gms | German Medical Science

Nach erfolgreicher Etablierung dieser neuen Ringversuchs-Serie wollen wir hier auch für Kolleginnen und Kollegen, die bisher noch nicht an diesen Ringversuchen teilgenommen haben, die Ergebnisse der aktuellen Ringversuche für den PCR/NAT-gestützten Nachweis von Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, EHEC/STEC, Borrelia burgdorferi sensu lato, Legionella pneumophila, Salmonella enterica und Listeria spp., MRSA bzw. cMRSA, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetti, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Brucella spp., Pneumocystis jirovecii (vorm. P. carinii) und der molekularen Resistenztestung für Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae sowie die beiden vor kurzem neu ins Programm aufgenommenen Ringversuche zum PCR/NAT-gestützten Nachweis von Clostridium difficile (Toxingene) und VRE (Vancomycin-resistente Enterokokken) darstellen und kurz diskutieren.

Für nähere Informationen über die Zusammensetzung der Ringversuchsproben, dem Sinn und Zweck dieser neuen Möglichkeit zur externen Qualitätskontrolle im Umfeld der Nukleinsäurediagnostik sowie zu den Eckdaten unseres flexiblen Ringversuchskonzepts sei hier auf unsere initiale Veröffentlichung in der Zeitschrift „Der Mikrobiologe“ verwiesen [1]. Gerne werden wir hier auch weiterhin in regelmäßigen Abständen und in ähnlicher Form über die Ergebnislage, Auswertung und Analyse unser zukünftigen Ringversuche berichten.

Wie bei allen anderen Ringversuchen erfolgt die Anmeldung zu ausgewählten Teilen der Reihe „Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis (PCR/NAT)“ über die Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in Medizinischen Laboratorien (INSTAND e.V.), Düsseldorf (http://www.instand-ev.de). Nach Abschluß des jeweiligen Ringversuchs werden die Ergebnisse der einzelnen Teilnehmer dort zentral erfasst und anhand von individuellen Bewertungskriterien werden die schriftlichen Zertifikate erstellt. Zusätzlich stehen für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe weiterer Informationen auch im Internet unter „http://www.udo-reischl.de“, Unterpunkt „INSTAND-Ringversuche (PCR/NAT)“, sowie auf der Homepage von INSTAND e.V. als pdf-Files zum freien Download bereit.

Neben der Aussendung von lyophilisierten Probenmaterialien zur systematischen Abprüfung von NAT-gestützten Testsystemen für derzeit 19 unterschiedliche bakterielle und fungale Zielorganismen bzw. Pathogenitätsfaktoren gab es im Rahmen dieser Ringversuchsrunde auch wieder gewisse „Highlights“. So wurden beispielsweise im aktuellen RV 530 Chlamydia trachomatis & Neisseria gonorrhoeae drei Proben mit Mischungen von unterschiedlichen Mengen an C. trachomatis und Mengen an N. gonorrhoae Zielorganismen versandt. Interessanterweise ließ sich auch bei diesen Konstellationen die DNA von C. trachomatis im Gemisch mit N. gonorrhoeae DNA mit den meisten der kommerziellen und in-house PCR-Testsysteme zuverlässig nachweisen.

In einer der 4 Einzelproben des aktuellen Ringversuchs RV 535: Borrelia burgdorferi befanden sich relativ hohe Mengen der Spezies Borrelia bisettiae. Offenbar bereitete der zuverlässige PCR-gestützte Nachweis dieser dem B. burgdorferi sensu lato-Komplex zugehörigen Spezies nur einem sehr geringen Teil der Teilnehmer (bzw. den von ihnen eingesetzten Testsystemen) gewisse Probleme. Etwas Hintergrundinformation zu dieser Borrelien-Spezies finden Sie in dem ringversuchsspezifischen Teil dieser Diskussion.

Mit der Auswahl eines etwas breiteren Spektrums von relevanten Carbapenemase-Genen bestätigte sich im Rahmen des Ringversuchs RV 544 Carbapenemase-Gene erneut die Vermutung, dass viele der derzeit verwendeten kommerziellen sowie in-house Testsysteme zur molekularen Carbapenemase Detektion noch gewisse Lücken hinsichtlich der Abdeckung von unterschiedlichen Carbapenemase-Genen aufweisen. Im aktuellen Ringversuch scheint dies insbesondere für Isolate mit IMP-1 zu gelten. Das Klebsiella pneumoniae Isolat mit IMP-1 wurde lediglich von 71 der insgesamt 88 Teilnehmer detektiert. Im Umfeld der molekularen Testung von Carbapenemase-Genen unterstützt uns ja Frau Dr. Agnes Anders vom Nationalen Referenzzentrum für gramnegative Krankenhauserreger in Bochum weiterhin bei der Auswahl von relevanten aber auch „interessanten“ klinischen Isolaten. Alle Teilnehmer sind natürlich weiterhin dazu aufgerufen, attraktive Parameter für eine zukünftige Erweiterung des Spektrums an Zielorganismen vorzuschlagen und deren mögliche Umsetzung mit dem Ringversuchsleiter zu diskutieren.

Aktueller Hinweis auf neue Ringversuche: Aufgrund einiger Anfragen aus dem Teilnehmer- und Kollegenkreis haben wir zwei zusätzliche Ringversuche etabliert, die nach erfolgreichen Probe-Ringversuchsrunden in 2018 dann auch möglichst zeitnah in das reguläre Portfolio „Bakterien- und Pilzgenomnachweis PCR/NAT“ von INSTAND e.V. übernommen werden sollen:

• Der Ringversuch RV 543: Francisella tularensis wurde in der aktuellen Aussendung bereits um den Zielorganismus Brucella spp. erweitert und wird zukünftig routinemäßig als kombinierter Ringversuch angeboten.
• Für die externe Qualitätssicherung zukünftig kommerziell verfügbarer (und damit wohl auch vermehrt eingesetzten) PCR/NAT-gestützten Nachweisverfahren für Urogenital-Infektionen haben wir mit der aktuellen Aussendung bereits einen neuen Ringversuch RV 547 „Urogenital-Panel“ etabliert, der vom Konzept her jeweils einige der nachfolgenden Erreger in unterschiedlichen Kombinationen und Mengen innerhalb des 4er-Panels enthält:
  Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis und ggf. Treponema pallidum.

Vorab auch noch eine Anmerkung zu den statistisch ermittelten und in den jeweiligen Tabellen 3 aufgeführten Leistungsdaten von kommerziellen PCR/NAT Testsystemen. Auffällig bei vielen der aktuellen aber auch bei einigen der früheren Ringversuche ist das unterschiedlich gute Abschneiden von Teilnehmern mit ein und demselben kommerziellen, vorkonfektionierten und teilweise auch automatisierten und/oder kartuschenartig geschlossenen Testsystemen.

Die meisten dieser Assays sind zudem auch noch IVD zertifiziert – mit allen aufwändigen herstellerseitigen Vorkehrungen zur möglichst zuverlässigen Durchführung und standardisierten Ergebnisinterpretation. Die auffällige „Streuung der Performance“ (bzw. das Auftreten einzelner Ausreißer) unterstreicht umso mehr die Bedeutung der aktuell vorgegebenen Qualitätsstandards, wie beispielsweise das regelmäßige Mitführen von geeigneten Extraktions-, Positiv- und Negativ-Kontrollen sowie Schulungen und kontrollierte Maßnahmen zur Vermeidung von exogenen Kontaminationsmöglichkeiten in PCR/NAT-Arbeitsbereichen, die u.a. im Rahmen der aktuellen RiLiBÄK, der Akkreditierung und der praxisorientiert verfassten MIQ-1 gefordert werden. Deren Sinnhaftigkeit und Stringenz mag aus Anwendersicht ja gelegentlich bezweifelt werden, wird aber in diesen Ringversuchsrunden (sozusagen von neutraler Warte aus) dennoch immer wieder aufs Neue bestätigt.

Neben den überaus motivierten und engagierten Mitarbeitern der verschiedenen Sollwert-Laboratorien unterstützen uns bei der Konzeption und Auswertung der zahlreichen Ringversuche zum Bakterien- und Pilzgenomnachweis PCR/NAT noch zahlreiche Kolleginnen und Kollegen aus unserem Hause. Allerherzlichsten Dank für ihre spontane Bereitschaft sowie ihr ehrenamtliches Engagement für unsere gemeinsamen Bemühungen zur externen Qualitätssicherung molekularbiologischer Nachweisverfahren in der infektiologischen Diagnostik.

Entsprechend des Grundgedankens unserer Ringversuchsaktivitäten wurde auch bei der Konzeption des aktuellen Ringversuchs zum „Bakteriengenomnachweis mittels PCR oder anderer Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT)“ bei einigen Zielorganismen der Versand von Proben mit relativ niedrigen Erregerzahlen angestrebt.

In den aktuellen Ringversuchssets befanden sich daher erneut einige Proben mit relativ geringer Menge folgender Zielorganismen: Neisseria gonorrhoeae (Probe # 1815303), Bordetella pertussis (Probe # 1815324), Salmonella enterica ser. Typhi (Probe # 1815373), Mycoplasma pneumoniae (Probe # 1815414), Coxiella burnetii (Probe # 1815423), Ureaplasma parvum (Probe # 1815474) sowie Pneumocystis jirovecii (Probe # 1815603).

Im Rahmen der Testentwicklung bzw. Testoptimierung können diese Probensätze, u.a. als Qualitätskontrollen oder als standardisierte Sensitivitätsmarker, für die Austestung der unteren Nachweisgrenze von eigenentwickelten Nukleinsäure-gestützten Testsystemen dienen. An dieser Stelle möchten wir auch darauf hinweisen, dass zahlreiche Rückstell-Probensätze der früheren Ringversuche noch verfügbar sind, und bei Bedarf über den Ringversuchsleiter formlos nachbestellt werden können.

Mit Ausnahme der zuvor erwähnten „grenzwertig positiven“ Einzelproben wurden die Mengen der entsprechenden Zielorganismen in den Probensätzen der aktuellen Ringversuchsrunde wieder relativ deutlich über der Nachweisgrenze von „durchschnittlich sensitiven PCR/NAT-Testkonzepten“ eingestellt. Diese definieren wir wie folgt: als Richtwert für die Bewertung von Ringversuchsergebnissen gilt das 10- bis 50-fache der unteren Nachweisgrenze durchschnittlich sensitiver PCR-Protokolle unter Standardbedingungen (z.B. 50 µl Block-Cycler Reaktionsansätze, 35 PCR-Zyklen, ggf. entsprechende real-time PCR-Protokolle; gut evaluierte Primersequenzen).

Bei den meisten Probenmaterialien der aktuellen Ringversuchsrunde stellen falsch-negative Ergebnisse damit einen deutlichen Hinweis auf ernstzunehmende Mängel innerhalb der eingesetzten Verfahren zur Nukleinsäure-Extraktion, Amplifikation und Detektion dar.

Falsch-positive Ergebnisse sind dagegen in der Regel als Hinweis auf eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung und/oder auf mangelnde Spezifität der eingesetzten Testsysteme zu betrachten.

In bewährter Form werden im Folgenden die Ergebnisse der jeweiligen erregerspezifischen Ringversuche dargestellt. Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1]) zeigt dabei die Probenzusammensetzung und das erwartete Ergebnis (Sollwert) mit den entsprechenden Codenummern der Ergebnisbögen. Die von den einzelnen Teilnehmern mitgeteilten Ergebnisse werden in Tab. 2 (Anhang 1 [Anh. 1]) nach der Häufigkeit der Mitteilung von positiven oder negativen Ergebnissen, und in Tab. 3 (Anhang 1 [Anh. 1]) nach der absoluten Anzahl der richtig positiven und richtig negativen Ergebnisse, sowie deren prozentualem Anteil (Befundhäufigkeit) je Amplifikationssystem bzw. Testkonzept aufgeschlüsselt.

Für die objektive Bewertung von kommerziellen Testsystemen sollten neben der rein statistischen Betrachtung der mitgeteilten Ringversuchsergebnisse auch die Anzahl und vor allem die methodische bzw. technische Qualifikation der individuellen Teilnehmer berücksichtigt werden. Da wir im Zuge unserer Ringversuche aber das gesamte Spektrum von spezialisierten Expertenlabors bis hin zum „Gelegenheitsanwender“ abdecken, müssen die arithmetisch ermittelten Richtigkeitsquoten bei der Bewertung einzelner Testsysteme immer mit einem gewissen Toleranzbereich betrachtet werden.

Auch im Rahmen des hier diskutierten Ringversuchs waren wieder einige Auffälligkeiten hinsichtlich der Spezifität und Sensitivität von bestimmten Testkonzepten, und der für den Nachweis verwendeten Zielsequenzen, zu beobachten. Diese Aspekte sind bei der Auswertung des jeweiligen Ringversuchs aufgeführt und dort auch kurz diskutiert. Zusätzlich stehen für die früheren, für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe zusätzlicher Informationen (wie die graphisch dokumentierten Ergebnisse unserer quantitativen real-time PCR-Testsysteme oder die Ergebnisse einiger kommerzieller PCR-Testsysteme) auch unter folgender Internetadresse: http://www.udo-reischl.de; Unterpunkt „Auswertung der Ringversuche“ und natürlich auch über die Homepage von INSTAND e.V. (http://www.instand-ev.de) als pdf-Files zum freien Download bereit. An dieser Stelle möchte ich mich noch einmal ausdrücklich bei den geschätzten Kolleginnen und Kollegen für ihre zahlreichen und überaus konstruktiven Kommentare und Anregungen zu den Ausführungen in dieser Ringversuchsdiskussion sowie deren tatkräftige Unterstützung bei der Konzeption und dem Aufbau neuer Ringversuche bedanken.

Die Ergebnislage des aktuellen Ringversuchs deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus vorangegangenen Ringversuchen zum kombinierten NAT-gestützten C. trachomatis- und Gonokokken-Nachweis. Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt jeweils eine Probe mit einer relativ hohen Menge an C. trachomatis (# 1815304, ~5x10⁵ IFU/mL), und zwei Proben mit einer 10-fach niedrigeren Menge an C. trachomatis (# 1815302 und # 1815303, ~5x10⁴ IFU/mL). Eine Probe (# 1815302) war dabei zugleich mit ca. 5x10⁵ CFU/mL an N. gonorrhoeae, eine Probe mit einer 10-fach niedrigeren Mengen an N. gonorrhoeae Zielorganismen (# 1815304; ~5 x10⁴ CFU/mL) und eine der C. trachomatis-positiven Proben mit einer relativ geringer Menge an N. gonorrhoeae Zielorganismen (# 1815303; ~5 x10² CFU/mL) versetzt.

Trotz der relativ geringen Erregermenge in manchen der vier unterschiedlich zusammengesetzten positiven Proben und der gleichzeitigen Anwesenheit von C. trachomatis und N. gonorrhoeae DNA führte auch diesmal die Verfügbarkeit gut evaluierter und zum Teil automatisierter NAT-gestützter Analysesysteme für Chlamydia trachomatis zu hohen Richtigkeitsquoten sowohl für positive, als auch für negative Befunde.

Der Übersichtlichkeit halber werden wir bei diesem kombinierten Ringversuch (CT/NG) die Ergebniskonstellation zukünftig 7 getrennten Tabellen (Anhang 1 [Anh. 1], S. 1–4) darstellen. Damit wird die diagnostische Performance der jeweiligen Testsysteme beim Nachweis von CT und NG aussagekräftiger (Tabelle 4: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei CT, Tabelle 6: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei NG; jeweils gefolgt von den Richtigkeitsquoten nach aufgeführten Testsystemen in den Tabellen 5 und 7).

Auch wenn die schwächer positiven Proben # 1815302 und # 1815303 des aktuellen Ringversuchs nur mit einer relativ geringen Menge an C. trachomatis-Zielorganismen versetzt worden waren, fanden sich unter den von insgesamt 258 Teilnehmern mitgeteilten NAT-Ergebnissen für C. trachomatis erfreulicherweise keine falsch-negativen Ergebnisse. Bei der ca. 10-fach stärker CT-positiven Probe # 1815304 des aktuellen Ringversuchs wurde lediglich von einem der 258 Teilnehmer ein falsch-negatives Ergebnis mitgeteilt.

Im Rahmen des NAT-gestützten Gonokokken-Nachweises wurden für die drei positiven Proben # 1815302, # 1815304 und # 1815303 (N. gonorrhoeae; ca. 1x10⁵, 1x10⁴, bzw. 5x10² CFU/mL) diesmal von 4 der insgesamt 256 Teilnehmer falsch-positive Ergebnisse und von 15 Teilnehmern falsch-negative Ergebnisse für Gonokokken DNA mitgeteilt. Auffällig war die Häufung von falsch-negativen Ergebnissen (n=14) bei Probe # 1815303, die neben einer relativ geringen Menge an Gonokokken zugleich signifikante Mengen an C. trachomatis infizierten Zellen enthielt. Wie bereits bei einigen früheren Ringversuchsrunden beobachtet, sind offenbar einige der im Teilnehmerkreis eingesetzten kommerziellen und in-house PCR/NAT Testsysteme etwas störanfällig was den sensitiven Nachweis von Gonokokken bei gleichzeitiger Anwesenheit von C. trachomatis betrifft. Da sich das hier beobachtete „Sensitivitätsproblem“ offensichtlich nicht auf bestimmte Testkonzepte eingrenzen lässt und sich sporadisch durch das ganze Portfolio der eingesetzten Testsysteme zieht, kann dem großen Rest des Teilnehmerfeldes erneut eine erfreulich gute analytische Sensitivität und Spezifität ihrer CT- und GO-spezifischen NAT Testsysteme, sowie der angewandten Prozeduren zur Probenaufarbeitung und -prozessierung attestiert werden.

Aufgrund der relativ geringen Menge an N. gonorrhoeae Zielorganismen in Probe # 1815303 wurden die mitgeteilten Ergebnisse diesmal nicht in die Bewertung für die Zertifikate mit einbezogen. Dies ist auch durch die beiden grau schraffierten Felder in Tab. 2 (Anhang 1 [Anh. 1], Seite 1) und Tab. 6 (Anhang 1 [Anh. 1], Seite 3) gekennzeichnet.

Bei den insgesamt lediglich 4 für GO falsch-positiven Ergebnissen handelt es sich vermutlich um isolierte Kontaminationsereignisse oder Ringversuchstypische „sporadische Ausreißer“, da von einem Großteil der Anwender mit den unterschiedlichsten Testsystemen hier durchweg korrekte Ergebnisse berichtet wurden.

Angesichts der streng normierten und standardisierten Abarbeitungsprotokolle von kommerziellen Testsystemen bleibt es für den Ringversuchsleiter jedes Mal aufs Neue verwunderlich, dass ein nennenswerter Anteil der teilnehmenden Laboratorien mit den betroffenen Testsystemen erfolgreich die vorgegebenen Zielwerte erreicht. Ohne denjenigen Teilnehmern, die mit bestimmten kommerziellen Testsystemen die Zielwerte nicht erreichen, zu nahe treten zu wollen, deutet dieser Umstand in diesen Fällen dann wohl eher auf individuelle Abweichungen vom Protokoll oder bestimmte Fehler bei der Probenabarbeitung, als auf intrinsische Unzulänglichkeiten, der in der Regel gut evaluierten Testsysteme hin.

Ich glaube, es ist auch für den Leser dieser Ringversuchsdiskussion weitgehend nachvollziehbar, dass wir als Organisatoren von Testkonzept- und Testplattform-übergreifenden Ringversuchen bei der Konfektionierung unserer Probenmaterialien leider nicht jede Besonderheit im Abarbeitungsprotokoll von kommerziellen Testsystemen berücksichtigen oder unterschiedliche Arten von Ringversuchsprobenmaterial für bestimmte Testsysteme bereitstellen können.

Auf diesen Umstand wurde bereits bei früheren Ringversuchen mehrfach im Zusammenhang mit den RNA-Zielsequenzen der AMPLIFIED CT Testkits oder der APTIMA COMBO 2 Testkits (Hersteller: Gen-Probe Inc.) hingewiesen. Werden von Teilnehmern bestimmte NAT-Testsysteme eingesetzt, die erregerspezifische RNA-Zielsequenzen nachweisen oder auf einem RNA-basierten Amplifikationsprozess (TMA; Transcription-Mediated Amplification, o.ä.) beruhen, so kann mit dem hier versandten Probenmaterial offiziell keine regelgerechte Abprüfung der entsprechenden Sensitivitäten unter Routinebedingungen gewährleistet werden. Aber selbst wenn das Herstellungsverfahren unserer Ringversuchsproben primär nicht auf die Stabilisierung von RNA-Molekülen hin optimiert und getestet wurde, so konnten dennoch sowohl bei der aktuellen, wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchsrunden, von vielen Teilnehmern mit RNA-gestützten Testsystemen hohe Richtigkeitsquoten erzielt werden. Aktuell wurden sowohl die C. trachomatis als auch die Neisseria gonorrhoeae Zielorganismen von fast allen der 7 Teilnehmer mit RNA-basierten Gen-Probe Testsystemen in den beiden höherer Menge an Zielorganismen erfolgreich nachgewiesen und die entsprechenden Zertifikate erlangt.

Entsprechende Inhibitionskontrollen wurden von 257 der insgesamt 258 Teilnehmern durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal nicht mitgeteilt.

Bei den ermittelten Richtigkeitsquoten für Teilnehmer mit dem Roche COBAS Amplicor, COBAS TaqMan, dem Becton Dickinson ProbeTec, Abbott RealTime CT/NG, Artus CT, LightMix CT/NG oder anderen Testsystemen muss berücksichtigt werden, dass im Rahmen dieser Ringversuchsauswertung in Tab. 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 2) nicht zwischen dem spezifischen Nachweis von Chlamydien und Gonokokken differenziert wurde. Mit dem Großteil dieser kombinierten Testsysteme wurden insgesamt erfreulich hohe Richtigkeitsquoten sowohl für die positiven als auch für die negativen Ergebnisse beobachtet. Um eine detaillierte Bewertung der C. trachomatis- und GO-spezifischen NAT-Komponenten dieser kombinierten Testsysteme zu ermöglichen, wurden diesmal zusätzlich die Tabellen 4 bis 7 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 2–4) angefertigt. In den Tabellen 4 und 5 sind dabei nur die C. trachomatis (CT)-spezifischen Ergebnisse und in den Tabelle 6 und 7 nur die Neisseria gonorrhoeae (GO)-spezifischen Ergebnisse dargestellt und statistisch ausgewertet.

Anmerkung: Bevor durch einen kurzen Blick auf die prozentualen Richtigkeitsquoten in diesen Tabellen ein eventuell etwas zu voreiliger Rückschluss auf die diagnostische „Performance“ bestimmter kommerzieller Testsysteme gezogen wird, sollten erst die effektiven Teilnehmerzahlen berücksichtigt werden, die den dargestellten Richtigkeitsquoten arithmetisch zugrunde liegen.

Im handschriftlichen Kommentarfeld der Ergebnisformulare wurden unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: BD Max CT/GC/TV assay (11x), HAIN Lifescience FluoroType CT/NG (4x), QIAGEN artus CT/GC QS-RGQ Kit (4x), Urethritis basic/plus von fast-track Diagnostics (5x), Seegene Allplex STI Essential Assay (4x), Seegene Allplex Genital ulcer Assay (1x), GeneProof N. gonorrhoeae PCR Kit (3x), GeneProof C. trachomatis PCR Kit (3x), BIORON RealLine single und multiplex CT/NG Kits (3x), Sacace Biotechnologies N. gonorrhoeae Real-TM (3x), Sacace Biotechnologies C. trachomatis Real-TM (3x), Seegene Anyplex™ II STI-7 Detection (3x), VERSANT CT/GC DNA Assay von Siemens (2x), EUROIMMUN Euroarray STI-11 (2x), AmpliSens C. trachomatis-FRT PCR Kit (1x), AmpliSens N. gonorrhoeae-screen-FRT PCR Kit (1x), Mikrogen Diagenode N. gonorrhoeae (s-DiaGono) (1x), Mikrogen Diagenode N. gonorrhoeae Real Time PCR kit (2x), Mikrogen Diagenode C. trachomatis Real Time PCR kit (1x), Mikrogen ampliCube STD1 (1x), Mikrogen FTD Urethritis plus (1x), Aptima Combo 2 assay CT/GC (2x), Medac/Goffin CT/NG Assay (1x), VIASURE sexually transmitted diseases RT PCR Detetion Kit (1x), DiagCor GenoFlow STD array test kit (1x), Autoimmun Diagnostika Gen ID RDB2110 STD (1x) und Liferiver C. trachomatis/ N. gonorrhoeae Real Time PCR Kit (1x).

Unabhängig von der Art des verwendeten Testsystems soll in diesem Zusammenhang auch noch einmal darauf hingewiesen werden, dass in Gegenwart von relativ hohen Mengen an Zielorganismen (bzw. deren Nukleinsäure) die interne Kontrollreaktion aufgrund der „Konkurrenzsituation“ mit der Amplifikation der eigentlichen Zielsequenz durchaus negativ ausfallen kann, obwohl keine Inhibition der PCR-Reaktion im eigentlichen Sinne vorliegt.

Das Probenset des aktuellen Ringversuchs enthielt diesmal zwei Proben mit ca. 5x10⁵ IFU/mL an C. trachomatis (# 1815312 und # 1815314), eine Probe mit ca. 5x10⁴ IFU/mL an C. trachomatis (# 1815311), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1815313), die ausschließlich nicht infizierte Zellen und Escherichia coli enthielt.

Wie Tab. 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 5) der statistischen Auswertung zu entnehmen ist, wurden von den 83 Teilnehmern bei der C. trachomatis-negativen Probe # 1815313 sechs falsch-positive Ergebnisse und bei den drei C. trachomatis-positiven Proben (# 1815311, # 1815312 und # 1815314) diesmal insgesamt 3 falsch-negative Ergebnisse mitgeteilt.

Die markante Übereinstimmung der aktuellen Ergebniskonstellation mit den Beobachtungen und hervorragenden Richtigkeitsquoten vorhergegangener Ringversuche mit ähnlicher Menge an C. trachomatis-Zielorganismen kann erneut als Beleg für eine hohe Zuverlässigkeit und Konstanz der eingesetzten Testsysteme sowie der aktuellen Kits und automatisierten Testplattformen zur Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Prozessierung angesehen werden. Bei den 6 falsch-positiven CT Ergebnissen für Probe # 181513 handelt es sich vermutlich um Kontaminationsereignisse bei der Probenaufbereitung und -abarbeitung der gleichzeitig prozessierten CT-positiven Proben. Den betroffenen Laboratorien sollten diese Ergebnisse Anlass geben, ihren individuellen diagnostischen Workflow hinsichtlich der Kontaminationssicherheit während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik zu überprüfen und gegebenenfalls zu optimieren.

Auch wenn mit ca. 5x10⁴ IFU/mL an Zielorganismen im Probenmaterial (Probe # 1815311) die untere Nachweisgrenze hochsensitiver und standardisierter PCR/NAT-gestützter Testsysteme noch nicht erreicht oder unterschritten sein sollte, stehen mit den Rückstellproben des Ringversuchs RV 531 Juni 2018 den Teilnehmern mit hohem Anspruch an die individuelle Testsensitivität wieder geeignete Sets zur Überprüfung und Optimierung ihrer jeweiligen NAT-gestützten Testsysteme zur Verfügung. Angesichts der nach wie vor anhaltenden Diskussion um das „Pooling“ von entsprechendem Untersuchungsmaterial bleibt der Aspekt der analytischen Sensitivität der jeweils eingesetzten Testsysteme bedeutsam.

Inhibitionskontrollen wurden von allen der insgesamt 83 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal von keinem der Teilnehmer beobachtet. In diesem Zusammenhang sei kurz angemerkt, dass wir auch im aktuellen Ringversuch keine der Einzelproben absichtlich mit inhibitorischen Substanzen versetzt haben. Erfreulicherweise waren im Rahmen dieses Ringversuchs im Großen und Ganzen keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität und Spezifität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und den selbstentwickelten in-house-Testsystemen zu beobachten. Trotz der relativ geringen Menge an Zielorganismen bewegten sich die Richtigkeitsquoten dabei durchweg auf erfreulich hohem Niveau.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. folgende Testsysteme aufgeführt: GeneProof C. trachomatis PCR Kit (4x), Sacace Biotechnologies C. trachomatis Real-TM (3x), BD Max CT/GC/TV assay (2x), Seegene Allplex STI Essential Assay (1x), Sansure Biotech C. trachomatis DNA Fluorescence Diagnostic Kit (1x), Autoimmun Diagnostika RDB2135 CAP Bakterien (1x), VERSANT CT/GC DNA Assay von Siemens (1x), VIASURE sexually transmitted diseases RT PCR Detetion Kit (1x), Genetrac DK-CHT C. trachomatis DNA Detection Kit (1x) und EUROIMMUN Euroarray STi-11 (1x).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt zwei positive Proben mit einer hohen und einer etwa 100-fach geringeren Menge an Zielorganismen (# 1815321 mit 10⁶ CFU/mL und # 1815324 mit 10⁴ CFU/mL an B. pertussis), sowie eine Probe mit einem klinischen Isolat von Bordetella parapertussis als verwandte Spezies (# 1815322 mit 10⁵ CFU/mL). Probe # 1815323 enthielt diesmal keine Zielorganismen, sondern lediglich E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen.

Die Verfügbarkeit von offensichtlich inzwischen sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesystemen für den Nachweis von Bordetella pertussis DNA führte auch diesmal wieder zu durchwegs hohen Richtigkeitsquoten sowohl bei den positiven als auch bei den negativen Proben. Von 9 der insgesamt 167 Teilnehmer wurde ein falsch-positives Ergebnisse für die negative Probe # 1815322 (B. parapertussis) mitgeteilt. Hierbei handelt es sich offensichtlich um laborinterne Kontaminationsereignisse oder um Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung. Auch eine mangelnde Spezifität der eingesetzten PCR/NAT-Testsysteme ist bei dieser Konstellation denkbar.

Unter den übrigen PCR/NAT-Ergebnissen befanden sich zudem 38 falsch-negative und 2 als „fraglich“ klassifizierte Ergebnisse für die relativ schwach positive Probe # 1815324 (1x10⁴ CFU/mL an B. pertussis).

Inhibitionskontrollen wurden von 166 der insgesamt 167 Teilnehmer durchgeführt und Inhibitionsereignisse wurden dabei von keinem Teilnehmer beobachtet.

Bei einer Menge von 10⁴ CFU/mL an B. pertussis Zielorganismen (entspricht ca. 10³ CFU in dem für PCR-Untersuchungen typischerweise prozessierten Probenvolumen von 100 µl) nähert man sich offensichtlich der unteren Nachweisgrenze entsprechender Testsysteme an. Aufgrund der relativ geringen Menge an Zielorganismen in Probe # 1815324 wurden die mitgeteilten Ergebnisse diesmal nicht in die Bewertung für die Zertifikate mit einbezogen. Dies ist auch durch die grau schraffierten Felder in Tab. 2 Anhang 1 [Anh. 1], S. 6) gekennzeichnet.

Wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchen verwendete die überwiegende Anzahl der Teilnehmer selbstentwickelte (in house) Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von B. pertussis. In diesem Zusammenhang wurde von 87 Teilnehmern explizit die Verwendung der Insertionssequenz IS481, von 12 Teilnehmern die Verwendung der Pertussis Toxin Gen und von 4 Teilnehmern die Verwendung eines ribosomalen Gens als B. pertussis-spezifische Zielsequenz angegeben.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsystem“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: HAIN Lifescience FluoroType oder Genoquick Bordetella (11x), Seegene Allplex Respiratory Panel 4 (6x), Seegene Anyplex II RB5 Detection (1x), AmpliGnost B. pertussis/parapertussis PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (5x), Altona diagnostic RealStar Bordetella PCR Kit (5x), Mikrogen ampliCube (2x), Attomol Bordetella Realtime LT (2x), fast-track Diagnostics Bordetella (2x), ARGENE Bordetella r-gene (3x), BioGX Bordetella PCR Kit (2x), Sacace Biotechnologies B. pertussis / B. parapertussis / B. bronchiseptica Real-TM (2x), Meridian Bioscience illumigene Pertussis (2x), Bio-Evolution RT PCR kit B. pertussis/parapertussis (2x), AmpliSens Bordetella multi FRT PCR Kit (1x), Ingenetix Bacto Real B. pertussis/B. parapertussis (1x), DiaSorin Simplexa Bordetella direct Kit (1x), QUIDEL AmpliVue Bordetella Assay (1x), VIASURE Bordetella Real Time PCR Detection Kit (1x) und PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x).

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 7) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal eine positive Probe eines Clarithromycin-resistenten H. pylori (# 1815333; 5x10⁴ CFU/ml) und eine positive Probe eines Clarithromycin-sensiblen H. pylori (# 1815331; 5x10⁴ CFU/ml). Probe # 1815334 enthielt eine Kultursuspension der Spezies Campylobacter jejuni (~5x10⁴ CFU/ml) und Probe # 1815332 ausschließlich humanes Zellmaterial zusammen mit einer nennenswerten Menge an E. coli.

Erfreulicherweise wurden beide H. pylori-haltigen Proben (# 1815331 und # 1815333) von nahezu allen der insgesamt 53 Teilnehmer als richtig-positiv bewertet. Wie bereits in den letzten Ringversuchen bestätigte sich auch hier wieder die Verfügbarkeit von sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesystemem mit hoher analytischer Sensitivität. Im aktuellen Ringversuch wurde zudem die analytische Spezifität der verwendeten Testsysteme durch die Probe # 1815334 überprüft, welche mit Campylobacter jejuni (~5x10⁴ CFU/mL) eine mit dem Zielorganismus Helicobacter pylori verwandte Spezies enthielt. Auch für diese Probe wurden erfreulicherweise lediglich bei zwei der insgesamt 53 Teilnehmer falsch-positive PCR/NAT-Ergebnisse durch mangelnde Spezifität oder Kreuzreaktionen beobachtet. Dabei könnte es sich natürlich auch um laborinterne Kontaminationsereignisse oder Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und sequenziellen Abarbeitung gehandelt haben.

Inhibitionskontrollen wurden von 52 Teilnehmern durchgeführt und Inhibitionsereignisse wurden hier nicht beobachtet. Sowohl die kommerziellen, als auch die eigenentwickelten Testsysteme schnitten im aktuellen Ringversuch wieder einmal erfreulich gut ab. So erreichten die in-house Testsysteme wie auch die kommerziellen Assays Richtigkeitsquoten von annähernd 100%, was die richtig-positiven Ergebnisse betrifft. Auch bei den richtig-negativen Ergebnissen waren keine signifikanten Unterschiede in den Richtigkeitsquoten von in-house Testsystemen und kommerziellen Assays auszumachen.

Bis auf 38 Teilnehmer mit kommerziellen Testsystemen (im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ 2 x LightMix Helicobacter Kit von TIB Molbiol angegeben) verwendeten die Teilnehmer zum NAT-gestützten Nachweis von H. pylori selbstentwickelte, sog. in-house Testsysteme.

Wie in der Testbeschreibung des RV 533 vermerkt, konnten die Teilnehmer auf freiwilliger Basis auch die vermeintliche Clarithromycin-Resistenz der untersuchten H. pylori-Isolate mitteilen. Diese Spezialuntersuchung zur molekularbiologischen Resistenztestung erfolgt in der Regel über die Amplifikation und Sequenzierung von charakteristischen Bereichen, innerhalb der H. pylori 23S rDNA bzw. der Sequenzanalyse dieses Genombereichs, mittels Hybridisierungssonden. Ergebnisse wurden hier von 47 der insgesamt 53 Teilnehmer mitgeteilt, und mit Ausnahme von drei Teilnehmern waren die mitgeteilten Ergebnisse der molekularen Resistenztestung auch durchweg korrekt.

Wie auch bereits bei den vorhergegangenen Runden dieses Ringversuchs mehrfach diskutiert, besteht die eigentliche Herausforderung bei dem Nukleinsäure-gestützten Nachweis von EHEC/STEC prinzipiell nicht so sehr in dem Nachweis sehr geringer Mengen an Zielorganismen, sondern vielmehr in der differenzierten Analyse und der Typisierung unterschiedlicher Shiga-Toxin-Genen und anderer putativer Pathogenitätsfaktoren (wie das für Intimin kodierende eae-Gen oder das für Enterohämolysin kodierende hlyA-Gen).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine Probe mit relativ hoher Menge eines EHEC:O157 Isolats (# 1815343; ca. 1x10⁶ CFU/mL; stx₁-, stx₂-, eae-, und hlyA-positiv), eine Probe mit etwas geringerer Menge dieses EHEC Isolats (# 1815344, ~1x10⁵ CFU/mL) und eine Probe mit 1x10⁴ CFU/ml eines EPEC Isolats (# 1815341; eae-positiv!). Probe # 1815342 enthielt einen E. coli K12 Stamm (eae- und hlyA-negativ).

Abgesehen von der etwas schwächer positiven EPEC Probe # 1815341 (mit ca. 10⁴ CFU/ml) führte die Verfügbarkeit von mittlerweile bestens etablierten NAT-gestützten Testsystemen und molekularbiologischen Differenzierungsstrategien für EHEC hier durchwegs zu hohen Richtigkeitsquoten – sowohl für positive als auch für negative Befunde. Zudem waren in der aktuellen Runde des EHEC PCR-Ringversuchs auch keine Isolate mit „exotischen“ Varianten der Shiga-Toxin-Gene vertreten.

Die beiden EHEC-positiven Proben # 1815343 und # 1815344 wurden problemlos von allen der insgesamt 140 Teilnehmer auch als solche erkannt und im Ergebnisformular als richtig-positiv berichtet. Bekanntlich steht ja die Abprüfung der analytischen Sensitivität bei diesem Ringversuch nicht so sehr im Fokus, da in den meisten der teilnehmenden Laboratorien ein NAT-gestützter Nachweis von Shiga-Toxin-Genen im Umfeld der EHEC-Diagnostik primär als Kulturbestätigungstest eingesetzt wird. Bei zukünftigen Ringversuchen werden wir uns bemühen dass die meisten der positiven Proben wieder relativ hohe Mengen an Zielorganismen enthalten und der Schwerpunkt somit auf einer Abprüfung der analytischen Spezifität der eingesetzten Testsysteme liegt und weniger auf der dabei erzielten unteren Nachweisgrenze.

Die Probe # 1815342 (E. coli K12 Stamm, eae-, hlyA-negativ) wurde erfreulicherweise von allen Teilnehmern korrekt als negativ für EHEC/STEC berichtet.

Das EPEC Isolat in Probe # 1815341 (E. coli K12 Stamm, eae-positiv, hlyA-negativ) wurde von 139 der insgesamt 140 Teilnehmer korrekterweise als negativ befundet. Lediglich ein Teilnehmer berichtete hier ein positives PCR-Ergebnis für EHEC. Eventuell handelte es sich hier auch lediglich um eine Misinterpretation eines positiven PCR-Nachweis des eae-Gens.

Neben in-house Testsystemen, mittlerweile auch oft als LDT (lab developed tests) bezeichnet, werden zunehmend vorkonfektionierte kommerzielle Assays eingesetzt. In den Richtigkeitsquoten zeigte sich keine Über- bzw. Unterlegenheit eines Systems, was für die breite Etablierung PCR-/NAT-gestützter Testsysteme spricht. Inhibitionskontrollen wurden von 139 der 140 Teilnehmer durchgeführt, Inhibitionsereignisse wurden in keinem Fall beobachtet.

Zudem wurden von 120 Teilnehmern die differenzierten Ergebnisse der molekulargenetischen Shiga-Toxin-Subtypisierung sowie des gezielten Nachweises von Intimin- (eae) und/oder Enterohämolysin (hlyA)-Genen mitgeteilt. Wenn auch die Typisierung nicht immer vollständig durchgeführt wurde, so waren diese Angaben zur Typisierung, zumindest in dem mitgeteilten Umfang, Großteils korrekt. Lediglich zwei Teilnehmer berichteten bei der Subtypisierung falsche Ergebnisse.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: BD Max Enteric Bacterial Panel (6x), TIB Molbiol LightMix modular stx-1/stx-2/eae (4x), Seegene Allplex Gastrointestinal Panel Bacteria II Assay (4x), Altona diagnostic RealStar EHEC PCR Kit (3x), Amplex eazyplex EHEC complete (3x), Sacace Biotechnologies EHEC Real-TM (1x), AmpliGnost Verotoxin 1/2 (Differenzierung) PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), fast-track Diagnostics (1x), Biomerieux BioFire GI Panel (1x), Mikrogen ampliCube (1x) und VIASURE E.coli Real Time PCR Detection Kit (1x).

Nachdem die Probenauswahl des letzten Ringversuchs mehr auf die analytische Sensitivität der eingesetzten Testsysteme abzielte, wollten wir uns im aktuellen Ringversuch wieder einmal auf die Prüfung der analytischen Spezifität fokussieren.

Daher wurden bei der Konzeption des Ringversuchs diesmal drei unterschiedliche Borrelien-Spezies an die Teilnehmer versandt. Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt jeweils eine Probe mit ca. 5x10⁵ Organismen/mL an Borrelia burgdorferi sensu stricto (# 1815353), eine Probe mit ca. 5x10⁵ Organismen/mL an Borrelia garinii OspA Typ 3 (# 1815352) und eine Probe mit ca. 51x10⁵ Organismen/mL an Borrelia bissettiae (# 1815354). Probe # 1815351 enthielt lediglich signifikante Mengen eines E. coli K12 Stammes.

Nochmals eine kurze Rekapitulation: Schon die Tatsache, dass mittlerweile mehr als 20 verschiedene, dem B. burgdorferi sensu lato-Komplex zugehörigen Spezies beschrieben sind impliziert erhebliches Problempotential für den PCR-/NAT-gestützten Nachweis von B. burgdorferi. B. garinii ist eine seit langem bekannte, gesichert humanpathogene Spezies die weit verbreitet in Europa und Asien vorkommt und häufig bei disseminierten Infektionen gefunden wird. Dagegen ist die Datenlage für B. bissettiae (noch) sehr begrenzt. Diese Spezies konnte in den USA aus Zecken mittels Kultur und PCR nachgewiesen werden, Erkrankungsfälle sind nicht bekannt. In Europa findet sich diese Spezies extrem selten in Zecken (bislang nur mittels PCR) oder Patientenproben. Allerdings steht ein Isolat aus Liquor (Deutschland, Neuroborreliose) zur Verfügung, das einzige gesichert dieser Spezies zuzuordnende Patientenisolat weltweit. Nachdem bei eigenen Untersuchungen zur Sensitivität verschiedener Amplifikationsprotokolle der Nachweis dieser Spezies z.T. erhebliche Probleme bereitete, ist das Ergebnis des vorliegenden Ringversuchs – von 119 der insgesamt 122 Teilnehmer richtig positiv befundet – besonders erfreulich.

Einmal mehr muss in diesem Zusammenhang vor der nicht zu empfehlenden Untersuchung von Zecken um daraus eine Therapieindikation abzuleiten gewarnt werden: Abgesehen davon, dass die Studienlage keinen signifikanten Informationsgewinn für die Patientenversorgung erwarten lässt, sind diese Untersuchungen ohne weitergehende Identifikation der nachgewiesenen Spezies schlicht als gefährlich für den Patienten einzustufen, da die Angabe „B. burgdorferi s.l. nachgewiesen“ grundsätzlich auch nicht-humanpathogene Arten mit einschließt.

Nach dieser knappen Auffrischung zu den Ringversuchsergebnissen: Alle der 122 Teilnehmer berichteten diesmal ein korrekt positives PCR/NAT-Ergebnis für die Borrelia burgdorferi sensu stricto-positive Probe # 1815353 (~5x10⁵ Organismen/mL) und ein korrekt negatives PCR/NAT-Ergebnis für die negative Probe # 1815351.

Der zuverlässige Nachweis von Borrelia garinii in der Probe mit relativ hoher Erregerlast (# 1815352 mit ~5x10⁵ Organismen/mL) bereitete ebenfalls nahezu keinem der 122 Teilnehmer signifikante Probleme. Da hier von einem Großteil der Anwender mit den unterschiedlichsten Testsystemen durchweg korrekte Ergebnisse berichtet wurden, handelt es sich bei den 3 falsch-negativen Ergebnissen und dem von einem Teilnehmer als „fraglich“ klassifizierten Ergebnis vermutlich um Ringversuchstypische „sporadische Ausreißer“.

Probe # 1815354 mit ca. 5x10⁵ Borrelia bisettiae-Zielorgansimen/mL wurde von 119 (97%) der Teilnehmer als richtig positiv erkannt und lediglich 3 Teilnehmer berichteten ein falsch-negatives oder ein als „fraglich“ klassifiziertes Ergebnis. Bei der letztgenannten Probe sollten falsch-negative Ergebnisse den betroffenen Teilnehmern jedoch Anlass zur gelegentlichen Überprüfung und Optimierung ihres jeweiligen NAT-gestützten Testsystems geben. Möglicherweise ist hier die Gesamtsensitivität des analytischen Workflows und/oder die Spezifität bzw. Abdeckung der unterschiedlichen Borrelien-Spezies des verwendeten PCR-NAT Assays unzureichend.

Interne oder externe Inhibitionskontrollen wurden von nahezu allen Teilnehmern mitgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse der PCR-Reaktion wurden im Rahmen dieser Ringversuchsrunde von keinem Teilnehmer beobachtet.

Wie bei den vorhergehenden Ringversuchsrunden haben auch diesmal wieder ungefähr knapp die Hälfte der Teilnehmer selbstentwickelte (in-house) Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von Borrelien-DNA verwendet, kommerzielle Testsysteme wurden von 74 der 122 Teilnehmer eingesetzt.

Im Großen und Ganzen waren im Rahmen dieses Ringversuchs auch keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen (Sensitivität zwischen 97 und 100%) und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen (durchschnittliche Sensitivität ca. 94%) zu beobachten. Dennoch kann angemerkt werden, dass von den insgesamt 5 falsch-negativen Ergebnissen für die Proben # 1815352 (B. garinii) und # 1815354 (B. bissettiae) 4 davon durch in-house Testsysteme generiert wurden. Gegebenenfalls sollte also die Sensitivität und/oder Spezifität der hauseigenen Testsysteme überprüft werden.

Darüber hinaus wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: HAIN Lifescience FluoroType Borrelia (3x), Demeditec GenFlow Borrelia plus PCR (3x), BIORON RealLine Borrelien Kit (2x), Mikrogen alphaCube Borrelia (2x), BactoReal B. burgdorferi von Ingenetix (2x), Attomol B. burgdorferi Realtime LT (2x), Sacace Biotechnologies B. burgdorferi Real-TM (2x), EliGene Borrelia LC von Elisabeth Pharmacon (2x), Autoimmun Diagnostika GenID Zecken Screening Kit (1x) und VIASURE Tick Borne Diseases Real Time PCR Detection Kit (1x).

Vorab ein kurzer der Hinweis: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Legionella pneumophila aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Er ist daher NICHT für die Abprüfung von immunologischen Direktnachweisverfahren wie L. pneumophila SG1 Urin-Antigen Testen o.ä. geeignet. Einzelne Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets können daher typischerweise auch relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von L. pneumophila-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal nur eine positive Probe, # 1815364, die mit einer Menge von ca. 1x10⁴ CFU/mL an Legionella pneumophila-Serogruppe 2 versetzt war, und zwei Proben mit verschiedenen Mengen an Legionella hackeliae (~1x10⁴ CFU/mL in Probe # 1815362 und ~1x10³ CFU/mL in Probe # 1815363). Probe # 1815361 enthielt neben humanem Zellmaterial lediglich E. coli.

Die relativ stark positive Probe # 1815364 mit ca. 1x10⁴ CFU/mL an Legionella pneumophila SG2 wurde dabei von von 120 der insgesamt 126 Teilnehmer korrekterweise als positiv befundet.

Auch die „richtig negative“ Probe # 1815361 (nur E. coli) wurde diesmal erfreulicherweise von nahezu allen Teilnehmern als negativ für Legionella pneumophila-DNA befundet. Lediglich ein Teilnehmer berichtete bei dieser Probe ein falsch-positives Ergebnis für L. pneumophila. Hier sollten mögliche laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. Kreuzkontaminationen während der individuellen Probenextraktion und -abarbeitung ggf. kontrolliert und bestmöglich korrigiert werden. Im Umkehrschluss sollten die 5 Teilnehmer, der die L. pneumophila positive Probe # 1815364 fälschlicherweise als negativ befundet haben, die analytische Sensitivität ihrer L. pneumophila-spezifischen PCR/NAT-Testsysteme und die entsprechenden Arbeitsabläufe zur Probenaufarbeitungs- und Template-DNA Präparation überprüfen.

Die beiden anderen Einzelproben des ausgesandten Sets, die diesmal mit unterschiedlichen Mengen an Legionella hackeliae (~1x10³ und ~1x10⁴ CFU/mL) versetzt waren, wurden ebenfalls von nahezu allen Teilnehmern mit ihren L. pneumophila-spezifischen PCR-/NAT-Testsystemen korrekt als negativ befundet. Hier berichteten nur 6 bzw. 5 der insgesamt 126 Teilnehmer ein falsch-positives Ergebnis für L. pneumophila DNA, was auf eine Kreuzreaktion bzw. mangelnde Speziesspezifität der Zielsequenz zurückzuführen sein dürfte. Vor allem in-house real-time PCR Protokolle mit ribosomalen Zielsequenzen zeigten in der Vergangenheit immer wieder Probleme bei der Speziesspezifität. Bei einer anzunehmenden sequenziellen Abarbeitung der 4 Einzelproben sollte zumindest diesmal die Wahrscheinlichkeit einer Verschleppung von L. pneumophila positivem Material aus der Probe 4 in Reaktionsansätze der Proben 1 bis 3 relativ gering sein.

Geeignete Inhibitionskontrollen wurden von 125 Teilnehmern durchgeführt und signifikante Inhibitionsereignisse wurden offenbar nicht beobachtet.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs kamen bei insgesamt 83 Teilnehmern kommerzielle NAT-Testsysteme für den Nachweis von L. pneumophila-DNA im Untersuchungsmaterial zum Einsatz. Signifikante Unterschiede bezüglich der analytischen Sensitivität zwischen kommerziellen und selbstentwickelten Testsystemen (von 45 Teilnehmern verwendet) fanden sich nicht. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Seegene Allplex Respiratory Panel 4 (8x), AmpliGnost L. pneumophila von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (6x), fast-track Diagnostics FTD Atypical CAP (5x), fast-track Diagnostics FTD Bacterial pneumonia CAP (3x), ARGENE Legio/Cc r-gene (4x), GeneProof L. pneumophila PCR Kit (4x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (3x), Biolegio Atypical Pneumonia-1 Assay (2x), Sacace Biotechnologies L. pneumophila Real-TM (2x), Mikrogen Diagenode Legionella (2x), Mikrogen ampliCube Respiratory Panel 1(1x), Gerbion diarella Legionella und PanLegionella real time PCR Kit TM (1x), Luminex NxTAG Respiratory Pathogen Panel (1x), PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x), Euroclone Duplica Real Time L. pneumophila Detection Kit (1x), Vircell Speed-oligo Legionella (1x), Ingenetix Bacto Real L. pneumophila (1x), BioMerieux real-time PCR R-gene Kit (1x), AnDiatec Quidel L. pneumophila (1x), ELITechGroup L. pneumophila Q-PCR Alert Amplimix (1x), AmpliSens Legionella FRT (1x) und VIASURE L. pneumophila Real Time PCR Detection (1x).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal drei positive Proben in einer Art Verdünnungsreihe. Eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1815371; Salmonella enterica ser. Typhi, ~5x10⁴ CFU/mL), eine mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1815374; Salmonella enterica ser. Typhi, ~5x10³ CFU/mL), sowie eine Probe mit etwa hundertfach geringerer Menge (#1815373; Salmonella enterica ser. Typhi, ~5x10² CFU/mL). Die vierte Probe des Sets (# 1815372) enthielt keine Zielorganismen sondern ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli.

Die Verfügbarkeit von spezifischen und mittlerweile gut evaluierten selbstentwickelten bzw. kommerziellen NAT-gestützten Analysesystemen führte diesmal bei 2 der 4 Proben des aktuellen Ringversuchssets zu tadellosen Richtigkeitsquoten von 100%. Vier von insgesamt 30 Teilnehmern berichteten ein falsch-negatives Ergebnis bei Probe #1815374, die ca. 5x10³ CFU/mL an Salmonellen enthielt. Bezüglich der analytischen Sensitivität wurde es erst bei Probe #1815373 (~5x10² CFU/mL) „interessant“. Nur mehr 17 der 30 Teilnehmer berichteten hier ein positives Ergebnis. Aufgrund der relativ geringen Menge an Salmonella enterica Zielorganismen in Probe #1815373 wurden die mitgeteilten Ergebnisse diesmal nicht in die Bewertung für die Zertifikate mit einbezogen. Dies ist durch die beiden grau schraffierten Felder in Tab. 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 11) gekennzeichnet.

Auch in vorausgegangenen Ringversuchen waren bei relativ niedrigen Erregerlasten immer wieder falsch-negative Ergebnisse berichtet worden, was im Einzelfall bzw. bei hohen Ansprüchen der jeweiligen Teilnehmer an die Sensitivität ihres individuellen PCR/NAT-gestützten Analyseverfahrens eine Überprüfung der eingesetzten Testsysteme nach sich ziehen sollte.

Da in der aktuellen Ringversuchsrunde keine falsch-positiven Befunde für die negative Probe #1815372 (unmittelbar nach der hochpositiven Probe innerhalb des Probensets) mitgeteilt wurden, deutet dies, im Vergleich zu manchen der vorhergehenden Ringversuchsrunden, auf eine verbesserte Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden diagnostischen Laboratorien hin. Inhibitionskontrollen wurden von allen Teilnehmern durchgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse wurden für keine der Proben berichtet. Kommerzielle Testsysteme kamen in 21 Fällen, selbstentwickelte Testsysteme in 9 Fällen zum Einsatz. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ von einem Teilnehmer die Verwendung des folgenden Kits aufgeführt: BD Max Enteric Bacterial Panel (4x), TIB Molbiol LightMix Modular (2x), fast-track Diagnostics (1x), Mikrogen Diagenode Gastroenteritis Bacteria Panel I (1x), Mikrogen ampliCube Gastroenteritis Bacteria Panel I (1x) und Seegene Allplex Gastrointestinal Panel Bacteria 2 Assay (1x).

In enger Abstimmung mit unserem Sollwert-Laboratorium (Dr. U. Busch, Dr. U. Messelhäußer, Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Oberschleißheim) werden wir weiterhin versuchen, ab und an ein etwas exotischeres Serovar von Salmonella enterica zu versenden und zumindest eine der 4 Proben mit einer relativ geringen Menge an Zielorganismen zu versetzen – auch wenn im Rahmen der gesetzlichen Vorschriften und/oder Richtlinien der einzelnen Fachgesellschaften derzeit noch keine genauen unteren Nachweisgrenzen für den NAT-gestützten Salmonellen-Nachweis festgelegt wurden.

Neben der wohl prominentesten Spezies Listeria monocytogenes sind auch eine Reihe weiterer Listerienspezies bekannt, für die inzwischen auch einige selbstentwickelte und kommerzielle NAT-gestützte Nachweisverfahren zur Verfügung stehen. Auch wenn diese Spezies (mit Ausnahme von L. ivanovii) zumeist nicht von humanpathogener Relevanz sind, werden wir uns bei der Konzeption des Probenmaterials für RV 538 vor allem zur Abprüfung der Spezifität individueller Testsysteme nicht nur auf L. monocytogenes beschränken. Daher werden, wie in dieser Ringversuchsrunde, auch andere Listerienspezies in der einen oder anderen Probe zu finden sein – so wie im Fall der Probe # 1815381, die diesmal ca. 5x10⁴ CFU/mL an Listeria ivanovii enthielt. Probe # 1815384 des aktuellen Sets enthielt eine relativ hohe Menge an L. monocytogenes (ca. 5x10³ CFU/mL), die erfreulicherweise von allen der insgesamt 42 Teilnehmer korrekt erfasst wurde. Erfreulicherweise wurden auch die Probe #1815382 und die Probe #1815383, welche ausschließlich humanes Zellmaterial und E. coli enthielten, von allen Laboratorien korrekterweise als „negativ“ befundet, was erneut für eine sehr gute Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden Laboratorien spricht.

Wie bereits in vorangegangenen Ringversuchsrunden wurden von den Teilnehmern ganz überwiegend Listeria monocytogenes-spezifische Testsysteme eingesetzt (n=38). Dies spiegelte sich in der Probe #1815381 wider, welche eine signifikante Menge an L. ivanovii (5x10⁴ CFU/mL) enthielt. Vier der insgesamt 42 Teilnehmer mit explizit Listeria spp.-spezifischen Testsystemen berichteten diese Probe korrekt als positiv. Im Umkehrschluß spricht diese Datenlage jedoch für eine erfreulich hohe Spezifität der eingesetzten L. monocytogenes-spezifischen Testsysteme. Bei diesem Ringversuch besteht nämlich explizit die Option einer differenzierten Befundmitteilung: hält ein Teilnehmer lediglich ein L. monocytogenes-spezifisches NAT-Verfahren vor, so kann er dies über den Zusatzcode [71] im Ergebnisfeld angeben, und für die Erstellung des individuellen Zertifikats seitens INSTAND e.V. werden dann auch nur die L. monocytogenes-spezifischen Ergebnisse zur Bewertung herangezogen.

Von allen 42 Teilnehmern wurden Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen verwendet. Vermeintliche Inhibitionsereignisse bei der Aufarbeitung und Analyse der Ringversuchsproben wurden nicht beobachtet.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Sacace Biotechnologies L. monocytogenes Real-TM (2x), fast-track Diagnostics Real Time Neonatal sepsis (2x), Liferiver L. monocytogenes Real Time PCR Kit (1x), VIASURE S. agalactiae, L. monocytogenes, E.coli Real Time PCR Detection (1x), Biolegio Meningitis Panel-1 (1x), Biomerieux BioFire FILMARRAY Meningitis/Encephalitis Panel (1x) und QIAGEN mericon Listeria spp Kit (1x).

Zuerst einmal, wie gehabt, eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für den Direktnachweis von MRSA-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise Nasen- oder Wundabstrichen) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen an entsprechenden Zielorganismen. Für interessierte Teilnehmer soll an dieser Stelle noch einmal explizit darauf hingewiesen werden, dass sich mit Testsystemen, die üblicherweise für die Kulturbestätigung von S. aureus und/oder MRSA ausgelegt sind, diese geringen Mengen nicht immer zuverlässig nachweisen lassen werden. Eine Teilnahme an diesem Ringversuch ist daher nur für solche diagnostischen Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von MRSA etabliert haben bzw. im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie an dieser Stelle bereits mehrfach thematisiert basieren einige der derzeit etablierten eigenentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum Direktnachweis von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial auf einer getrennten Erfassung von S. aureus-spezifischen Markern, Staphylokokkenspezies-spezifischen Markern und dem mecA-Gen in der entsprechenden Nukleinsäurepräparation. Da sowohl bei S. aureus als auch bei Koagulase-negativen Staphylokokken das mecA-Gen für die phänotypische Ausprägung einer Methicillin-Resistenz verantwortlich ist, ist die Aussagekraft dieser PCR-gestützten Testsysteme für den Direktnachweis von MRSA aus nativem Patientenmaterial eingeschränkt, wenn beim Patienten eine gleichzeitige Besiedelung mit S. aureus und Koagulase-negativen Staphylokokken (die als klinische Isolate zumeist mecA-positiv sind) vorliegt. Einen attraktiven Ansatzpunkt zur Lösung dieses Problems bieten sog. SCCmec-basierte PCR-Testkonzepte, die auf dem Nachweis der SCCmec-Kassette innerhalb eines für S. aureus charakteristischen Genbereiches beruhen und die relativ gut konservierte Integrationsstelle der SCCmec-Kassette im S. aureus-Genom als Zielsequenz verwenden.

Dass aber auch die SCCmec-basierten Testkonzepte gewisse Limitationen haben, konnte im Rahmen einiger früherer Ringversuche eindrucksvoll aufgezeigt werden: hier wurden bereits einige MRSA-Isolate mit selten vorkommenden SCCmec-Subtypen oder MSSA-Isolate mit einer an den jeweiligen Enden typischen SCCmec-Sequenz, aber mit einer natürlichen Deleti on des üblicherweise innerhalb der SCCmec-Kassette vorhandene mecA-Gens versandt. Auch wenn wir uns im Rahmen dieser Ringversuchsserie zum Ziel gesetzt haben primär die analytische Sensitivität und Spezifität (und somit die Routinetauglichkeit) der jeweils eingesetzten Testsysteme abzuprüfen, befand sich im aktuellen Ringversuch neben einer Mischung aus S. aureus und Koagulase-negativen Staphylokokken mit mecA-Gen und einem typischen CA-MRSA Patientenisolat aber auch wieder ein in unseren Breiten eher seltener vorkommender MRSA Stamm mit SCCmec-Kassette vom Typ V.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 13) der statistischen Auswertung dargestellt, enthielt die Probe # 1815394 diesmal ein Gemisch aus einem S. aureus-Isolat (cMSSA, PVL-positiv, ~1x10⁴ CFU/mL) und einer Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies (S. epidermidis; mecA-positiv, ~1x10⁴ CFU/mL), die Probe # 1815391 ein CA-MRSA-Patientenisolat (MRSA; PVL-positiv, ~1x10⁴ CFU/mL) und die Probe # 1815392 ein typisches MRSA-Patientenisolat (MRSA; PVL-negativ, ~5x10⁴ CFU/mL). Die letzte der 4 Proben, # 1815393, enthielt neben humanem Zellmaterial lediglich eine nennenswerte Menge an E. coli.

Erfreulicherweise wurden im aktuellen Ringversuch sowohl bei der positiven CA-MRSA Probe # 1815391 als auch bei der positiven MRSA Probe # 1815392 von nahezu allen der 304 Teilnehmer durchweg korrekt positive PCR/NAT-Ergebnisse mitgeteilt. Der technische oder methodische Hintergrund der jeweils 3 falsch-negativen Ergebnisse bei diesen beiden Proben ist seitens des Ringversuchsleiters nicht näher zu ergründen. Möglicherweise wurden PCR-Testsysteme mit unzureichender analytischer Sensitivität eingesetzt oder es ging während der Probenaufarbeitung ein gewisser Anteil der Template-DNA bei der DNA-Isolierung oder der Komplettierung der PCR-Ansätze verloren. Angesichts der mit 1x10⁴ bzw. 5x10⁴ CFU/mL ehrlicherweise nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollten falsch-negative Ergebnisse bei beiden MRSA-positiven Proben den betroffenen Ringversuchsteilnehmern durchaus Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihrer entsprechenden NAT-gestützten Testsysteme oder des Arbeitsablaufs im diagnostischen Labor geben.

Im Vergleich zu früheren Ringversuchen mit vergleichbaren Probenkonstellationen wurde bei der Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies in Probe # 1815394 diesmal eine erfreulicherweise hohe Richtigkeitsquote erzielt. Von 285 der insgesamt 307 Teilnehmer wurde dieses Gemisch mit den jeweils eingesetzten Testsystemen korrekt als „MRSA-negativ“ befundet, weitere 8 Teilnehmer haben ihr Ergebnis bei dieser Probe als „fraglich“ klassifiziert. Von 6 dieser 8 Teilnehmer mit fraglichem Befund wurde explizit die Verwendung eines PCR-Testsystems angegeben, das auf einer getrennten Erfassung von S. aureus-spezifischen Markern und dem mecA-Gen beruht. Da mit dieser Art von Testsystemen zwar die Anwesenheit des mecA-Gens nachgewiesen werden kann, dessen Herkunft aber nicht zweifelsfrei dem Genom der ebenfalls nachgewiesenen S. aureus und/oder der Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies zugeordnet werden kann, ist in diesem Fall „fraglich“ auch das wissenschaftlich korrekte Untersuchungsergebnis. Die restlichen Teilnehmer berichteten bei dieser Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies falsch-positive Ergebnisse für MRSA. Diesen 14 Teilnehmern mit falsch-positivem Ergebnis für Probe # 1815394 ist dringend anzuraten, ihre Testsysteme zu überprüfen bzw. die methodische Eignung ihres jeweiligen Testkonzepts zu hinterfragen. In der mikrobiologischen Praxis wird relativ häufig die gleichzeitige Anwesenheit einer Methicillin-resistenten (also mecA-positiven) Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies und eines Methicillin-empfindlichen (also mecA-negativen) S. aureus-Isolates in dem entsprechenden Abstrichmaterial beobachtet. In diesem Fall würden die Testsysteme der letztgenannten 14 Teilnehmer vermutlich fälschlicherweise einen Hinweis auf das Vorliegen einer MRSA-Infektion bzw. -Besiedelung anzeigen (mit allen hinlänglich bekannten Konsequenzen für den betroffenen Patienten!). Wenn man sich die entsprechenden Richtigkeitsquoten für Probe # 1815394 in Tab. 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 14) nach Testkonzepten differenziert betrachtet, dann wird schnell ersichtlich dass alle der derzeit etablierten SCCmec-basierten Testsysteme bei diesem Gemisch korrekterweise MRSA-negative Befunde liefern (da das S. aureus-Genom der MSSA-Komponente ja de facto keine SCCmec-Kassette mit integriertem mecA-Gen aufweist).

Insgesamt betrachtet spricht die Ergebnislage jedoch für eine hohe Zuverlässigkeit des NAT-gestützten Direktnachweises von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial. Auch diesmal scheinen die SCCmec-basierten Testkonzepte wieder einen gewissen analytischen Vorteil gegenüber Testsystemen mit einer getrennten Erfassung von speziesspezifischen Markern und dem mecA Gen zu besitzen.

Wie aber in einigen der vorhergegangenen Ringversuche bereits mehrfach diskutiert, haben auch die erstgenannten Testkonzepte gewisse Limitationen bei bestimmten (derzeit in unseren Breiten noch „exotischen“) Sequenzvarianten der SCCmec Kassetten oder bei ebenfalls derzeit noch sehr selten zu beobachtenden Varianten des Methicillin-Resistenzvermittelnden mec-Gens.

Dies wird im Rahmen des aktuellen Ringversuchs aber nicht thematisiert und die beiden MRSA-positiven Proben # 1815391 und # 1815392 enthielten „nur“ MRSA Isolate mit geographisch relativ prävalenten Genkonstellationen.

Bei der Probe # 1815393, die diesmal lediglich eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt, wurden im Rahmen des aktuellen Ringversuchs nur von zwei der 307 Teilnehmer falsch-positive MRSA Ergebnisse beobachtet sowie von einem Teilnehmer ein als „fraglich“ klassifiziertes Ergebnis mitgeteilt. Hier liegt (auch angesichts der sequenziellen Folge direkt nach der MRSA-positiven Probe # 1815392) das Auftreten eines sporadischen laborinternen Kontaminationsereignisses oder einer Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung nahe. Wie bereits mehrfach im Rahmen dieser ausführlichen Ringversuchsdiskussionen erwähnt, sind solche „Ausreißer“ bei technisch aufwändigen Ringversuchen mit über 300 Teilnehmern nichts Ungewöhnliches und bedürfen meines Erachtens keiner weiteren Diskussion.

Insgesamt bleibt festzuhalten, dass der erfreulich große Anteil von richtig-positiven Ergebnissen, bei der einen positiven Probe und die überwiegend richtig-negativen Befunde bei den 2 MRSA-negativen Proben, erneut für ein hervorragendes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminations- und Verschleppungsereignissen spricht.

Die Ergebnislage dieses Ringversuchs spricht also erneut für eine hohe Zuverlässigkeit der aktuell eingesetzten Verfahren zum PCR/NAT-gestützten Direktnachweises von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial. Für Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen interessiert sind, stehen mit den Proben dieses Ringversuchs wieder standardisierte Rückstellproben zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Optional wird im Rahmen unserer Ringversuchsreihe auch der molekulargenetische Nachweis des putativen Pathogenitätsfaktors PVL (Panton-Valentine-Leukozidin) bzw. dessen kodierende Gene lukF/S-PV abgefragt. Entsprechende (PVL-negative) Ergebnisse der molekularbiologischen PVL-Testung wurden von 50 der insgesamt 307 teilnehmenden Laboratorien mitgeteilt und mit Ausnahme eines Teilnehmers waren diese diesmal durchweg korrekt. Nähere Informationen zu der, nach wie vor hochaktuellen, cMRSA bzw. CA-MRSA Problematik finden sich beispielsweise unter: Linde HJ. und Lehn N [2], oder Witte, W. et al. [3]. Ein gut evaluiertes real-time PCR Protokoll für den gezielten Nachweis von PVL-positiven S. aureus-Isolaten findet sich beispielsweise in Reischl et al. (2007) [4]. Mittlerweile sind auch schon einige kommerzielle real-time PCR Testsysteme für den zuverlässigen molekulargenetischen Nachweis von PVL-Genen bei MRSA- und MSSA-Isolaten verfügbar (z.B. von r-biopharm oder von TIB Molbiol).

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: r-biopharm RIDAGENE PVL PCR (3x), HAIN Lifescience Genotype Staphylococcus (2x), Amplex eazyplex MRSA (2x), Diarella MRSA real time PCR Kit TM von Gerbion (2x), Cepheid Xpert MRSA NxG (1x), GeneProof MRSA PCR Kit (1x), VIASURE Methicillin Resistent S. aureus Real Time PCR Detection Kit (1x), VELA diagnostics Sentosa SA Direct MRSA Test (1x), Autoimmun Diagnostika Gen ID MRSA (1x), Q-Bioanalytic Kit (1x) und Immundiagnostik MutaPLEX MRSA (1x).

Eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Chlamydia pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von C. pneumoniae DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 15) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal eine Probe mit sehr hoher Menge an entsprechenden Zielorganismen (# 1815402; Chlamydia pneumoniae, ~5x10⁵ IFU/ml) und eine Probe mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1815404; Chlamydia pneumoniae, ~5x10⁴ IFU/ml), eine Probe mit ca. ~1x10⁵ CFU/ml an Legionella pneumophila (# 1815404), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1815403), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Wie bereits in den vorhergegangenen Ringversuchen zu beobachten war, so wird bei der Auswertung der Ergebnisse auch diesmal die hervorragende analytische Sensitivität und Spezifität der gegenwärtig eingesetzten und z.T. auch bereits sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesysteme für den Nachweis von C. pneumoniae DNA eindrucksvoll aufgezeigt. Aus den in der Tab. 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 15) aufgeführten Daten ist zu entnehmen, daß im aktuellen Ringversuch alle Teilnehmer die Zielorganismen in der relativ stark positiven Probe # 1815402 sicher und zuverlässig nachweisen konnten. Mit ca. 5x10⁴ IFU pro mL Probenmaterial enthielt die Probe # 1815401 diesmal eine etwa zehnfach geringere Menge an C. pneumoniae Zielorganismen. Erfreulicherweise wurde diese Probe dennoch von 138 der insgesamt 140 Teilnehmer zuverlässig als (richtig-) positiv befundet.

Bei der negativen Probe # 1815403 (nur E. coli) wurden von allen 140 Teilnehmern korrekt negative Ergebnisse berichtet.

Mit der Probe # 1815334, die mit einem anderen respiratorischen Pathogen (Legionella pneumophila; ~1x10⁵ CFU/mL) versetzt war, wurde im aktuellen Ringversuch zudem die analytische Spezifität der verwendeten Testsysteme überprüft. Hier wurden lediglich bei 3 der insgesamt 140 Teilnehmer falsch-positive PCR/NAT-Ergebnisse beobachtet. Kreuzreaktivitäten der Primer und Sonden von C. pneumoniae-spezifischen PCR Testsysteme mit L. pneumophila erscheinen aus molekularbiologischer Sicht wohl als eher unwahrscheinlich – vermutlich handelte es sich hier um „banale“ laborinterne Kontaminationsereignisse oder Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und sequenziellen Abarbeitung der Ringversuchsproben.

Bis auf einen Teilnehmer haben alle entweder kommerzielle oder selbstentwickelte (in-house) Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von C. pneumoniae DNA verwendet; eine signifikante Inhibition der PCR-Reaktion bei den vier versandten Proben innerhalb des aktuellen Ringversuchs wurde dabei von keinem der Teilnehmer beobachtet. Aufgrund des leider noch relativ geringen Anteils und der nicht durchgehenden Spezifizierung von kommerziellen Testsystemen innerhalb des Teilnehmerfeldes lassen sich derzeit keine seriösen Vergleiche zwischen bestimmten kommerziellen Kits und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität oder Kontaminationsanfälligkeit führen. Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs wurde von 16 Teilnehmern die Verwendung des TIB Molbiol LightMix C. pneumoniae Testsystems, von 8 Teilnehmern der Diagenode MP/CP Kit, von 6 Teilnehmern der kommerzielle AmpliGnost CP PCR Kit und von 4 Teilnehmern der Autoimmun Diagnostika CAP Bacteria Kit angegeben. Bis auf ein einzelnes falsch-negatives Ergebnis bei Verwendung des kommerzielle AmpliGnost CP PCR Kits konnten damit alle Teilnehmer durchwegs Richtigkeitsquoten von 100%, sowohl für die positiven als auch für die negativen Proben erzielen.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: GeneProof C. pneumoniae PCR Kit (9x), ARGENE Chla/Myco pneumo r-gene (7x), Seegene Allplex Respiratory Panel 4 (6x), Seegene Anyplex RB5 detection (1x), Ingenetix Bacto Real C. pneumoniae (1x), fast-track Diagnostics Atypical CAP Kit (6x), fast-track Diagnostics Respiratory (2x), fast-track Diagnostics Bacterial pneumonia CAP (1x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (3x), AmpliSens M. pneumoniae/C. pneumoniae (3x), Mikrogen ampliCube RBA (2x), Luminex NxTAG Respiratory Pathogen Panel (2x), Sacace Biotechnologies C. pneumoniae Real-TM (2x), Pneumonia für EASY-PLEX 384 System (1x), VIASURE C. pneumoniae, M. pneumoniae, L.pneumophila Real Time PCR Detection Kit (1x), r-Biopharm RIDAGENE C. pneumoniae (1x) und PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x).

Aufgrund zahlreicher Rückfragen von Teilnehmern der vergangenen Ringversuche hier eine wichtige Anmerkung vorab: der Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Mycoplasma pneumoniae ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Mycoplasma pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut, wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial, konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 16) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben: Probe # 1815413 mit einer hohen Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x10⁵ Genomkopien/mL), Probe # 1815411 mit einer etwa zehnfach geringeren Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x10⁴ Genomkopien/mL) und Probe # 1815414 mit einer etwa hundertfach geringeren Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x10³ Genomkopien/mL). Probe # 1815412 enthielt ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli. Bis auf zwei Teilnehmer, die ihre Befunde als „fraglich“ klassifizierten, konnten die 159 Teilnehmer die DNA von M. pneumoniae in den Proben # 1815411 und # 1815413 zuverlässig nachweisen.

Für die „negative“ Probe # 1815412 (nur E. coli) wurden durchwegs korrekt negative Ergebnisse berichtet.

Mit ca. 1x10³ Genomkopien/mL enthielt die Probe # 1815414 diesmal eine relativ geringe Menge an M. pneumoniae Zielorganismen. Erfreulicherweise wurde diese Probe dennoch von 128 der insgesamt 159 Teilnehmer zuverlässig als (richtig-) positiv befundet. Aufgrund der relativ geringen Menge an Zielorganismen wurden die mitgeteilten Ergebnisse diesmal nicht in die Bewertung für die Zertifikate mit einbezogen. Dies ist auch durch die beiden grau schraffierten Felder in Tab. 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 16) gekennzeichnet. Angesichts der mit 1x10³ Genomkopien/mL ehrlicherweise nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollten falsch-negative Ergebnisse bei Probe # 1815414 den betroffenen 28 Ringversuchsteilnehmern dennoch Anlaß zur Überprüfung und Optimierung ihres jeweiligen NAT-gestützten Testsystems geben. Denn aus vergleichbaren Proben der Ringversuche im November 2011 und November 2016 mit einer Menge von 5x10³ bzw. 1x10³ Genomkopien/mL an M. pneumoniae im Probenmaterial (die damals noch von über 95% der Teilnehmer erfolgreich detektiert werden konnten) wird deutlich daß die untere Nachweisgrenze der gegenwärtig eingesetzten und z.T. auch bereits sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesystemen für den Nachweis von M. pneumoniae DNA wohl eher bei 10² als bei 10³ Genomkopien/mL an M. pneumoniae angesiedelt ist.

Inhibitionskontrollen wurden von 157 der 159 Teilnehmer mitgeführt, für keine der ausgesandten Proben wurden Inhibitionsereignisse berichtet. Zusammenfassend läßt sich auch diesmal feststellen, dass wie bereits in vorausgegangenen Ringversuchsrunden die PCR-/NAT-gestützte Diagnostik von Mycoplasma pneumoniae in vielen Labors robust und zuverlässig implementiert ist. Dieses positive Zwischenfazit sollte jedoch nicht zum Anlass genommen werden, die Anstrengungen zu reduzieren!

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs wurde von 103 Teilnehmern die Verwendung von kommerziellen Testkits aufgeführt: LightMix M. pneumoniae [n=16], AID CAP Bacteria [n=4], Minerva Venor Mp [n=1], AmpliGnost MP PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe [n=5], Diagenode MP/CP [n=9], r-Biopharm RIDAGENE Mp [n=6], GeneProof M. pneumoniae [n=8], sowie „andere kommerzielle Testsysteme“ [n=54].

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: ARGENE Ch/Myc. pneumoniae r-gene Kit (8x), Seegene Allplex Respiratory Panel 4 (7x), Seegene Anyplex RB5 detection (1x), AmpliSens M. pneumoniae/C. pneumoniae-FRP PCR Kit (5x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (3x), Luminex NxTAG Respiratory Pathogen Panel (2x), Mikrogen ampliCube Respiratory Panel 1(2x), fast-track Diagnostics Atypical CAP Kit (5x), fast-track Diagnostics Respiratory pathogens 21 (2x), fast-track Diagnostics Bacterial pneumonia CAP (2x), fast-track Diagnostics (2x), Sacace Biotechnologies M. pneumoniae/C. pneumoniae Real-TM (2x), PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x), Meridian Bioscience illumigene (1x), Euroclone Duplica Real Time M. pneumoniae Detection Kit (1x), Sartorius Microsart ATMP Mycoplasma (1x), BioFire FILMARRAY Resp. Panel (1x), VIASURE C. pneumoniae, M. pneumoniae, L.pneumophila Real Time PCR Detection Kit (1x) und Ingenetix Bacto Real Mycoplasma pneumoniae (1x).

Auch hier wieder eine Anmerkung vorweg: Der kombinierte Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Coxiella burnetii & Bacillus anthracis ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Coxiella burnetii- und Bacillus anthracis-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben (Tab. 1, Anhang 1 [Anh. 1], S. 18) enthielt zwei Proben mit verschiedenen Mengen an C. burnetii (~1x10⁵ Genomkopien/mL in Probe # 1815424 und ~1x10³ Genomkopien/mL in Probe # 1815423), zwei Proben mit verschiedenen Mengen an DNA des Bacillus anthracis UR-1 Isolats (~1x10⁵ Genomkopien/mL in Probe # 1815421 und ~1x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 1815423), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1815422), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Der Übersichtlichkeit halber haben wir uns bei diesem kombinierten Ringversuch entschlossen, die Ergebnislage für die beiden unterschiedlichen Erreger auch in zwei getrennten Tabellen darzustellen: für C. burnetii in den Tabellen 2 und 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 18) sowie für B. anthracis in den Tabellen 4 und 5 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 19). Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Altona diagnostics RealStar Anthrax PCR Kit (2x), Progenie RealCycler C. burnetii (1x), VIASURE Tick Borne Diseases Real Time PCR Detection Kit (1x), Mikrogen alphaCube Q-Fiebers (1x), Molzym UMD (1x) und Life Technologies LSI VetMAX Absolute quant. C. burnetii (1x).

Coxiella burnetii: Wie bereits im vorausgegangenen Ringversuch gestaltet sich auch in der aktuellen Runde die Ergebnislage erfreulich. Die etwas stärker positive Probe # 1815424 (mit ca. 1x10⁵ Genomkopien C. burnetii/mL) wurde von allen der insgesamt 44 Teilnehmern mit ihren jeweiligen C. burnetii-spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert. Die zweite positive Probe # 1815423 des Probesets (ca. 1x10³ Genomkopien/mL von C. burnetii) wurde von 42 Labors korrekt berichtet, hier sind allerdings zwei falsch-negative Ergebnisse zu registrieren. Dies sollte in den betroffenen Labors zum Anlass genommen werden, die Performance des verwendeten Testsystems zu hinterfragen und die Prozesse der Probenaufarbeitung ggfs. zu optimieren. Die beiden Proben ohne Zielorganismus (# 1815421 und # 1815422 wurden erfreulicherweise von allen Teilnehmern korrekt als „negativ“ gewertet.

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von C. burnetii-DNA der Teilnehmer enthielten durchwegs eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Relevante Inhibitionsereignisse wurden nicht beobachtet.

Bacillus anthracis: Die Ergebnislage des Ringversuchs „Bacillus anthracis-DNA“ ist ebenfalls relativ schnell dargestellt. Alle 25 Teilnehmer konnten die stärker positive Probe # 1815421 richtig klassifizieren. Die etwas schwächer positive Probe # 1815423 wurde von 23 Labors richtig bewertet, 2 Labors reichten ein ‚fragliches‘ Ergebnis ein. Ein weiteres ‚fragliches‘ Ergebnis wurde für eine der beiden Proben ohne Zielorganismus berichtet (# 1815422). Betrachtet man die Konsequenzen solcher Ergebnisse für die Therapie und das Management von Patienten (und die Auswirkungen auf das Umfeld!), so sollte dies zum Anlass genommen werden, die Performance des verwendeten Testsystems sowie die Prozesse der Probenaufarbeitung zu überprüfen. Wie immer stehen nach erfolgreichem Abschluss der aktuellen Ringversuchsrunde den Kolleginnen und Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen für C. burnetii DNA und B. anthracis DNA interessiert sind, mit den Proben dieses Ringversuchs auch gewissermaßen „standardisierte Rückstellproben“ zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Francisella tularensis & Brucella spp.“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Francisella tularensis-DNA und Brucella spp. DNA aus geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben (Tab. 1, Anhang 1 [Anh. 1], S. 20) enthielt zwei Proben mit verschiedenen Mengen an F. tularensis subsp. tularensis DNA (~1x10⁵ CFU/mL in Probe # 1815432 und ~1x10⁴ CFU/mL in Probe # 1815434), zwei Proben mit verschiedenen Mengen an Brucella melitensis DNA (~1x10⁵ CFU/mL in Probe # 1815431 und ~1x10⁴ CFU/mL in Probe # 1815434), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1815433), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Francisella tularensis: Ähnlich wie bei vorausgehenden Ringversuchen haben auch hier fast alle der 27 Teilnehmer die relativ stark positive Probe # 1815432 (F. tularensis spp. tularensis, ~1x10⁵ CFU/mL) und # 1815424 (F. tularensis spp. tularensis, ~1x10⁴ CFU/mL) korrekt bewertet. Die F. tularensis-negativen Proben # 1815431 und # 1815433 wurden mit jeweils einer Ausnahme von den Teilnehmern als negativ befundet. Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von F. tularensis-DNA der Teilnehmer enthielten alle eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet. Einer der 27 Teilnehmer hat die F. tularensis PCR-Befunde bei allen 4 ausgesandten Proben als „fraglich“ klassifiziert. Aus nachvollziehbaren Gründen konnte hier leider kein Zertifikat erteilt werden…

Brucella spp: 23 bzw. 22 der 24 teilnehmenden Labors berichteten für die ‚positiven’ Proben # 1815431 und # 1815434 korrekte Ergebnisse. Ähnlich Richtigkeitsquoten fanden sich für die beiden Proben ohne Zielorganismen (#1815432 und # 1815433). Falsch-negative oder fragliche Ergebnisse sollten zum Anlass genommen werden, die Performance des verwendeten Testsystems und die laborinternen Prozesse der Probenaufarbeitung zu überprüfen.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Molzym UMD (1x).

Der seit 2015 in das reguläre Ringversuchsprogramm von INSTAND e.V. aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Carbapenemase-Gene“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zur molekularen Resistenztestung bzw. dem Direktnachweis von charakteristischen Carbapenemase-Genen aus DNA-Präparationen von Reinkulturen an Enterobacteriaceae konzipiert. Zum orientierenden Herantasten an die technische Eignung und die „Praktikabilität“ der versandten Probenmaterialien werden wir uns in den ersten Runden dieses methodisch anspruchsvollen Ringversuchs zur molekularen Resistenztestung auf die Abprüfung eines kleinen Spektrum der derzeit häufigsten Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae beschränken: KPC, VIM, OXA-48 ähnliche Gene, GES-Carbapenemasen, NDM, IMP und GIM. Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 22) der Auswertung dargestellt, enthielt das aktuelle Set vier Proben mit Carbapenem-resistenten Enterobacteriaceae: Probe # 1815441 enthielt Klebsiella pneumoniae-Zielorganismen mit dem OXA-181 Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL), Probe # 1815442 enthielt Escherichia coli Zielorganismen mit dem NDM-5 Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL), Probe # 1815443 enthielt Klebsiella pneumoniae Zielorganismen mit dem IMP-1 Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL) und Probe # 1815444 enthielt Klebsiella pneumoniae Zielorganismen mit dem KPC-2 Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL).

85 der 88 Teilnehmer stellten erfreulicherweise ein Carbapenemase-Gen in der Probe # 1815441 fest. Für die Probe mit KPC-2 positiver Klebsiella pneumoniae (# 1815444) wurden mit einer Ausnahme korrekte Ergebnisse berichtet. Hoch lag die Richtigkeitsquote auch für die Probe # 1815442, hier berichteten 86 Teilnehmer die Probe als „Carbapenemase-positiv“. Schwächen zeigten sich bei der Detektion der IMP-1-positiven Klebsiella pneumoniae in Probe # 1815443, die 17 Teilnehmern ‚durchrutschte‘. Grund hierfür ist möglicherweise, dass das IMP-1 Gen gerade in einigen ‚Multiplex‘ Testformaten nicht enthalten ist.

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Direktnachweis von Carbapenemase-Genen Teilnehmer enthielten durchwegs eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Autoimmun Diagnostika Gen ID Carbapenemase (2x), AmpliGnost Carbapenemase PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), Seegene Allplex Entero-DR Assay (1x) und AmpliSens^® PCR Kit (1x).

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Clostridium difficile“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Clostridium difficile-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 23) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben zwei positive Proben: Probe # 1815451 mit einen hoher Menge an Clostridium difficile, (~1x10⁵ CFU/mL), Probe # 1815452 mit ca. zehnfach geringerer Menge (~1x10⁴ CFU/mL ) sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 1815453 und # 1815454), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Die beiden „positiven“ Clostridium difficile Proben # 1815451 und # 1815452 wurden erfreulicherweise von allen 154 teilnehmenden Laboratorien korrekt als „positiv“ klassifiziert. Die vereinzelt berichteten ‚fraglichen‘ Ergebnisse für die Proben ohne Zielorganismen (# 1815453 und # 1815454) sollten zum Anlass genommen werden, das verwendete Testsystem bzgl. analytischer Sensitivität und Spezifität zu evaluieren und auch die laborinternen Prozesse der Probenaufbereitung und -abarbeitung kritisch zu hinterfragen. Wie in Tab. 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 23) angegeben, verwendete der Großteil der Teilnehmer kommerzielle Testsysteme.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Altona diagnostic RealStar C. difficile PCR Kit (7x), Meridian Bioscience illumigene C. difficile (6x), r-Biopharm RIDAGENE CD Toxin A/B (6x), r-Biopharm RIDAGENE Hospital Stool Panel (2x), HAIN Lifescience GenoType CDiff (6x), HAIN Lifescience FluoroType CDiff (1x), AmpliGnost C. difficile Toxin A und B von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (2x),Seegene Allplex GI Bacteria Assay (2x), TIB Molbiol Modular Dx Kit (1x), Cobas Liat C. diff (1x), fast-track Diagnostics C. difficile (1x), Amplex eazyplex C. difficile complete Assay (1x) und QUIDEL AmpliVue C. difficile Assay (1x).

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Vancomycin-resistente Enerokokken“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an DNA Vancomycin-resistenter Enterokokken aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 24) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben zwei positive Proben: Probe # 1815463 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (Enterococcus faecium van A resistent, ~1x10⁵ CFU/mL), Probe # 1815462 mit einer etwa zehnfach geringeren Menge (Enterococcus faecium van B resistent, ~1x10⁴ CFU/mL) und Probe # 1815461 mit ca. ~1x10⁵ CFU/mL an Enterococcus faecalis. Im Ringversuchsprobenset befand sich zudem eine Probe ohne Zielorganismen (# 1815464), die nur humane Zellen und E. coli enthielt.

Erfreulicherweise wurden die beiden „positiven“ Proben mit vanA bzw. vanB tragenden Enterococcus faecalis und E. faecium (# 1815463 und # 1815462) mit keiner bzw. 3 Ausnahmen von allen Teilnehmern als „VRE-positiv“ klassifiziert. Das heißt aber auch, immerhin 3 falsch-negative Ergebnisse wurden für den vanB-tragenden E. faecium Stamm (# 1815462) eingereicht. Im Falle einer Infektion mit dem Erreger kommt dem korrekten Nachweis einer Vancomycin-Resistenz natürlich eine hohe Bedeutung zu. Wie bereits im vorangegangenen Ringversuch waren alle eingereichten vanA/vanB Differenzierungen korrekt. Von den ‚negativen‘ Proben wurde # 1815464 von allen Teilnehmern korrekt klassifiziert, während für die Probe # 1815462 zwei falsch-positive Befunde zu verzeichnen waren. Bei den eingesetzten Testsystemen zeigt sich in den letzten Jahren ein Trend hin zu kommerziell erhältlichen, vorkonfektionierten Systemen. Unterschiede in Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu in-house Assays waren jedoch nicht zu erkennen.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: GeneProof VRE PCR Kit (2x), BioGX auf BD Max (1x), Roche LightCycler VRE Detection Kit (1x), Amplex eazyplex VRE (1x), AmpliGnost Vancomycin A/B Resistenz differenz. von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x) und VIASURE Vancomicin Resistente Real Time PCR Detection Kit (1x).

Nach intensiven Vorarbeiten zum Proben-Design und zur praktischen Umsetzung wird der aktuell als sogenannter „Pilot“ organisierte Ringversuch RV 547 „Urogenital-Panel“ in der aktuellen Ringversuchsrunde erstmalig durchgeführt und die Ergebniskonstellation hier diskutiert. Nicht zuletzt durch das überaus heterogene Spektrum an eingesetzten Testsystemen wurde die strukturierte Auswertung der auf den Report-Formularen mitgeteilten Ergebnisse erschwert. Daher haben wir die Tab. 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 25) etwas modifiziert. Dort ist der Übersicht halber nun die Anzahl an positiven und negativen Ergebnissen für die in den jeweiligen Proben anwesenden Pathogene aufgeführt. Mit dieser Lösung sollte man eine einigermaßen informative Darstellung über das erfasste Erregerspektrum und über die Leistungsdaten einzelner Testsysteme erhalten.

Im Großen und Ganzen haben die 19 aktuell registrierten Teilnehmer die Erreger in den 4 Einzelproben entsprechend den methodischen Möglichkeiten ihrer Testsysteme zufriedenstellend nachweisen können. Dies spricht zum einen für die Praktikabilität unseres innovativen Multiplex-Ringversuchskonzepts und zum anderen für die zuverlässige Erfassung der Zielorganismen innerhalb der jeweils testspezifisch abgedeckten Erregerspektren der eingesetzten kommerziellen oder eigenentwickelten PCR/NAT Verfahren.

Wir werden jedoch für die kommenden Aussendungen des RV 547 ein einfaches Schema in Form einer 7-stelligen Zahlenkombination entwickeln, über das die einzelnen Teilnehmer das erfasste Erregerspektrum ihrer individuellen Testsysteme und Multiplex-Assays auf dem Report-Formular vorab mitteilen können. Für die Erteilung von Zertifikaten macht es nachvollziehbarerweise nur Sinn diejenigen Parameter zu bewerten und zu testieren, die von den individuellen Teilnehmern im Rahmen ihres diagnostischen Workflows prinzipiell auch als positiv bzw. negativ erfasst werden können.

Unter Code [20] „Multiplex Kit“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Seegene Allplex STI Essential Assay (2x), Seegene Allplex Genital ulcer Assay (1x) und Seegene Anyplex STI-7 Detection (1x).

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars (zusätzliche oder alternative Angabe) die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: r-Biopharm RIDAGENE STI Mycoplasma panel (3x), r-Biopharm RIDAGENE T. vaginalis RT PCR Kit (2x), fast-track Diagnostics Urethritis plus (3x), BIORON RealLine single und multiplex Kits (1x) und AmpliSens C. trachomatis, Ureaplasma, M. genitalium und M. hominis (1x).

Dieser im Jahr 2013 neu in unser Ringversuchsprogramm aufgenommene Ringversuch RV 560 „Pilzgenomnachweis PCR/NAT Pneumocystis jirovecii“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis von Pneumocystis jirovecii-DNA in geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Zum orientierenden Herantasten an die unteren Nachweisgrenzen der im Anwenderkreis etablierten PCR/NAT-gestützten Testsysteme enthielt das aktuelle Set drei positive Proben (siehe Tab. 1 Anhang 1 [Anh. 1], S. 26): eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1815601; Pneumocystis jirovecii, ca. 1x10⁵ Organismen/mL), eine Probe mit ca. zehnfach geringerer Menge (# 1815602; Pneumocystis jirovecii, ca. 1x10⁴ Organismen/mL), eine Probe mit ca. hundertfach geringerer Menge (# 1815603; Pneumocystis jirovecii, ca. 1x10³ Organismen/mL), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1815604) aber mit E. coli und einer Suspension aus humanen Zellen.

Die „negative“ Probe # 1815604 wurde mit 2 Ausnahmen von den Teilnehmern korrekt als negativ für den Zielorganismus gewertet, lediglich 1 falsch-positives Ergebnis wurde berichtet. Der betroffene Teilnehmer sollten ggfs. die laborinterne Testdurchführung und die Performance des verwendeten Testsystems überprüfen. Im Vergleich zur vorausgegangenen Ringversuchsrunde kann jedoch insgesamt ein weiterer Rückgang falsch-positiver oder fraglicher Befunde festgestellt werden. Bei den „positiven“ Proben wurde Probe # 1815601 mit ~1x10⁵ Organismen/mL von 104 der 105 Teilnehmer richtig klassifiziert. Die schwächer positive Probe # 1615602 (ca. 1x10⁴ Organismen/mL) wurde von 103 Teilnehmern korrekt als „positiv“ gewertet. Für die Probe mit dem geringsten Gehalt an Zielorganismus (# 1815603, ca. 1x10³ Organismen/mL an Pneumocystis jirovecii) berichteten 23 Labors falsch-negative Ergebnisse. Zugegebenermaßen ist die in der Probe vorhandene DNA Menge des Zielorganismus gering, sodass die eingereichten ‚negativen‘ Ergebnisse dieser Probe nicht als falsch gewertet werden. Inhibitionskontrollen wurden von allen 105 Teilnehmern durchgeführt, Inhibitionsereignisse wurden nicht berichtet.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [26] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Altona diagnostics RealStar P. jirovecii PCR Kit (7x), fast-track Diagnostics P. jirovecii PCR Kit (5x), Biolegio Atypical Pneumonia-1 Assay (2x), BioGX P. jirovecci (1x), AmpliSens P. jirovecii FRT (1x), Genetrac P. jirovecii DNA Detection Kit (1x) und VIASURE P. jirovecii Real Time PCR Detection (1x).