der Komplettierung der PCR-Ansätze verloren. Angesichts der mit 1x10⁴ CFU/mL ehrlicherweise nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollten falsch-negative Ergebnisse bei Probe # 1825394 den betroffenen Ringversuchsteilnehmern durchaus Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihrer entsprechenden NAT-gestützten Testsysteme geben.

Wenn man sich die relativen Richtigkeitsquoten der Testsysteme in der Tabelle 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 14) etwas genauer betrachtet und die zumeist streng normierten und standardisierten Abarbeitungsprotokolle von kommerziellen Testsystemen aus der täglichen Routine kennt, so bleibt es jedes Mal aufs Neue verwunderlich, dass ein nennenswerter Anteil der teilnehmenden Laboratorien mit den betroffenen Testsystemen erfolgreich die vorgegebenen Zielwerte erreicht und manche Teilnehmer leider nicht… Diese Konstellation deutet dann wohl eher auf individuelle Abweichungen vom Protokoll oder bestimmte Fehler bei der Probenabarbeitung als auf intrinsische Unzulänglichkeiten der in der Regel gut evaluierten Testsysteme hin.

Im Vergleich zu früheren Ringversuchen mit vergleichbarer Probenkonstellation wurde bei Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies in Probe # 1825391 diesmal eine erfreulicherweise hohe Richtigkeitsquote erzielt. Von 272 der insgesamt 294 Teilnehmer wurde dieses Gemisch mit den jeweils eingesetzten Testsystemen korrekt als „MRSA-negativ“ befundet, weitere 7 Teilnehmer haben ihr Ergebnis bei dieser Probe als „fraglich“ klassifiziert. Von 5 dieser 7 Teilnehmer mit fraglichem Befund wurde explizit die Verwendung eines PCR-Testsystems angegeben, das auf einer getrennten Erfassung von S. aureus-spezifischen Markern und dem mecA Gen beruht. Damit dieser Art von Testsystemen zwar die Anwesenheit des mecA Gens nachgewiesen werden kann, dessen Herkunft aber nicht zweifelsfrei dem Genom der ebenfalls nachgewiesenen S. aureus und/oder der Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies zugeordnet werden kann, ist in diesem Fall „fraglich“ auch das wissenschaftlich korrekte Untersuchungsergebnis.

Anmerkung des Ringversuchsleiters: bei der Mitteilung von fraglichen Ergebnissen werden die entsprechenden Zertifikate in der Regel nur dann erteilt, wenn diese Teilnehmer bei den übrigen 3 Proben des Ringversuchs korrekte Ergebnisse angegeben haben.

Die restlichen 15 Teilnehmer berichteten bei dieser Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies falsch-positive Ergebnisse für MRSA. Den betreffenden Teilnehmern mit falsch-positivem Ergebnis für Probe # 1825391 ist dringend anzuraten, ihre Testsysteme zu überprüfen bzw. die methodische Eignung ihres jeweiligen Testkonzepts zu hinterfragen. In der mikrobiologischen Praxis wird relativ häufig die gleichzeitige Anwesenheit einer Methicillin-resistenten (also mecA-positiven) Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies und eines Methicillin-empfindlichen (also mecA-negativen) S. aureus-Isolates in dem entsprechenden Abstrichmaterial beobachtet. In diesem Fall würden die Testsysteme der letztgenannten 15 Teilnehmer vermutlich fälschlicherweise einen Hinweis auf das Vorliegen einer MRSA-Infektion bzw. -Besiedelung anzeigen (mit allen hinlänglich bekannten Konsequenzen für den betroffenen Patienten!).

Wenn man sich die entsprechenden Richtigkeitsquoten für Probe # 1825391 in Tabelle 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 14) nach Testkonzepten differenziert betrachtet, dann wird schnell ersichtlich dass alle der derzeit etablierten SCCmec-basierten Testsysteme bei diesem Gemisch korrekterweise MRSA-negative Befunde liefern (da das S. aureus-Genom der MSSA-Komponente ja de facto keine integrierte SCCmec Kassette aufweist).

Bei der Probe ohne MRSA Zielorganismen (# 1825393), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an einem „ordinären“ mecA-negativen Staphylococcus epidermidis Patientenisolat enthielt, wurde im Rahmen des aktuellen Ringversuchs von 11 der 294 Teilnehmer ein falsch-positives MRSA Ergebnis beobachtet. Dabei liegt das Auftreten eines sporadischen laborinternen Kontaminationsereignisses oder einer Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung nahe. Solche „Ausreißer“ sind bei technisch aufwändigen Ringversuchen mit über 300 Teilnehmern nichts Ungewöhnliches und bedürfen meines Erachtens keiner weiteren Diskussion. Bei 3 dieser 11 Teilnehmer liegt diesmal übrigens eine Probenverwechslung nahe (Probe „3“ als positiv und gleichzeitig Probe „4“ als negativ für MRSA befundet). Leider können wir solche augenscheinlichen Verwechslungsereignisse bei der Erteilung der Zertifikate nicht berücksichtigen oder mitgeteilte Ergebnisse seitens der Ringversuchsleitung nachträglich wohlwollend ausbessern. Ich hoffe diese Vorgehensweise ist selbst aus Sicht der betroffenen Teilnehmer weitgehend nachvollziehbar.

Insgesamt bleibt festzuhalten, dass der erfreulich große Anteil von richtig-positiven Ergebnissen, bei der einen positiven Probe und die überwiegend richtig-negativen Befunde bei den 2 MRSA-negativen Proben, erneut für ein hervorragendes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminations- und Verschleppungsereignissen spricht.

Abgesehen von der zuletzt diskutierten Probe spricht die Ergebnislage dieses Ringversuchs erneut für eine hohe Zuverlässigkeit des NAT-gestützten Direktnachweises von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial. Für Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen interessiert sind, stehen mit den Proben dieses Ringversuchs wieder standardisierte Rückstellproben zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Optional wird im Rahmen unserer Ringversuchsreihe auch der molekulargenetische Nachweis des putativen Pathogenitätsfaktors PVL (Panton-Valentine-Leukozidin) bzw. dessen kodierende Gene lukF/S-PV abgefragt. Entsprechende Ergebnisse wurden von 55 der insgesamt 294 teilnehmenden Laboratorien mitgeteilt und mit Ausnahme eines Teilnehmers waren diesmal die negativen Ergebnisse aller Proben für die molekularbiologische PVL-Testung durchweg korrekt. Nähere Informationen zu der, nach wie vor hochaktuellen, cMRSA bzw. CA-MRSA Problematik finden sich beispielsweise bei Linde et al. [4] oder Witte et al. [5]. Ein gut evaluiertes real-time PCR Protokoll für den gezielten Nachweis von PVL-positiven S. aureus-Isolaten findet sich beispielsweise in Reischl et al. [6].

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Amplex eazyplex MRSA (3x), HAIN Lifescience Genotype Staphylococcus (2x), VELA diagnostics Sentosa SA Direct MRSA Test (1x), Autoimmun Diagnostika Gen ID MRSA combi (1x), Immundiagnostik MutaPLEX MRSA (1x) und Diarella MRSA real time PCR Kit TM von Gerbion (1x).

Eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Chlamydia pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von C. pneumoniae DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 15) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal eine Probe mit einer relativ hohen Menge an entsprechenden Zielorganismen (# 1825401; Chlamydia pneumoniae, ~5x10⁵ IFU/mL) und eine Probe mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1825403; Chlamydia pneumoniae, ~5x10⁴ IFU/mL), eine Probe mit ca. ~5x10⁴ Genomkopien/mL an Mycoplasma pneumoniae (# 1825402), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1825404), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Wie bereits in den vorhergegangenen Ringversuchen zu beobachten war, so wird bei der Auswertung der Ergebnisse auch diesmal die hervorragende analytische Sensitivität und Spezifität der gegenwärtig eingesetzten und z.T. auch bereits sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesysteme für den Nachweis von C. pneumoniae-DNA eindrucksvoll aufgezeigt. Aus den in der Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 15) aufgeführten Daten ist zu entnehmen, dass im aktuellen Ringversuch alle bis auf 3 Teilnehmer die Zielorganismen in der etwas schwächer positiven Probe # 1825403 (ca. 5x10⁴ IFU/mL) noch sicher und zuverlässig nachweisen konnten. Mit ca. 5x10⁵ IFU/mL Probenmaterial enthielt die Probe # 1825401 diesmal eine relativ hohe Menge an C. pneumoniae-Zielorganismen. Erfreulicherweise wurde letztere Probe ebenfalls von 119 der insgesamt 120 Teilnehmer als (richtig-) positiv befundet.

Angesichts der mit 5x10⁵ bzw. 5x10⁴ IFU/mL ehrlicherweise nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollten falsch-negative Ergebnisse bei beiden Proben # 1825401 und # 1825403 den betroffenen Ringversuchsteilnehmern jedoch Anlass zur Überprüfung und Optimierung seines entsprechenden NAT-gestützten Testsystems geben.

Erfreulicherweise wurden für die beiden Proben ohne Zielorganismen # 1825402 (Mycoplasma pneumoniae) von allen 120 Teilnehmern und # 1825404 (humanes Zellmaterial und nennenswerte Menge an E. coli) ebenfalls von 116 der insgesamt 120 Teilnehmer richtig negative Ergebnisse berichtet. Dies unterstreicht wieder einmal aufs Neue die hohe analytische Spezifität der eingesetzten PCR/NAT-Testsysteme zum Nachweis von C. pneumoniae-DNA. Bei den drei isoliert falsch-positiven Ergebnissen könnte es sich eventuell um sporadische laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung gehandelt haben. Kreuzreaktivitäten der C. pneumoniae-spezifischen PCR-Testsysteme mit DNA von Mykoplasmen oder E. coli erscheinen eher als unwahrscheinlich.

Die Teilnehmer haben alle entweder kommerzielle oder selbstentwickelte (in-house) Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von C. pneumoniae DNA verwendet; eine signifikante Inhibition der PCR-Reaktion bei den vier versandten Proben innerhalb des aktuellen Ringversuchs wurde dabei von keinem der Teilnehmer beobachtet. Aufgrund des leider noch relativ geringen Anteils und der nicht durchgehenden Spezifizierung von kommerziellen Testsystemen innerhalb des Teilnehmerfeldes lassen sich derzeit keine seriösen Vergleiche zwischen bestimmten kommerziellen Kits und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität oder Kontaminationsanfälligkeit führen.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs wurde von 15 Teilnehmern die Verwendung des TIB Molbiol LightMix C. pneumoniae Testsystems, von 7 Teilnehmern der Diagenode MP/CP Kit, von 6 Teilnehmern der kommerzielle AmpliGnost CP PCR Kit und von 5 Teilnehmern der AID CAP Bacteria Kit angegeben. Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: GeneProof C. pneumoniae PCR Kit (6x), Seegene Allplex Respiratory Panel 4 (6x), ARGENE Chla/Myco pneumo r-gene (5x), Mikrogen ampliCube Resp. Bact. Panel 1 (3x), AmpliSens M. pneumoniae/C. pneumoniae (3x), fast-track Diagnostics Atypical CAP Kit (2x), fast-track Bacterial pneumonia CAP (1x), fast-track Diagnostics Kit (1x), r-Biopharm RIDAGENE CAP BAC (2x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (2x), BioGX Atypical Pneumonia (1x), Luminex NxTAG Respiratory Pathogen Panel (1x) und PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x).

Aufgrund zahlreicher Rückfragen von Teilnehmern der vergangenen Ringversuche hier eine wichtige Anmerkung vorab: der Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Mycoplasma pneumoniae ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Mycoplasma pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischen Untersuchungsgut, wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial, konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Dieses Mal waren jedoch keine Proben mit geringen Mengen an Zielorganismen im ausgesandten Probenset vertreten.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 16) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal nur eine positive Probe (# 1825412) mit einer hohen Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x10⁵ Genomkopien/mL). Um im Rahmen der Möglichkeiten dieses Ringversuchskonzepts auch die Spezifität der eingesetzten Testsysteme abzuprüfen, enthielt Probe # 1825413 (Mycoplasma hominis; ~1x10⁵ Genomkopien/mL) diesmal nennenswerte Mengen an einer zu dem Zielorganismus verwandten Mykoplasmen-Spezies. Proben # 1825411 und # 1825414 enthielten ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli.

Mit drei Ausnahmen konnten die 138 Teilnehmer die DNA der M. pneumoniae-Zielorganismen in der relativ stark positiven Probe # 1825412 nachweisen, zusätzlich wurde ein fragliches Ergebnis berichtet. Für die beiden‚ negativen‘, E. coli-haltigen Proben (# 1825411 und # 1825414) wurden 1 bzw. 2 falsch-positive Ergebnisse eingereicht, bei der dritten M. hominis-haltigen Probe (# 1825413) waren es sogar 4. Bei den falsch-positiven Ergebnissen könnte es sich eventuell um sporadische laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung handeln. Eventuelle Kreuzreaktivitäten der M. pneumoniae-spezifischen PCR-Testsysteme mit DNA von anderen Mykoplasmen-Spezies sollten von den betroffenen Teilnehmern abgeprüft und die entsprechenden Testkonzepte ggf. nachgebessert werden. Insgesamt jedoch zeigte die Ergebniskonstellation in einem breiten Teilnehmerfeld mit unterschiedlichsten Testsystemen und PCR-Protokollen eine relativ hohe analytische Spezifität der eingesetzten PCR/NAT-Testsysteme zum Nachweis von M. pneumoniae-DNA. Inhibitionskontrollen wurden von 137 der 138 Teilnehmer mitgeführt, für keine der ausgesandten Proben wurden Inhibitionsereignisse berichtet. Selbstentwickelte PCR-/NAT-Testsysteme kamen bei 38 Teilnehmern zum Einsatz, während in den anderen Laboratorien kommerzielle Testsysteme verwendet wurden. Die Richtigkeitsquoten lagen bei in-house und vorkonfektionierten Assays auf vergleichbarem Niveau.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs wurde von 99 Teilnehmern die Verwendung von kommerziellen Testkits (siehe Tabelle 3 Anhang 1 [Anh. 1], S. 17) oder „andere kommerzielle Testsysteme“ angegeben. Teilnehmer mit 5 von 6 der namentlich aufgeführten kommerziellen Testkits konnten damit durchwegs Richtigkeitsquoten von 100%, sowohl für die positiven als auch für die negativen Proben erzielen. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: fast-track Diagnostics Kits (9x), ARGENE Ch/Myc. pneumoniae r-gene Kit (6x), ARGENE Ch/Myc. pneumoniae (1x), Seegene Allplex Respiratory Panel 4 (4x), AmpliSens M. pneumoniae/C. pneumoniae-FRP PCR Kit (3x), Mikrogen ampliCube Respiratory Bacterial Panel 1 (3x), Mikrogen FTD Atypical CAP (1x), Biolegio mit BD Max (3x), BioGX Atypical Pneumonia (1x), r-Biopharm RIDAGENE CAP BAC (1x), Sartorius Microsart ATMP Mycoplasma (1x), PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x), Meridian Bioscience illumigene Mycoplasma (1x), Eurobio Respiratory Panel Allplex RV4 (1x) und Ingenetix Bacto Real Mycoplasma pneumoniae (1x).

Auch hier wieder eine Anmerkung vorweg: Der kombinierte Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Coxiella burnetii&Bacillus anthracis ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Coxiella burnetii- und Bacillus anthracis-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben (Tabelle 1, Anhang 1 [Anh. 1], S. 17) enthielt zwei Proben mit verschiedenen Mengen an C. burnetii (~1x10⁵ Genomkopien/mL in Probe # 1825423 und ~1x10³ Genomkopien/mL in Probe # 1825421), zwei Proben mit verschiedenen Mengen an Bacillus anthracis UR-1 Isolat DNA (~1x10⁵ Genomkopien/mL in Probe # 1825422 und ~1x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 1825421), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1825424), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Der Übersichtlichkeit halber haben wir uns bei diesem kombinierten Ringversuch entschlossen, die Ergebnislage für die beiden unterschiedlichen Erreger auch in zwei getrennten Tabellen darzustellen: für C. burnetii in den Tabellen 2 und 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 17) sowie für B. anthracis in Tabellen 4 und 5 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 18).

Coxiella burnetii: Wie bereits im vorausgegangenen Ringversuch gestaltet sich auch in der aktuellen Runde die Ergebnislage zufriedenstellend. Die etwas stärker positive Probe # 1825423 (mit ca. 1x10⁵ Genomkopien C. burnetii/mL) wurde von 33 der insgesamt 36 Teilnehmern mit ihren jeweiligen C. burnetii-spezifischen PCR-Testsystemen detektiert. Die zweite positive Probe # 1825421 des Probesets (ca. 1x10³ Genomkopien/mL von C. burnetii) wurde ebenfalls von 33 Laboren korrekt berichtet, auch hier sind drei falsch-negative Ergebnisse zu registrieren. Dies sollte in den betroffenen Laboren zum Anlass genommen werden, die Performance des verwendeten Testsystems zu hinterfragen und die Prozesse der Probenaufarbeitung ggfs. zu optimieren.

Die beiden Proben ohne Zielorganismus (# 1825422 und # 1825424) wurden von jeweils 3 bzw. 2 Teilnehmern fälschlicherweise als ‚positiv‘ klassifiziert, im Vergleich zu vorausgehenden Ringversuchsrunden bedeutet das einen Anstieg der falsch-positiven Ergebnisse. Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von C. burnetii DNA der Teilnehmer enthielten durchwegs eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Relevante Inhibitionsereignisse wurden nicht beobachtet.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Sacace Biotechnologies C. burnetii Real-TM (1x), Progenie RealCycler Coxiella burnetii (1x), Mikrogen alphaCube Q-Fiebers (1x) und ThermoFisher VetMAXCox (1x).

Bacillus anthracis: Die Ergebnislage des Ringversuchs „Bacillus anthracis DNA“ ist ebenfalls relativ schnell dargestellt. Alle 19 Teilnehmer konnten die stärker positive Probe # 1825422 richtig klassifizieren. Die etwas schwächer positive Probe # 1825421 wurde ebenfalls von allen Laboren richtig bewertet. Im Gegensatz zu vorausgehenden Ringversuchsrunden wurden erfreulicherweise in der aktuellen Aussendung keine falsch-positiven Ergebnisse für die ‚negativen‘ Proben (# 1825423 und # 1825424) berichtet. Im Hinblick auf die Konsequenzen solcher Ergebnisse für die Therapie und das Management von Patienten (und die Auswirkungen auf das Umfeld!), ist dies sicherlich lobenswert.

Wie immer stehen nach erfolgreichem Abschluss der aktuellen Ringversuchsrunde den Kolleginnen und Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen für C. burnetii DNA und B. anthracis DNA interessiert sind, mit den Proben dieses Ringversuchs auch gewissermaßen „standardisierte Rückstellproben“ zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Altona diagnostics RealStar Anthrax PCR Kit (3x) und Mikrogen alphaCube Q-Fiebers (1x).

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Francisella tularensis & Brucella spp.“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Francisella tularensis-DNA und Brucella spp. DNA aus geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 19) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal zwei positive Proben für F. tularensis: Probe # 1825431 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (F. tularensis spp. tularensis, ~5x10⁴ CFU/mL) und Probe # 1825432 mit ca. ~1x10⁴ CFU/mL an F. tularensis spp. novicida; zwei Proben mit verschiedenen Mengen an Brucella melitensis DNA (~1x10⁵ CFU/mL in Probe # 1825434 und ~1x10⁴ CFU/mL in Probe # 1825432), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1825433), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Francisella tularensis: Ähnlich wie bei vorausgehenden Ringversuchen haben auch hier alle der 21 Teilnehmer die relativ stark positive Probe # 1825431 (F. tularensis spp. tularensis, ~5x10⁴ CFU/mL) korrekt bewertet. Für die Probe mit fünffach niedrigerer Erregermenge # 1825432 (F. tularensis spp. novicida, ~1x10⁴ CFU/mL) erreichten uns neben 16 richtig ‚positiven‘ Ergebnissen auch 4 falsch-negative sowie eine fragliche Klassifizierung. Die betroffenen Teilnehmer sollten dies zum Anlass nehmen, die Sensitivität der verwendeten Testsysteme sowie ggfs. die Prozesse der Probenaufarbeitung zu evaluieren. Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von F. tularensis-DNA der Teilnehmer enthielten alle eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Brucella spp: 16 bzw. 19 der 19 teilnehmenden Labore berichteten für die ‘positiven’ Proben # 1825432 und # 1825434 korrekte Ergebnisse. Leider traten für die beiden Proben ohne Zielorganismen (#1825431 und # 1825433) insgesamt zwei falsch- positive Nachweise auf. Falsch-negative, -positive oder fragliche Ergebnisse sollten zum Anlass genommen werden, die Performance des verwendeten Testsystems und die laborinternen Prozesse der Probenaufarbeitung zu überprüfen. Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Applied Biosystems Brucella spp Kit (1x).

Da in der aktuellen Ringversuchsrunde die falsch negativen Ergebnisse bei der Probe mit der geringer Erregerkonzentration sowohl für F. tularensis als auch für Brucella sp. von den gleichen Laboren gemeldet wurden, sollte bei diesen wohl gezielt die Aufarbeitung der DNA aus dem Probenmaterial einer kritischen Überprüfung und ggf. Verbesserung unterzogen werden.

Der seit 2015 in das reguläre Ringversuchsprogramm von INSTAND e.V. aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Carbapenemase-Gene“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zur molekularen Resistenztestung bzw. dem Direktnachweis von charakteristischen Carbapenemase-Genen aus DNA-Präparationen von Reinkulturen an Enterobacteriaceae konzipiert. Zum orientierenden Herantasten an die technische Eignung und die „Praktikabilität“ der versandten Probenmaterialien werden wir uns in den ersten Runden dieses methodisch anspruchsvollen Ringversuchs zur molekularen Resistenztestung auf die Abprüfung eines kleinen Spektrum der derzeit häufigsten Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae beschränken: KPC, VIM, OXA-48 ähnliche Gene, GES-Carbapenemasen, NDM, IMP und GIM. Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 21) der Auswertung dargestellt, enthielt das aktuelle Set drei Proben mit Carbapenem-resistenten Enterobacteriaceae: Probe # 1825441 enthielt Escherichia coli Zielorganismen mit dem OXA-244 Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL), Probe # 1825442 enthielt Klebsiella pneumoniae Zielorganismen mit den Genen für NDM-1 und OXA-48 (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL) und Probe # 1825444 enthielt Citrobacter freundii-complex Zielorganismen mit dem GES-5 Gen (ca. 1x107 Genomkopien/mL). Die dritte Probe # 1825443 war als eine Art von Negativkontrolle ausgelegt – sie enthielt lediglich E. coli ohne Carbapenemase-Gene.

86 der 88 Teilnehmer stellten erfreulicherweise ein Carbapenemase-Gen in der Probe # 1825441 fest. Für die Probe mit NDM-1 und OXA-48 positiver Klebsiella pneumoniae (# 1825442) wurden mit drei Ausnahmen korrekte Ergebnisse berichtet. Hoch lag die Richtigkeitsquote auch für die Probe # 1815443, hier berichteten 86 Teilnehmer die Probe als korrekt als „Carbapenemase-negativ“. Schwächen zeigten sich bei der Detektion der GES-5-positiven Citrobacter freundii in Probe # 1825444, die 76 Teilnehmern ‚durchrutschte‘. Grund hierfür ist möglicherweise, dass das GES-5 Gen gerade in vielen ‚Multiplex‘ Testformaten nicht enthalten ist.

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Direktnachweis von Carbapenemase-Genen Teilnehmer enthielten durchwegs eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Seegene Allplex Entero-DR Assay (3x), Amplex eazyplex SuperBug complete A (1x) und Autoimmun Diagnostika RDB 2290 Carbapenemase (1x).

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Clostridium difficile“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Clostridium difficile-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 23) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben zwei positive Proben: Probe # 1825451 mit einen hoher Menge an Clostridium difficile (~1x10⁵ CFU/mL), Probe # 1825454 mit ca. zehnfach geringerer Menge (~1x10⁴ CFU/mL) sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 1825452 und # 1825453), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Die beiden „positiven“ Clostridium difficile Proben # 1825451 und # 1825454 wurden erfreulicherweise mit lediglich einer Ausnahme von den teilnehmenden Laboratorien korrekt als „positiv“ klassifiziert. Die vereinzelt berichteten ‚fraglichen‘ oder ‚positiven‘ Ergebnisse für die Proben ohne Zielorganismen (# 1825452 und # 1825453) sollten zum Anlass genommen werden, das verwendete Testsystem bzgl. analytischer Sensitivität und Spezifität zu evaluieren und auch die laborinternen Prozesse der Probenaufbereitung und -abarbeitung kritisch zu hinterfragen.

Wie in Tabelle 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 23) angegeben, verwendete der Großteil der Teilnehmer kommerzielle Testsysteme. Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Meridian Bioscience illumigene C. difficile (6x), r-Biopharm RIDAGENE CD Toxin A/B (6x), r-Biopharm RIDAGENE Hospital Stool Panel (3x), Altona diagnostic RealStar C. difficile PCR Kit (5x), TIB Molbiol Modular Dx Kit (3x), AmpliGnost C. difficile Toxin A und B von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (2x), HAIN Lifescience GenoType CDiff (3x), HAIN Lifescience FluoroType CDiff (2x), Seegene Allplex GI Panel 2 (1x), fast-track Diagnostics C. difficile (1x), Amplex eazyplex C. difficile complete Assay (1x), Abacus Diagnostica GenomEra C. difficile (1x), QUIDEL AmpliVue C. difficile Assay (1x) und QUIDEL Solana C. difficile Assay (1x).

Aktuelle Anmerkung des Ringversuchsleiters: Anfang kommenden Jahres planen die Kolleginnen und Kollegen des dreigeteilten NRZ C. difficile (UK Münster, UK Homburg und KH Coesfeld) eine kleine Umfrage zu der aktuell routinemäßig verwendeten diagnostischen Methodik. Um ihn bei diesem Vorhaben bestmöglich zu unterstützen, würden wir ihnen gerne zu gegebener Zeit den Link zu seinem Fragebogen zukommen lassen. Bitte geben Sie Herrn Prof. Dr. Alexander Mellmann (Alexander.Mellmann@ukmuenster.de) doch kurz Bescheid falls sie an dieser Umfrage interessiert sind. In diesem Zusammenhang bereits im voraus herzlichen Dank für ihre Unterstützung. Nach Abschluß dieser interessanten Erhebung läßt sich die Auswertung dann sicherlich in einer der kommenden C. difficile Ringversuchsauswertungen in Kurzform präsentieren.

Der neu ins Ringversuchsprogramm aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Vancomycin-resistente Enterokokken“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an DNA Vancomycin-resistenter Enterokokken aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tabelle 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 24) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben zwei positive Proben: Probe # 1825461 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (Enterococcus faecalis van A resistent, ~1x10⁵ CFU/mL), Probe # 1825463 mit ca. gleiche Menge (Enterococcus faecium van B resistent, ~1x10⁵ CFU/mL) und Probe # 1825464 mit ca. ~1x10⁴ CFU/mL an Enterococcus faecalis. Im Ringversuchsprobenset befand sich zudem eine Probe ohne Zielorganismen (# 1825462), die nur humane Zellen und E. coli enthielt.

Erfreulicherweise wurden die beiden positiven Proben # 1825461 und # 1825463 (je ca. ~1x10⁵ CFU/mL) mit vanA bzw. vanB tragenden Enterokokken mit lediglich einer Ausnahme von allen Teilnehmern als „VRE-positiv“ klassifiziert. Besonders erfreulich ist, dass (ebenfalls mit nur einer Ausnahme) alle eingereichten Ergebnisse der vanA/vanB Differenzierungen korrekt waren. Auch unter den von den insgesamt 55 Teilnehmern mitgeteilten Ergebnissen für die beiden VRE negativen Proben # 1825462 (E. coli) und # 1825464 (E. faecalis) befand sich nur ein einziger falsch-positiver Befund.

Bei solchen Ergebniskonstellationen würde man bei den falsch-postiven Befunden eigentlich sporadische Kontaminationsereignisse oder (Kreuz-)Kontaminationen vermuten. Da im aktuellen Fall aber beide falschen Ergebnisse von dem selben Teilmehmer stammen, liegt eine Probenverwechslung nahe (Probe „2“ als positiv und gleichzeitig Probe „3“ als negativ für VRE befundet). Leider können wir solche augenscheinlichen Verwechslungsereignisse bei der Erteilung der Zertifikate nicht berücksichtigen oder mitgeteilte Ergebnisse seitens der Ringversuchsleitung nachträglich wohlwollend ausbessern.

Gerade der Nachweis von VRE verkompliziert das Management und ggfs. eine erforderliche antibiotische Therapie erheblich, sodass „Laborenten“ unbedingt vermieden werden müssen. Bei den eingesetzten Testsystemen hielten sich kommerziell erhältliche, vorkonfektionierte Systeme und Eigenentwicklungen in etwa die Waage. Bezüglich analytischer Sensitivität und Spezifität waren keine signifikanten Unterschiede zu verzeichnen, wenngleich einschränkend angemerkt werden muss, dass für eine verläßlichere Beurteilung weitere Ringversuchsrunden abgewartet werden sollten. Insgesamt war die Ergebnislage dieser ersten Probenaussendung jedoch sehr erfreulich.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: BioGX auf BD Max (1x), Amplex eazyplex VRE (1x), AusDiagnostics Kit (1x), AmpliGnost Vancomycin A/B Resistenz differenz. von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x) und Seegene Allplex Entero-DR Assay (1x).

Nach intensiven Vorarbeiten zum Proben-Design und zur praktischen Umsetzung wird der aktuell als sogenannter „Pilot“ organisierte Ringversuch RV 547 „Urogenital-Panel“ in der aktuellen Ringversuchsrunde zum zweiten Mal durchgeführt und die Ergebniskonstellation hier diskutiert. Nicht zuletzt durch das überaus heterogene Spektrum an eingesetzten Multiparameter- bzw. Multiplex-Testsystemen wird die strukturierte Auswertung der auf den Report-Formularen mitgeteilten Ergebnisse erschwert. Daher haben wir die Tabelle 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 25) etwas modifiziert. Dort ist der Übersicht halber nun die Anzahl an positiven und negativen Ergebnissen für die in den jeweiligen Proben anwesende Pathogene aufgeführt. Mit dieser Lösung sollte man eine einigermaßen informative Darstellung über das erfasste Erregerspektrum und über die Leistungsdaten einzelner Testsysteme erhalten. Im Großen und Ganzen haben die 19 aktuell registrierten Teilnehmer die Erreger in den 34 Einzelproben entsprechend den methodischen Möglichkeiten ihrer Testsysteme zufriedenstellend nachweisen können. Dies bestätigt zum einen für die Praktikabilität unseres innovativen Multiplex-Ringversuchskonzepts und zum anderen für die zuverlässige Erfassung der Zielorganismen innerhalb der jeweils testspezifisch abgedeckten Erregerspektren der eingesetzten kommerziellen oder eigenentwickelten PCR/NAT Verfahren.

Mit der aktuellen Aussendung des RV 547 haben wir erstmals ein einfaches Schema in Form einer 7-stelligen Zahlenkombination eingeführt, über das die einzelnen Teilnehmer das erfasste Erregerspektrum ihrer individuellen Testsysteme und Multiplex-Assays auf dem Report-Formular vorab mitteilen können. Für die Erteilung von Zertifikaten macht es nachvollziehbarerweise nur Sinn diejenigen Parameter aus dem gesamten Panel zu bewerten und zu testieren, die von den Teilnehmern im Rahmen ihrer diagnostischen Möglichkeiten und der individuellen PCR/NAT Workflows prinzipiell auch als positiv bzw. negativ erfasst werden können. Nachdem uns beim aktuellen Ringversuch (erfreulicherweise) von nahezu allen Teilnehmern deren entsprechender 7-stellige Binärcode auf dem Report Formular mitgeteilt wurde, können nun die Zertifikate individualisiert ausgestellt werden. Ich hoffe diese etwas kompliziertere aber dafür „gerechte“ Vorgehensweise trifft auch bei zukünftigen Ringversuchsrunden auf breite Akzeptanz.

Der Ringversuchsleiter ist natürlich stets für weitere konstruktive Kommentare und Vorschläge aus dem Teilnehmerkreis dankbar. Trotz des relativ vielfältigen Spektrums an unterschiedlichen Testsystemen und -konzepten werden wir uns nach Kräften bemühen, die unterschiedlichen Multiparameter- bzw. Multiplex-Testsysteme der Teilnehmer auch bei den zukünftigen Ringversuchsrunden (also nach der hiermit abgeschlossenen Pilotphase) mit interessanten Probenkonstellationen versorgen zu können.

Unter Code [20] „Multiplex Kit“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: fast-track Diagnostics FTD Urethritis plus (5x), fast-track Diagnostics STD9 (1x), Seegene Allplex STI Essential Assay (3x), Seegene Allplex STI/BV Panel Assays (2x), Seegene Allplex Genital ulcer Assay (1x), Seegene Anyplex STI-7 Detection (1x), Seegene Anyplex II STI-5 Detection (1x), Autoimmun Diagnostika STI (1x) und BioGX Mycoplasma/Ureaplasma (1x).

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: r-Biopharm RIDAGENE STI Mycoplasma panel (5x), r-Biopharm RIDAGENE T. vaginalis RT PCR Kit (2x), TIB Molbiol Kits (2x), Amplex eazyplex STD complete (1x), BIORON RealLine single und multiplex Kits (1x), AmpliGnost Kits von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x) und Sacace Biotechnologies Kits (1x).

Dieser im Jahr 2013 in unser Ringversuchsprogramm aufgenommene Ringversuch RV 560 „Pilzgenomnachweis PCR/NAT Pneumocystis jirovecii“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis von Pneumocystis jirovecii-DNA in geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Zum orientierenden Herantasten an die unteren Nachweisgrenzen der im Anwenderkreis etablierten PCR/NAT-gestützten Testsysteme enthielt das aktuelle Set zwei positive Proben (siehe Tabelle 1, Anhang 1 [Anh. 1], S. 26): eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1825602; Pneumocystis jirovecii, ca. 1x10⁵ Organismen/mL), eine Probe mit einer geringerer Menge (# 1825604; Pneumocystis jirovecii, ca. 1x10⁴ Organismen/mL), sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 1825601 und # 1825603) aber mit E. coli und einer Suspension aus humanen Zellen.

Die beiden negativen Proben # 1825601 und # 1825603 wurden erfreulicherweise mit einer Ausnahme von allen Teilnehmern korrekt klassifiziert. Im Vergleich zu den vorausgegangenen Ringversuchsrunden hat sich die Rate an falsch-positiven Ergebnissen somit reduziert. Bei den positiven Proben wurde Probe # 1825602 mit ~1x10⁵ Organismen/mL diesmal von allen der insgesamt 104 Teilnehmer richtig klassifiziert. Etwas schlechter war die Ergebnislage für die ca. zehnfach schwächere positive Probe # 1825604 (ca. 1x10⁴ Organismen/mL). Immerhin 99 teilnehmende Laboratorien berichteten hier ein korrektes, positives Ergebnis, daneben wurden 4 falsch-negative Resultate auf den Ergebnisbögen protokolliert. Angesichts der mit mehr als 10⁴ Organismen/mL nicht gerade als "äußerst gering" zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollten diese falsch-negative Ergebnis den betroffenen Ringversuchsteilnehmern Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihrer entsprechenden NAT-gestützten Testsysteme geben. Inhibitionskontrollen wurden von allen 104 Teilnehmern mitgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse waren diesmal nicht zu beobachten.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [26] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Altona diagnostics RealStar P. jirovecii PCR Kit (7x), Fast-track Diagnostics P. jirovecii PCR Kit (6x), Biolegio Atypical Pneumonia-1 Assay (2x) und BioGX P. jirovecci (1x).