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Nach erfolgreicher Etablierung dieser neuen Ringversuchs-Serie wollen wir hier auch für Kolleginnen und Kollegen, die bisher noch nicht an diesen Ringversuchen teilgenommen haben, die Ergebnisse der aktuellen Ringversuche für den PCR/NAT-gestützten Nachweis von Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, EHEC/STEC, Borrelia burgdorferi sensu lato, Legionella pneumophila, Salmonella enterica und Listeria spp., MRSA bzw. cMRSA, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetti, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Pneumocystis jirovecii (vorm. P. carinii) und der molekularen Resistenztestung für Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae sowie die beiden vor kurzem neu ins Programm aufgenommenen Ringversuche zum PCR/NAT-gestützten Nachweis von Clostridium difficile (Toxingene) und VRE (Vancomycin-resistente Enterokokken) darstellen und kurz diskutieren.

Für nähere Informationen über die Zusammensetzung der Ringversuchsproben, dem Sinn und Zweck dieser neuen Möglichkeit zur externen Qualitätskontrolle im Umfeld der Nukleinsäurediagnostik sowie zu den Eckdaten unseres flexiblen Ringversuchskonzepts sei hier auf unsere initiale Veröffentlichung in der Zeitschrift „Der Mikrobiologe“ verwiesen [1]. Gerne werden wir hier auch weiterhin in regelmäßigen Abständen und in ähnlicher Form über die Ergebnislage, Auswertung und Analyse unser zukünftigen Ringversuche berichten.

Wie bei allen anderen Ringversuchen erfolgt die Anmeldung zu ausgewählten Teilen der Reihe „Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis (PCR/NAT)“ über die Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in Medizinischen Laboratorien (INSTAND e.V.), Düsseldorf (https://www.instand-ev.de/). Nach Abschluss des jeweiligen Ringversuchs werden die Ergebnisse der einzelnen Teilnehmer dort zentral erfasst und anhand von individuellen Bewertungskriterien werden die schriftlichen Zertifikate erstellt. Zusätzlich stehen für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe weiterer Informationen auch im Internet unter „http://www.udo-reischl.de“, Unterpunkt „INSTAND-Ringversuche (PCR/NAT)“, sowie auf der Homepage von INSTAND e.V. als pdf-Files zum freien Download bereit.

Neben der Aussendung von lyophilisierten Probenmaterialien zur systematischen Abprüfung von NAT-gestützten Testsystemen für derzeit 18 unterschiedliche bakterielle und fungale Zielorganismen bzw. Pathogenitätsfaktoren gab es im Rahmen dieser Ringversuchsrunde natürlich auch wieder gewisse „Highlights“.

So wurde im aktuellen RV 530 Chlamydia trachomatis & Neisseria gonorrhoeae beispielsweise eine Probe mit relativ hohen Mengen sowohl an C. trachomatis- als auch an N. gonorrhoae-Zielorganismen versandt. Interessanterweise konnten einige kommerzielle und in-house PCR-Testsysteme hier nur die DNA von C. trachomatis im Gemisch zuverlässig nachweisen und beobachteten für N. gonorrhoeae DNA-Inhibition bzw. einen Ausfall der entsprechenden testspezifischen Inhibitionskontrollen.

Innerhalb der aktuellen Ringversuchsrunde wurde in einer der 4 Einzelproben des RV 539 MRSA/cMRSA erneut eine Mischung aus einem Methicillin-empfindlichen S. aureus-Isolat (MSSA) und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies ausgesandt, das methodenbedingt bei einem Teil der aktuell eingesetzten PCR/NAT-Testsysteme zu falsch-positiven MRSA-Ergebnissen führte. In der mikrobiologischen Praxis der PCR/NAT-gestützten MRSA-Direktnachweisverfahren wird relativ häufig die gleichzeitige Anwesenheit einer Methicillin-resistenten (also mecA-positiven) Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies und eines Methicillin-empfindlichen (also mecA-negativen) S. aureus-Isolates in dem entsprechenden Abstrichmaterial beobachtet. Obwohl bei dieser Probe, im Vergleich zu früheren Ringversuchen mit ähnlicher Probenkonstellation, diesmal erfreulicherweise eine etwas höhere Richtigkeitsquote erzielt werden konnte, bestätigt die Beobachtung von knapp 7% falsch-positiven MRSA-Ergebnissen erneut die Sinnhaftigkeit und auch Notwendigkeit des im Rahmen der PCR/NAT-Ringversuchsdiskussionen bereits mehrfach thematisierten begleitenden kulturellen Nachweises von MRSA. Denn selbst diejenigen Anwender, die mit ihren PCR-Testsystemen alle Proben des aktuellen MRSA-Ringversuchs zuverlässig detektieren und korrekt befunden konnten, sollten sich aufgrund der bekannten Vielfalt und der Dynamik von „exotischeren“ SCCmec-Kassettentypen (oder dem Auftreten von mecA-Gen-negativen aber dafür mecC-Gen-tragenden MRSA-Isolaten) nie wirklich sicher sein, dass sie auch zukünftig alle der zirkulierenden Varianten problemlos und zuverlässig erfassen.

Interessant war auch die Ergebniskonstellation des EHEC/STEC-Panels im RV 534. Hier wurden neben einem „normalen“ O157-Isolats auch zwei weitere EHEC-Isolate mit etwas selteneren Shiga-Toxin-Genvarianten, stx_2f bzw. stx_2d, ausgesandt und dabei innerhalb aller Teilnehmer lediglich Richtigkeitsquoten von 55 bzw. 80% erzielt. Aus wissenschaftlicher Sicht ist bei den üblicherweise eingesetzten PCR/NAT-Testsystemen eine „diagnostische Lücke“ allenfalls für stx_2f aufgrund der deutlich von den anderen Shiga-Toxin-Genen abweichenden Gensequenz zu erwarten. Bei der stx_2d-positiven EHEC-Probe aus dem aktuellen Set scheint mit ca. 5x10³ CFU/mL die untere Nachweisgrenze einiger Testsysteme und deren diagnostischer Workflows bereits erreicht bzw. bereits leicht unterschritten zu sein.

Mit der Auswahl eines etwas breiteren Spektrums von relevanten Carbapenemase-Genen bestätigte sich im Rahmen des Ringversuchs RV 544 Carbapenemase-Gene erneut die Vermutung, dass viele der derzeit verwendeten kommerziellen sowie in-house Testsysteme zur molekularen Carbapenemase-Detektion auch zum aktuellen Zeitpunkt noch gewisse Lücken hinsichtlich der Abdeckung von unterschiedlichen Carbapenemase-Genen aufweisen. Im aktuellen Ringversuch scheint dies insbesondere für das Enterobacter cloacae-Isolat mit der NDM-7 Carbapenemase zu gelten. Im Umfeld der molekularen Testung von Carbapenemase-Genen unterstützt uns ja Frau Dr. Agnes Anders vom Nationalen Referenzzentrum für gramnegative Krankenhauserreger in Bochum dankenswerterweise bei der Auswahl von relevanten aber auch „interessanten“ klinischen Isolaten.

Alle Teilnehmer sind natürlich weiterhin dazu aufgerufen, attraktive Parameter für eine zukünftige Erweiterung des Spektrums an Zielorganismen vorzuschlagen und deren mögliche Umsetzung mit dem Ringversuchsleiter zu diskutieren.

Aktueller Hinweis zu zwei neuen Pilot-Ringversuchen: wie bereits bei der Ringversuchsauswertung vom Juni dieses Jahres angekündigt, werden wir den mehrfach vorgetragenen Wünschen aus dem Teilnehmer- und Kollegenkreis nachkommen und ab Mai 2018 zwei zusätzliche Ringversuche in Form von sog. Pilot-Ringversuchen anbieten. Nach (hoffentlich) erfolgreichem Abschluss der beiden Probe-Ringversuchsrunden im Mai und November 2018 werden diese Ringversuche dann ab 2019 ins reguläre Ringversuchsprogramm von INSTAND e.V. übernommen:

• Der aktuelle Ringversuch RV 543: Francisella tularensis wird zukünftig als kombinierter Ringversuch um den Zielorganismus Brucella spp. erweitert.
• Für die externe Qualitätssicherung zukünftig kommerziell verfügbarer (und damit auch vermehrt eingesetzten) PCR/NAT-gestützten Nachweisverfahren für Urogenital-Infektionen haben wir inzwischen ein Ringversuchskonzept etabliert, das jeweils einige der nachfolgenden Erreger in unterschiedlichen Kombinationen und Mengen innerhalb des 4er-Panels enthalten wird.

RV 547 „Uro-Panel“ zum Nachweis von:

Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis und ggf. Treponema pallidum.

Hier noch ein paar Reflexionen des Ringversuchsleiters, die er sich nach der statistischen und fachlichen Auswertung der aktuellen Ringversuchsrunde wieder mal nicht verkneifen konnte: viele der seriösen Diagnostikhersteller geben sich größte Mühe bei der Testentwicklung und klinischen Evaluierung – und sind dann (zurecht) stolz auf die Leistungsdaten ihrer modernen PCR/NAT-Assays. Auffällig bei vielen der aktuellen, aber auch bei einigen der früheren Ringversuche ist das unterschiedlich gute Abschneiden von Teilnehmern mit ein und demselben kommerziellen, vorkonfektionierten und teilweise auch automatisierten und/oder kartuschenartig geschlossenen Testsystemen. Die meisten dieser Assays sind zudem auch noch IVD zertifiziert – mit allen aufwändigen herstellerseitigen Vorkehrungen zur „zuverlässigen“ Durchführung und standardisierten Ergebnisinterpretation. Die auffällige „Streuung der Performance“ (bzw. das Auftreten einzelner Ausreißer) unterstreicht aus Sicht des Ringversuchsleiters umso mehr die Bedeutung der Qualitätsstandards, wie beispielsweise das regelmäßige Mitführen von geeigneten Extraktions-, Positiv- und Negativ-Kontrollen sowie Schulungen und kontrollierte Maßnahmen zur Vermeidung von exogenen Kontaminationsmöglichkeiten in PCR/NAT-Arbeitsbereichen, die u.a. im Rahmen der aktuellen RiLiBÄK, der Akkreditierung und der praxisorientiert verfassten MIQ-1 gefordert werden. Deren Sinnhaftigkeit und Stringenz mag aus Anwendersicht ja gelegentlich bezweifelt werden, wird aber in diesen Ringversuchsrunden (sozusagen von neutraler Warte aus) dennoch immer wieder aufs Neue bestätigt. Vielleicht lohnt es sich unter diesen Gesichtspunkten doch wieder mal ein Blick in die MIQ-1 oder die RiLiBÄK um hier und dort noch ungenutztes Potential auszuschöpfen…

Maximale diagnostische Sicherheit sollte doch unser aller Prämisse sein und das unnötige bzw. fahrlässige Generieren von falsch-negativen oder falsch-positiven Befunden (und vor allem deren Folgen für die betroffenen Patienten) sind durch keine methodischen oder ökonomischen Ausflüchte zu entschuldigen!

Also „nix für ungut“ liebe Kolleginnen und Kollegen, wie der Bayer so schön sagt ;-)

Und gestatten Sie mir noch eine kleine Anmerkung in eigener Sache: neben den überaus motivierten und engagierten Mitarbeitern der ausgewählten Sollwert-Laboratorien unterstützen uns bei der Konzeption und Auswertung der zahlreichen Ringversuche zum Bakterien- und Pilzgenomnachweis PCR/NAT noch Kolleginnen und Kollegen aus unserem Hause. Herr PD Dr. Dr. Martin Ehrenschwender fungiert seit August 2017 nun auch formell als stellvertretender Ringversuchsleiter für die Ringversuche zum Bakterien- und Pilzgenomnachweis (PCR/NAT). Allerherzlichsten Dank für ihre spontane Bereitschaft sowie ihr ehrenamtliches Engagement für unsere gemeinsamen Bemühungen zur externen Qualitätssicherung molekularbiologischer Nachweisverfahren in der infektiologischen Diagnostik.

Entsprechend des Grundgedankens unserer Ringversuchsaktivitäten wurde auch bei der Konzeption des aktuellen Ringversuchs zum „Bakteriengenomnachweis mittels PCR oder anderer Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT)“ bei einigen Zielorganismen der Versand von Proben mit relativ niedrigen Erregerzahlen angestrebt.

In den aktuellen Ringversuchssets befanden sich daher erneut einige Proben mit relativ geringer Menge folgender Zielorganismen: Neisseria gonorrhoeae (Probe # 1725304), Bordetella pertussis (Probe # 1725324), Borrelia afzelii (Probe # 1725351), EHEC (Probe # 1725344), Legionella pneumophila (Probe # 1725361), Chlamydia pneumoniae (Probe # 1725402), Clostridium difficile (Probe # 1725452), VRE (Probe # 1725462) sowie Pneumocystis jirovecci (Probe # 1725604).

Im Rahmen der Testentwicklung bzw. Testoptimierung können diese Probensätze, u.a. als Qualitätskontrollen oder als standardisierte Sensitivitätsmarker, für die Austestung der unteren Nachweisgrenze von eigenentwickelten Nukleinsäure-gestützten Testsystemen dienen.

An dieser Stelle möchten wir auch darauf hinweisen, dass zahlreiche Rückstell-Probensätze der früheren Ringversuche noch verfügbar sind, und bei Bedarf über den Ringversuchsleiter formlos nachbestellt werden können.

Mit Ausnahme der zuvor erwähnten „grenzwertig positiven“ Einzelproben wurden die Mengen der entsprechenden Zielorganismen in den Probensätzen der aktuellen Ringversuchsrunde wieder relativ deutlich über der Nachweisgrenze von „durchschnittlich sensitiven PCR/NAT-Testkonzepten“ eingestellt. Diese definieren wir wie folgt: als Richtwert für die Bewertung von Ringversuchsergebnissen gilt das 10- bis 50-fache der unteren Nachweisgrenze durchschnittlich sensitiver PCR-Protokolle unter Standardbedingungen (z.B. 50 µl Block-Cycler Reaktionsansätze, 35 PCR-Zyklen, ggf. entsprechende real-time PCR Protokolle; gut evaluierte Primersequenzen).

Bei den meisten Probenmaterialien der aktuellen Ringversuchsrunde stellen falsch-negative Ergebnisse damit einen deutlichen Hinweis auf ernstzunehmende Mängel innerhalb der eingesetzten Verfahren zur Nukleinsäure-Extraktion, Amplifikation und Detektion dar.

Falsch-positive Ergebnisse sind dagegen in der Regel als Hinweis auf eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung und/oder auf mangelnde Spezifität der eingesetzten Testsysteme zu betrachten.

In bewährter Form werden im Folgenden die Ergebnisse der jeweiligen erregerspezifischen Ringversuche dargestellt. Die Tabellen 1 (Anhang 1 [Anh. 1]) zeigen dabei die Probenzusammensetzung und das erwartete Ergebnis (Sollwert) mit den entsprechenden Codenummern der Ergebnisbögen. Die von den einzelnen Teilnehmern mitgeteilten Ergebnisse werden in den Tabellen 2 (Anhang 1 [Anh. 1]) nach der Häufigkeit der Mitteilung von positiven oder negativen Ergebnissen und in den Tabellen 3 (Anhang 1 [Anh. 1]) nach der absoluten Anzahl der richtig positiven und richtig negativen Ergebnisse, sowie deren prozentualem Anteil (Befundhäufigkeit) je Amplifikationssystem bzw. Testkonzept aufgeschlüsselt.

Für die objektive Bewertung von kommerziellen Testsystemen sollten neben der rein statistischen Betrachtung der mitgeteilten Ringversuchsergebnisse auch die Anzahl und vor allem die methodische bzw. technische Qualifikation der individuellen Teilnehmer berücksichtigt werden. Da wir im Zuge unserer Ringversuche aber das gesamte Spektrum von spezialisierten Expertenlabors bis hin zum „Gelegenheitsanwender“ abdecken, müssen die arithmetisch ermittelten Richtigkeitsquoten bei der Bewertung einzelner Testsysteme immer mit einem gewissen Toleranzbereich betrachtet werden.

Auch im Rahmen des hier diskutierten Ringversuchs waren wieder einige Auffälligkeiten hinsichtlich der Spezifität und Sensitivität von bestimmten Testkonzepten und der für den Nachweis verwendeten Zielsequenzen zu beobachten. Diese Aspekte sind bei der Auswertung des jeweiligen Ringversuchs aufgeführt und dort auch kurz diskutiert. Zusätzlich stehen für die früheren, für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe zusätzlicher Informationen (wie die graphisch dokumentierten Ergebnisse unserer quantitativen real-time PCR Testsysteme oder die Ergebnisse einiger kommerzieller PCR Testsysteme) auch unter folgender Internetadresse: http://www.udo-reischl.de; Unterpunkt „Auswertung der Ringversuche“ und natürlich auch über die Homepage von INSTAND e.V. (https://www.instand-ev.de/) als pdf-Files zum freien Download bereit. An dieser Stelle möchte ich mich noch einmal ausdrücklich bei den geschätzten Kolleginnen und Kollegen für ihre zahlreichen und überaus konstruktiven Kommentare und Anregungen zu den Ausführungen in dieser Ringversuchsdiskussion sowie deren tatkräftige Unterstützung bei der Konzeption und dem Aufbau neuer Ringversuche bedanken.

Die Ergebnislage des aktuellen Ringversuchs deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus vorangegangenen Ringversuchen zum kombinierten NAT-gestützten C. trachomatis- und Gonokokken-Nachweis. Trotz der relativ geringen Erregermenge in den vier unterschiedlich zusammengesetzten positiven Proben führte auch diesmal die Verfügbarkeit gut evaluierter und zum Teil automatisierter NAT-gestützter Analysesysteme für Chlamydia trachomatis zu hohen Richtigkeitsquoten sowohl für positive, als auch für negative Befunde.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt jeweils eine Probe mit ca. ~5x10⁴ IFU/mL an C. trachomatis (# 1725304), zwei Proben mit einer ca. 2-fach bzw. 10-fach höheren Menge an C. trachomatis (# 1725303 mit ~1x10⁵ IFU/mL und # 1725302 mit ~5x10⁵ IFU/mL), eine Probe (# 1725304) mit ca. 5x10³ CFU/mL an N. gonorrhoeae, eine Probe mit einer ca. 10-fach höheren Menge an N. gonorrhoeae-Zielorganismen (# 1725301; ~5x10⁴ CFU/mL) sowie eine Probe mit einer sehr hohen Menge von ca. ~5x10⁶ CFU/mL an N. gonorrhoeae-Zielorganismen (# 1725303).

Der Übersichtlichkeit halber stellen wir bei diesem kombinierten Ringversuch (CT/NG) die Ergebniskonstellation in 7 getrennten Tabellen (Anhang 1 [Anh. 1], S. 1-3) dar. Damit wird die diagnostische Performance der jeweiligen Testsysteme beim Nachweis von CT und NG aussagekräftiger (Tabelle 4: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei CT, Tabelle 6: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei NG; jeweils gefolgt von den Richtigkeitsquoten nach aufgeführten Testsystemen in den Tabellen 5 und 7).

Auch wenn die etwas schwächer positive Probe # 1725304 des aktuellen Ringversuchs nur mit ca. 5x10⁴ IFU/mL an C. trachomatis-Zielorganismen versetzt worden war, fand sich unter den von insgesamt 191 Teilnehmern mitgeteilten NAT-Ergebnissen für C. trachomatis diesmal nur ein einziges falsch-negatives Ergebnis. Bei den beiden ca. 2- und 10-fach stärker CT-positiven Proben # 1725303 und # 1725302 des aktuellen Probensets wurden von den 191 Teilnehmern diesmal ebenfalls nur jeweils ein falsch-negatives Ergebnis mitgeteilt. Da hier von einem Großteil der Anwender mit den unterschiedlichsten Testsystemen durchweg korrekte Ergebnisse berichtet wurden, handelt es sich bei den einzelnen falsch-negativen Ergebnissen vermutlich um Ringversuchstypische „sporadische Ausreißer“. Die betreffenden Teilnehmer führten auf ihren Ergebnisformularen die Verwendung von kommerziellen und IVD-gelabelten Testsystemen an, mit denen aber viele andere Teilnehmer die C. trachomatis-Zielorganismen in den entsprechenden Proben problemlos nachweisen konnten…

Für die C. trachomatis-negative Probe # 1725301 wurden aus dem gesamten Teilnehmerfeld ebenfalls nur 4 falsch-positive Ergebnisse berichtet.

Im Rahmen des NAT-gestützten Gonokokken-Nachweises wurden für die drei positiven Proben # 1725304, # 1725301 und # 1725303 (N. gonorrhoeae; ca. 5x10³, ca. 5x10⁴ bzw. 5x10⁶ CFU/mL) diesmal jedoch von 7 der insgesamt 190 Teilnehmer falsch-negative Ergebnisse für Gonokokken DNA bei der schwach positiven Probe # 1725304 und 2 falsch-negative Ergebnisse für Gonokokken DNA bei der etwas stärker positiven Probe # 1725301 mitgeteilt. Erfreulicherweise wurde die diesmal sehr hoch positive Probe # 1725303 von allen Teilnehmer korrekt positiv befundet. Bei der einen GO-negativen Probe # 1725302 wurden jedoch von 3 Teilnehmern falsch-positive Ergebnisse berichtet.

Dieser im Vergleich zu früheren Ringversuchsrunden doch überraschend hohe Anteil an falsch-positiven Ergebnissen deutet auf Kontaminationsereignisse oder wie auch immer geartete Template-Nukleinsäure Verschleppungen bei der Probenaufbereitung und -abarbeitung hin. Vor allem, weil im aktuellen 4er-Set die GO-negative Probe # 1725302 bei sequenzieller Abarbeitung unmittelbar auf eine GO-positive Probe folgte. Den betroffenen Laboratorien sollten diese Ergebnisse Anlass geben, ihren individuellen diagnostischen Workflow hinsichtlich der Kontaminationssicherheit während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik zu überprüfen und gegebenenfalls zu optimieren.

Angesichts der mit 5x10⁴ IFU/mL ehrlicherweise nicht als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen in der CT-positiven Probe # 1725304 sowie 5x10³ CFU/mL an Zielorganismen in der GO-positiven Probe # 1725304 sollten falsch-negative Ergebnisse bei betroffenen Ringversuchsteilnehmern hier ebenfalls Anlass zur Optimierung ihrer jeweiligen spezifischen PCR/NAT-gestützten Testsysteme geben.

Da die beobachteten „Sensitivitätsprobleme“ diesmal nur relativ marginal ausfallen, sich offensichtlich nicht auf bestimmte Testkonzepte eingrenzen lassen und sporadisch durch das ganze Portfolio der eingesetzten Testsysteme gehen, kann dem großen Rest des Teilnehmerfeldes erneut eine erfreulich gute analytische Sensitivität und Spezifität ihrer CT- und GO-spezifischen NAT-Testsysteme sowie der angewandten Prozeduren zur Probenaufarbeitung und -prozessierung attestiert werden.

Angesichts der streng normierten und standardisierten Abarbeitungsprotokolle von kommerziellen Testsystemen scheint es für den Ringversuchsleiter jedes Mal aufs Neue nicht verwunderlich, dass ein nennenswerter Anteil der teilnehmenden Laboratorien mit den betroffenen Testsystemen erfolgreich die vorgegebenen Zielwerte erreicht. Ohne denjenigen Teilnehmern, die mit bestimmten kommerziellen Testsystemen die Zielwerte nicht erreichen, zu nahe treten zu wollen, deutet dieser Umstand in diesen Fällen dann wohl eher auf individuelle Abweichungen vom Protokoll oder bestimmte Fehler bei der Probenabarbeitung, als auf intrinsische Unzulänglichkeiten der in der Regel gut evaluierten Testsysteme hin.

Ich glaube, es ist auch für den Leser dieser Ringversuchsdiskussion weitgehend nachvollziehbar, dass wir als Organisatoren von Testkonzept- und Testplattform-übergreifenden Ringversuchen bei der Konfektionierung unserer Probenmaterialien leider nicht jede Besonderheit im Abarbeitungsprotokoll von kommerziellen Testsystemen berücksichtigen oder unterschiedliche Arten von Ringversuchsprobenmaterial für bestimmte Testsysteme bereitstellen können.

Auf diesen Umstand wurde bereits bei früheren Ringversuchen mehrfach im Zusammenhang mit den RNA-Zielsequenzen der AMPLIFIED CT Testkits oder der APTIMA COMBO 2 Testkits (Hersteller: Gen-Probe Inc.) hingewiesen. Werden von Teilnehmern bestimmte NAT-Testsysteme eingesetzt, die erregerspezifische RNA-Zielsequenzen nachweisen oder auf einem RNA-basierten Amplifikationsprozess (TMA; Transcription-Mediated Amplification, o.ä.) beruhen, so kann mit dem hier versandten Probenmaterial offiziell keine regelgerechte Abprüfung der entsprechenden Sensitivitäten unter Routinebedingungen gewährleistet werden. Aber selbst wenn das Herstellungsverfahren unserer Ringversuchsproben primär nicht auf die Stabilisierung von RNA-Molekülen hin optimiert und getestet wurde, so konnten dennoch sowohl bei der aktuellen, wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchsrunden, von vielen Teilnehmern mit RNA-gestützten Testsystemen hohe Richtigkeitsquoten erzielt werden. Aktuell wurden die C. trachomatis-Zielorganismen von allen 8 Teilnehmern mit RNA-basierten Gen-Probe-Testsystemen in den beiden stärker CT-positiven Proben erfolgreich nachgewiesen. Auch in den beiden stärker GO-positiven Proben # 1725301 und # 1725303 gelang nahezu allen Teilnehmern mit RNA-basierten Gen-Probe-Testsystemen der erfolgreiche Nachweis der Neisseria gonorrhoeae-Zielorganismen. Nur bei der sehr schwach GO-positiven Probe # 1725304 (in der zusätzlich noch relativ hohe Mengen an C. trachomatis enthalten waren) versagte der Nachweis bei 4 der insgesamt 8 Teilnehmer mit RNA-basierten Gen-Probe-Testsystemen. Da bei der Erteilung der Zertifikate ja bekanntermaßen ein falsches Ergebnis innerhalb der 4 bewerteten Ergebnisse toleriert wird, werden auch diesmal allen 8 Teilnehmern die entsprechenden Zertifikate erteilt.

Entsprechende Inhibitionskontrollen wurden von allen der insgesamt 191 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal nicht mitgeteilt.

Bei den ermittelten Richtigkeitsquoten für Teilnehmer mit den GenProbe CT/NG, Roche COBAS Amplicor, COBAS TaqMan, dem Becton Dickinson ProbeTec, Abbott RealTime CT/NG, Artus CT, LightMix CT/NG oder anderen in den entsprechenden Tabellen 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 1) aufgeführten Testsystemen wird erneut eindrucksvoll deutlich, dass mit dem Großteil dieser kombinierten Testsysteme insgesamt erfreulich hohe Richtigkeitsquoten sowohl für die positiven als auch für die negativen Ergebnisse beobachtet werden konnten. Um diesmal und auch zukünftig eine detaillierte Bewertung der C. trachomatis- und GO-spezifischen NAT-Komponenten dieser kombinierten Testsysteme zu ermöglichen, haben wir zusätzlich die Tabellen 4 bis 7 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 2-3) angefertigt. In den Tabellen 4 und 5 sind dabei nur die C. trachomatis (CT)-spezifischen Ergebnisse und in den Tabellen 6 und 7 nur die Neisseria gonorrhoeae (GO)-spezifischen Ergebnisse dargestellt und statistisch ausgewertet.

Anmerkung: Bevor durch einen kurzen Blick auf die prozentualen Richtigkeitsquoten in diesen Tabellen ein eventuell etwas zu voreiliger Rückschluss auf die diagnostische „Performance“ bestimmter kommerzieller Testsysteme gezogen wird, sollten erst die effektiven Teilnehmerzahlen berücksichtigt werden, die den dargestellten Richtigkeitsquoten arithmetisch zugrunde liegen.

Im handschriftlichen Kommentarfeld der Ergebnisformulare wurden unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: HAIN Lifescience FluoroType CT (10x), HAIN Lifescience FluoroType NG (9x), BD Max CT/GC/TV assay (8x), GeneProof PCR Kits (3x), Urethritis basic von fast-track Diagnostics (3x), VERSANT CT/GC DNA Assay von Siemens (3x), Seegene Anyplex™ II STI-7 Detection (2x), AmpliSens C. trachomatis und N. gonorrhoeae (1x), Mikrogen Diagenode Real Time PCR kits (1x), Mikrogen ampliCube STD (1x), Sacace Biotechnologies N. gonorrhoeae Real-TM (1x), Sacace Biotechnologies C. trachomatis Real-TM (1x), QIAGEN artus CT/GC QS-RGQ Kit (1x), Hologic Aptima Combo 2 assay CT/GC (1x), Elisabeth Pharmacon EliGene Neisseria UNI Kit (1x), N. gonorrhoeae Amplex Multiplex PCR-ELISA (1x), C. trachomatis/N. gonorrhoeae RG detect von Institute of Applied Biotechnologies (1x), Applied Biosystems/Dx Real Time System (1x), Autoimmun Diagnostika Gen ID STD Kit (1x) und Immundiagnostik Kit (1x).

Unabhängig von der Art des verwendeten Testsystems soll in diesem Zusammenhang auch noch einmal darauf hingewiesen werden, dass in Gegenwart von relativ hohen Mengen an Zielorganismen (bzw. deren Nukleinsäure) die interne Kontrollreaktion aufgrund der „Konkurrenzsituation“ mit der Amplifikation der eigentlichen Zielsequenz durchaus negativ ausfallen kann, obwohl keine Inhibition der PCR-Reaktion im eigentlichen Sinne vorliegt.

Bei kombinierten Testsystemen (Stichwort: Multiplex-PCR) kann ja bekanntlich auch die Gegenwart des einen Erregers oder Zielorganismus in hoher Menge die Nachweisempfindlichkeit für den gleichzeitigen Nachweis des/der anderen Erreger oder Zielorganismen im Multiplex-Reaktionsansatz negativ beeinflussen. Bei bestimmten suboptimal abgestimmten PCR/NAT-Testsystemen könnte die Zusammensetzung der Probe # 1725303 des aktuellen Ringversuchs eine solche Problemkonstellation repräsentieren und in der Konsequenz die etwas schlechteren Richtigkeitsquoten für den Gonokokken-DNA Nachweis erklären.

Das Probenset des aktuellen Ringversuchs enthielt diesmal eine Probe mit ca. 1x10⁵ IFU/mL an C. trachomatis (# 1725314), eine Probe mit ca. 5x10⁴ IFU/mL an C. trachomatis (# 1725311), eine Probe mit ca. 1x10⁴ IFU/mL an C. trachomatis (# 1725312), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1725313), die ausschließlich nicht infizierte humane Zellen und Escherichia coli enthielt.

Wie Tab. 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 4) der statistischen Auswertung zu entnehmen ist, wurden von den insgesamt 74 Teilnehmern bei der negativen Probe # 1725313 sowie bei allen drei C. trachomatis-positiven Proben (# 1725311, # 1725312 und # 1725314) diesmal nahezu durchwegs korrekte Ergebnisse mitgeteilt. Die markante Übereinstimmung der aktuellen Ergebniskonstellation mit den Beobachtungen und hervorragenden Richtigkeitsquoten vorhergegangener Ringversuche mit ähnlicher Menge an C. trachomatis-Zielorganismen kann erneut als Beleg für eine hohe Zuverlässigkeit und Konstanz der eingesetzten Testsysteme sowie der aktuellen Kits und automatisierten Testplattformen zur Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Prozessierung angesehen werden.

Auch wenn mit ca. 1x10⁴ IFU/mL an Zielorganismen im Probenmaterial die untere Nachweisgrenze hochsensitiver und standardisierter PCR/NAT-gestützter Testsysteme noch nicht erreicht oder unterschritten sein sollte, stehen mit den Rückstellproben dieses Ringversuchs RV 531 vom November 2017 den Teilnehmern mit hohem Anspruch an die individuelle Testsensitivität wieder geeignete Sets zur Überprüfung und Optimierung ihrer jeweiligen NAT-gestützten Testsysteme zur Verfügung. Angesichts der nach wie vor anhaltenden Diskussion um das „Pooling“ von entsprechendem Untersuchungsmaterial bleibt der Aspekt der analytischen Sensitivität der jeweils eingesetzten Testsysteme bedeutsam.

Inhibitionskontrollen wurden von allen der insgesamt 74 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden auch diesmal bei keiner der insgesamt vier Proben mitgeteilt. In diesem Zusammenhang sei kurz angemerkt, dass wir auch im aktuellen Ringversuch keine der Einzelproben absichtlich mit inhibitorischen Substanzen versetzt haben. Erfreulicherweise waren im Rahmen dieses Ringversuchs im Großen und Ganzen keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität und Spezifität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und den selbstentwickelten in-house Testsystemen zu beobachten. Trotz der relativ geringen Menge an Zielorganismen bewegten sich die Richtigkeitsquoten dabei durchweg auf erfreulich hohem Niveau.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. folgende Testsysteme aufgeführt: BD Max CT/GC/TV assay (5x), GeneProof C. trachomatis PCR Kit (2x), HAIN Lifescience GenoType CT (2x), HAIN Lifescience GenoQuick CT (2x), Seegene Allplex STI Essential Assay (1x), Autoimmun Diagnostika Gen ID STD Kit (1x), Sansura Biotech C. trachomatis DNA Fluorescence Diagnostic Kit (1x), Euroclone Duplica Real Time (1x) und VERSANT CT/GC DNA Assay von Siemens (1x).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine Probe mit einer relativ hohen Menge an Zielorganismen (# 1725321; B. pertussis, ~5x10⁴ CFU/ml), eine mit ca. zehnfach geringerer Menge (# 1725324; B. pertussis, ~5x10³ CFU/ml), und eine Probe mit Bordetella parapertussis als verwandte Spezies (# 1725322 mit 5x10⁵ CFU/mL). Die Probe # 1725323 enthielt diesmal keine Zielorganismen, sondern lediglich E. coli und eine Suspension aus humanem Zellmaterial.

Die Verfügbarkeit von offensichtlich inzwischen sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesystemen für den Nachweis von Bordetella pertussis-DNA führte auch diesmal wieder zu durchwegs hohen Richtigkeitsquoten sowohl bei einer der beiden positiven als auch bei den zwei B. pertussis-negativen Proben. Lediglich von einem der insgesamt 126 Teilnehmer wurde ein falsch-positives Ergebnis für die negative Probe # 1725322 (B. parapertussis) mitgeteilt und von einem Teilnehmer wurde das Ergebnis als „fraglich“ klassifiziert. Es kann natürlich nicht ausgeschlossen werden, dass es sich hierbei um laborinterne Kontaminationsereignisse oder um Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung handelte. Auch eine mangelnde Spezifität des eingesetzten PCR/NAT-Testsystems ist bei dieser Konstellation denkbar.

Unter den insgesamt 504 mitgeteilten NAT-Ergebnissen befanden sich zudem 17 falsch-negative für die schwach positive Probe # 1725324 (5x10³ CFU/mL an B. pertussis) und ein als „fraglich“ klassifiziertes Ergebnis für die B. pertussis-negative Probe # 1725323. Ein falsch-negatives Ergebnis bei der relativ stark positiven Probe # 1725321 sollte bei dem einen betroffenen Ringversuchsteilnehmer Anlass zur Überprüfung und Optimierung des Konzepts oder des diagnostischen Workflows seines individuellen Helicobacter pylori-spezifischen PCR/NAT-gestützten Testsystems geben.

Im Rahmen der hier üblichen retrospektiven Analyse der Ergebniskonstellation kann natürlich nie ausgeschlossen werden, dass von einzelnen Teilnehmern die Proben bei der analytischen Abarbeitung oder die Ergebnisse bei der Befundung schlichtweg verwechselt wurden. In der simplen Konsequenz wären bei solchen Fällen dann in Tab. 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 5) einzelne „vermeindlich“ falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse über die 4 Proben des Sets verteilt zu beobachten. Ohne einzelnen Teilnehmern zu nahe treten zu wollen liegt bei der aktuellen Auswertung des RV 532 diese Vermutung nahe. Daher sei hier nochmals an die sorgfältige Kontrolle bei der Auf- bzw. Abarbeitung der Einzelproben sowie der sorgfältigen Übertragung in das Ergebnisformular apelliert ;-)

Inhibitionskontrollen wurden von 123 der insgesamt 126 Teilnehmer durchgeführt und Inhibitionsereignisse wurden dabei von keinem Teilnehmer beobachtet. Bei einer Menge von 5x10³ CFU/mL an B. pertussis-Zielorganismen (entspricht ca. 5x10² CFU in dem für PCR-Untersuchungen typischerweise prozessierten Probenvolumen von 100 µl) nähert man sich offensichtlich der unteren Nachweisgrenze entsprechender Testsysteme an. Aufgrund der relativ geringen Menge an Zielorganismen in Probe # 1725324 wurden die mitgeteilten Ergebnisse diesmal nicht in die Bewertung für die Zertifikate mit einbezogen. Dies ist auch durch die durchgehend grau schraffierten Felder in Tab. 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 5) gekennzeichnet.

Wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchen verwendete die überwiegende Anzahl der Teilnehmer selbstentwickelte (in-house) Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von B. pertussis. In diesem Zusammenhang wurde von 85 Teilnehmern explizit die Verwendung der sehr populären und B. pertussis-spezifischen Insertionssequenz IS481, von 11 Teilnehmern die Verwendung von Segmenten innerhalb des Pertussis Toxin Gens und von 2 Teilnehmern die Verwendung eines ribosomalen Genabschnittes als B. pertussis-spezifische Zielsequenz angegeben.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Autoimmun Diagnostika Gen ID Tests (6x), GeneProof B. pertussis/parapertussis PCR Kit (4x), AmpliGnost B. pertussis/parapertussis PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (3x), Seegene Allplex Respiratory Panel 1 (3x), Altona diagnostic RealStar Bordetella PCR Kit (3x), HAIN Lifescience FluoroType Bordetella (3x), fast-track Diagnostics Bordetella (1x), Ingenetix Bacto Real B. pertussis/B. parapertussis (1x), Mikrogen ampliCube (1x), Mikrogen Diagenode Bordetella (1x), Attomol Bordetella Realtime LT (1x), QUIDEL AmpliVue Bordetella Assay (1x), Sacace Biotechnologies B.pertussis/B.parapertussis/B.bronchiseptica Real-TM (1x), BioMerieux ARGENE Bordetella R-gene (1x), Meridian Bioscience illumigene Pertussis (1x) und PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x).

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 6) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal eine positive Probe eines Clarithromycin-resistenten H. pylori- (# 1725331; 5x10⁵ CFU/ml) und eine positive Probe eines Clarithromycin-sensiblen H. pylori-Patientenisolats (# 1725333; 5x10⁶ CFU/ml). Probe # 1725332 enthielt eine Kultursuspension der mit dem Zielorganismus verwandten Spezies Helicobacter mustelae (~5x10⁵ CFU/ml) und Probe # 1725334 enthielt ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli.

Wie bereits bei den vorhergegangenen Ringversuchsrunden mehrfach zu beobachten war, führte die Verfügbarkeit gut evaluierter NAT-gestützter Analysesysteme und die relativ hohe Menge an Zielorganismen in den beiden positiven Proben # 1725331 und # 1725333 (~5x10⁵ bzw. ~5x10⁶ CFU/mL) beim Nachweis von H. pylori-DNA zu insgesamt sehr hohen Richtigkeitsquoten.

Lediglich von einem der insgesamt 38 Teilnehmer wurde ein falsch-negatives Ergebnis für die sehr hoch positive Probe # 1725333 und von 2 weiteren Teilnehmern ein falsch-positives Ergebnis für die negative Probe # 1725332 mitgeteilt. Diese Probe enthielt eine Kultursuspension der Spezies Helicobacter mustelae in signifikatnter Menge (~5x10⁵ CFU/ml), deren DNA mit den NAT-Testsystemen der übrigen 36 Teilnehmer offensichtlich keine „spezifischen“ Amplifikationsprodukte erzeugte und somit auch korrekt als H. pylori-negativ bewertet wurde.

Falsch-positive Ergebnisse bei der Probe # 1725332 des aktuellen Ringversuchs sollten bei den betroffenen Ringversuchsteilnehmern jedoch Anlass zur Überprüfung und Optimierung der Speziesspezifität ihres jeweiligen Helicobacter pylori-spezifischen PCR/NAT-gestützten Testsystems geben.

Bei der Probe # 1725334, die diesmal lediglich eine Kultursuspension von E. coli enthielt, wurden von 36 der insgesamt 38 Teilnehmer korrekt negative Ergebnisse berichtet.

Sowohl die kommerziellen als auch die eigenentwickelten Testsysteme schnitten im aktuellen Ringversuch wieder einmal erfreulich gut ab. So erreichten die in-house Testsysteme wie auch die kommerziellen Assays Richtigkeitsqouten von annähernd 100%, was die richtig-positiven und die richtig-negativen Ergebnisse betrifft.

Bis auf 27 Teilnehmer mit spezifizierten kommerziellen Testsystemen (im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ 1 x AmpliSens H. pylori angegeben) verwendeten die Teilnehmer zum NAT-gestützten Nachweis von H. pylori selbstentwickelte, sog. in-house Testsysteme.

Wie in der Testbeschreibung des RV 533 vermerkt, konnten die Teilnehmer auf freiwilliger Basis auch die vermeintliche Clarithromycin-Resistenz der untersuchten H. pylori-Isolate mitteilen. Diese Spezialuntersuchung zur molekularbiologischen Resistenztestung erfolgt in der Regel über die Amplifikation und Sequenzierung von charakteristischen Bereichen, innerhalb der H. pylori 23S rDNA bzw. der Sequenzanalyse dieses Genombereichs, mittels Hybridisierungssonden. Ergebnisse wurden hier von 36 der insgesamt 38 Teilnehmer mitgeteilt, und mit Ausnahme eines einzigen Teilnehmers waren die mitgeteilten Ergebnisse der molekularen Resistenztestung auch durchweg korrekt.

Wie auch bereits bei den vorhergegangenen Runden dieses Ringversuchs mehrfach diskutiert, besteht die eigentliche Herausforderung bei dem Nukleinsäure-gestützten Nachweis von EHEC/STEC prinzipiell nicht so sehr in dem Nachweis sehr geringer Mengen an Zielorganismen, sondern vielmehr in der differenzierten Analyse und der Typisierung unterschiedlicher Shiga-Toxin-Genen und anderer putativer Pathogenitätsfaktoren (wie das für Intimin kodierende eae-Gen oder das für Enterohämolysin kodierende hlyA-Gen). Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt daher drei unterschiedliche EHEC positive Proben: mit ca. 5x10⁴ CFU/mL (# 1725341: E. coli, stx₁-, stx₂-, eae-, hlyA- und O157-positiv und # 1725343: E. coli, stx_2f- und eae-positiv) und mit ca. 5x10³ CFU/mL (# 1725344: E. coli, stx_2d-positiv). Die Probe # 1725342 enthielt diesmal nur einen „normalen“ E. coli K12-Stamm (eae-, hlyA-negativ).

Mit Ausnahme der Probe # 1725344 (mit einer relativ geringen Menge an EHEC Zielorganismen) sowie der Probe # 1725343 (mit einem stx_2f-positiven EHEC-Isolat) führte die Verfügbarkeit von mittlerweile sehr gut etablierten NAT-gestützten Testsystemen und molekularbiologischen Differenzierungsstrategien für EHEC bei den restlichen zwei Proben durchweg zu hohen Richtigkeitsquoten – sowohl für positive, als auch für negative Befunde. Von 111 der insgesamt 113 Teilnehmer wurden hier durchwegs korrekte Ergebnisse berichtet.

Angesichts der Probenkonstellation mit einer vorhergehenden stark positiven Probe könnte es sich bei den 2 falsch-positiven PCR-Resultaten für die negative Probe # 1725342 (mit eae- und hlyA-negativem E. coli K12-Stamm) eventuell um laborinterne Kontaminationsereignisse oder um Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung handeln. Aber das bleibt aus Sicht der retrospektiven Ringversuchsauswertung natürlich spekulativ.

Bei einer Menge von 5x10³ CFU/mL an EHEC Zielorganismen (entspricht ca. 5x10² CFU in dem für PCR-Untersuchungen typischerweise prozessierten Probenvolumen von 100 µl) nähert man sich offenbar der unteren Nachweisgrenze von zahlreichen in der Routinediagnsotik etablierten PCR/NAT-Testsystemen und den entsprechenden Arbeitsabläufen zur Probenaufarbeitungs- und Template-DNA Präparation an. Aufgrund der relativ geringen Menge an Zielorganismen in Probe # 1725344 wurden die mitgeteilten Ergebnisse diesmal nicht in die Bewertung für die Zertifikate mit einbezogen. Dies ist auch durch die durchgehend grau schraffierten Felder in Tab. 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 7) gekennzeichnet.

Erfahrungsgemäß sind bei den üblicherweise eingesetzten PCR/NAT-Testsystemen auch gewisse „diagnostische Lücken“ aufgrund der mehr oder weniger stark ausgeprägten Sequenzheterogenität innerhalb der bisher bekannten Shiga-Toxin-Genvarianten zu erwarten. Dies wurde im aktuellen Ringversuch wieder einmal mit der Probe # 1725343 und dem darin enthaltenen stx_2f-positiven EHEC-Isolat bestätigt. Hier wurde lediglich von 55 der insgesamt 113 Teilnehmer ein positives Ergebnis für die Anwesenheit von Shiga-Toxin-Genen berichtet. Bei genauerer Analyse der mitgeteilten Test-Daten war auffällig, dass alle 30 Teilnehmer mit dem „r-biopharm RIDAGENE EHEC“ Testkit die stx_2f-positive Probe # 1725343 problemlos nachweisen konnten während alle Anwender des „Hain Lifescience GenoType EHEC“ Kits hier ein negatives Ergebnis berichteten. Andererseits gelang widerum allen 20 Teilnehmern mit dem „Hain Lifescience GenoType EHEC“ Kit der erfolgreiche EHEC-Nachweis in der Probe # 1725344 (mit einer relativ geringen Menge an stx_2d EHEC-Zielorganismen) wogegen lediglich 13 der insgesamt 30 „r-biopharm RIDAGENE EHEC“ Testkit Anwender hier ein korrekt positives Ergebnis beobachten konnten.

Auch wenn die humanpathogene Relevanz von stx_2f-positiven EHEC-Isolaten in der Fachwelt nach wie vor umstritten ist, soll hier an einem Beispiel aus der mikrobiologischen PCR-Routinediagnostik wieder einmal die überraschende Vielfalt an möglichen Genkonstellationen im Umfeld von EHEC-Isolaten aufgezeigt werden. Der bisher einzige Nachweis eines stx_2f-positiven EHEC-Isolates in unserem Hause erfolgte aus einer Lebensmittelprobe, als im Zuge des EHEC-Ausbruchsgeschehens im Jahre 2011 umfangreiche Screeninguntersuchungen aus Stuhl-, Umwelt- und Lebensmittelproben durchgeführt wurden. In diesem Fall passte der stx_2f-Nachweis übrigens „anamnestisch“ hervorragend zu den bekannten Übertragungsrouten (Blattsalat aus Gewächshaus, das aus ökologischen Gründen mit Regenwasser aus der Dachrinne bewässert wurde; das Dach dieses Gewächshauses war ein beliebter Rastplatz für die Bewohner von umliegenden Taubenkobeln…). Zur Thematik der „stx_2f-positiven E. coli-Isolate“ sind inzwischen auch zahlreiche wissenschaftliche Arbeiten veröffentlicht worden. Exemplarisch sei hier auf eine Publikation von Mitarbeitern des RKI in Wernigerode aus dem Jahre 2009 verwiesen [2].

Anmerkung an die Teilnehmer des aktuellen Ringversuchs: bitte keine Angst um die Zertifikate, denn diese Probe wurde ebenfalls als „edukative Probe“ deklariert und die entsprechenden Ergebnisse daher bei der offiziellen Bewertung zur Erteilung von Ringversuchszertifikaten außen vor gelassen.

Da in den meisten der teilnehmenden Laboratorien ein NAT-gestützter Nachweis von Shiga-Toxin-Genen im Umfeld der EHEC-Diagnostik primär als Kulturbestätigungstest eingesetzt wird, werden bei zukünftigen Ringversuchen auch die meisten der positiven Proben wieder relativ hohe Mengen an Zielorganismen enthalten, und der Schwerpunkt bleibt auf der Abprüfung der analytischen Spezifität der eingesetzten Testsysteme, und weniger auf der dabei erzielten unteren Nachweisgrenze.

Neben der stark ansteigenden Zahl an „Hain Lifescience GenoType EHEC“- und „r-biopharm RIDAGENE EHEC“-Anwendern gab die Mehrzahl der Teilnehmer nach wie vor die Verwendung von selbstentwickelten oder „anderen“ kommerziellen Testsystemen mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von EHEC an, und bei keiner der ausgesandten Proben wurden signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Zudem wurden von 92 der insgesamt 113 Teilnehmer die Ergebnisse der molekulargenetischen Shiga-Toxin-Subtypisierung sowie des gezielten Nachweises von Intimin- (eae) und/oder Enterohämolysin (hlyA)-Genen mitgeteilt. Wenn auch die Typisierung nicht immer vollständig durchgeführt wurde, so waren diese Angaben zur Typisierung, zumindest in dem mitgeteilten Umfang, großteils korrekt.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: TIB Molbiol LightMix modular stx-1/stx-2/eae (7x), BD Max Enteric Bacterial Panel (4x), Seegene Allplex Gastrointestinal Panel Assays (2x), Sacace Biotechnologies EHEC Real-TM (1x), Altona diagnostic RealStar EHEC PCR Kit (1x), AmpliGnost Verotoxin 1/2 (Differenzierung) PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), fast-track Diagnostics (1x), Biomerieux BioFire (1x) und Mikrogen ampliCube (1x).

Nachdem die Probenauswahl des letzten Ringversuchs mehr auf die analytische Sensitivität der eingesetzten Testsysteme abzielte, wollten wir uns im aktuellen Ringversuch wieder einmal auf die Prüfung der analytischen Spezifität fokussieren.

Daher wurden bei der Konzeption des Ringversuchs diesmal zwei B. burgdorferi und eine Rückfallfieber-Borrelien-Spezies an die Teilnehmer versandt. Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt jeweils eine Probe mit ca. 5x10⁴ Organismen/mL an Borrelia spielmanii (# 1725352), eine Probe mit ca. 1x10⁵ Organismen/mL an Borrelia afzelii (# 1725354), eine Probe mit ca. 5x10⁴ Organismen/mL der Rückfallfieber-Borrelie Borrelia miyamotoi (# 1725353), sowie eine Probe mit ca. 5x10² Organismen/mL an Borrelia afzelii (# 1725351).

Nochmals eine kurze Rekapitulation: Schon die 21 verschiedenen, dem B. burgdorferi sensu lato-Komplex zugehörigen Spezies können erhebliche Problem für den PCR-/NAT-gestützten Nachweis darstellen. Mit B. miyamotoi wird die Gesamtsituation noch weiter kompliziert: Diese erst vor Kurzem als humanpathogen beschriebene Borrelienspezies wurde bereits 1994 in Ixodes persulcatus-Zecken aus Japan entdeckt. B. miyamotoi gehört zu den Rückfallfieber-Borrelien – nicht zu B. burgdorferi s.l. –, wird aber interessanterweise durch dieselben Schildzeckenspezies wie B. burgdorferi übertragen, während Rückfallfieber-Borrelien normalerweise Lederzecken oder Läuse als Vektor benutzen. Wirte für B. miyamotoi sind wahrscheinlich Kleinsäuger und Vögel. Erkrankungen des Menschen durch B. miyamotoi wurden erstmals 2011 in Russland beschrieben, im Gefolge auch in den USA, Europa und Japan. Symptome der Erkrankung umfassen insbesondere Fieber, Schüttelfrost, Kopf-, Muskel- und Gelenkschmerzen sowie Schwindel. Bei insgesamt unspezifischer Symptomatik wird die Diagnose akut mittels gefärbtem Blutausstrich oder PCR gestellt. Weitere diagnostische Methoden umfassen Antikörpernachweis, Anzucht und Mäuse-Inokulationsversuche. Therapiert wird mit Doxycyclin oder, in schwereren Fällen, mit Ceftriaxon oder Penizillin G. Bei insgesamt noch sehr geringen Fallzahlen dürfen die Angaben noch als vorläufig und wenig substantiiert betrachtet werden. Allerdings ist zu betonen, dass speziell in Ixodes-Zecken B. miyamotoi in vielen Regionen Europas mittels PCR regelhaft nachweisbar sind. In Deutschland u.a. in Sachsen, im Siebengebirge, im Rheintal und in verschiedenen Regionen in Bayern.

Nun zu den aktuellen Ringversuchsergebnissen: die Detektion von Borrelia afzelii in der Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1725353 mit ~5x10⁵ Organismen/mL) bereitete diesmal erfreulicherweise keinem der insgesamt 93 Teilnehmer Probleme.

Borrelia spielmanii in der positiven Probe # 1725353 (~5x10⁴ Organismen/mL) wurden bei 90 (96%) der insgesamt 93 Teilnehmer von den jeweils eingesetzten Borrelien-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen erfasst und korrekterweise als positiv befundet, lediglich 3 Teilnehmer berichteten hier ein falsch-negatives Ergebnis. Die relativ schwach positive Probe # 1725351 mit ca. 5x10² B. afzelii Zielorgansimen pro mL wurde lediglich noch von 54 (58%) der Teilnehmer als richtig positiv erkannt, 34 Teilnehmer berichteten hier ein falsch-negatives Ergebnis und von 5 Teilnehmern wurde das Ergebnis als „fraglich“ klassifiziert. Bei einer Menge von 5x10² Borrelien-Zielorganismen/mL werden offenbar bereits die individuellen unteren Nachweisgrenzen von zahlreichen in der Routinediagnsotik etablierten PCR/NAT-Testsystemen und den entsprechenden Arbeitsabläufen zur Probenaufarbeitungs- und Template-DNA-Präparation berührt bzw. unterschritten. Aufgrund der relativ geringen Menge an Zielorganismen wurden die mitgeteilten Ergebnisse bei dieser Einzelprobe diesmal nicht in die Bewertung für die Zertifikate mit einbezogen. Dies ist durch die durchgehend grau schraffierten Felder in Tab.2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 8) gekennzeichnet.

Etwas komplex gestaltete sich auch die Ergebniskonstellation bei Probe # 1725353 mit ca. 5x10⁴ B. miyamotoi-Zielorgansimen/mL. Immerhin noch 24 (25%) der Teilnehmer identifizierten diese Probe als richtig negativ, während 68 Teilnehmer diese Probe mit der in klinischem Material nur sehr selten anzutreffenden Borrelien-Spezies, die auch nicht zum B. burgdorferi sensu lato-Komplex gehört, strenggenommen fälschlicherweise als positiv beurteilten und ein Teilnehmer sein Ergebnis bei dieser Probe als „fraglich“ klassifizierte. Dieses Ergebnis unterstreicht einmal mehr die Vorstellung, dass positive PCR-Ergebnisse sinnvollerweise bis auf Speziesebene identifiziert werden sollten.

Aufgrund der genetischen Verwandschaft zwischen B. miyamotoi und „echten“ Mitgliedern des B. burgdorferi sensu lato-Komplexes ist eine Kreuzreaktion aufgrund mangelnder Spezifität des entsprechenden Testsystems bei dieser Konstellation sehr wahrscheinlich. Laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung sind natürlich ebenfalls möglich und sollten ggf. kontrolliert und korrigiert werden. Aber das bleibt aus Sicht der retrospektiven Ringversuchsauswertung natürlich spekulativ.

Interne oder externe Inhibitionskontrollen wurden von allen 93 Teilnehmern mitgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse der PCR-Reaktion wurden im Rahmen dieser Ringversuchsrunde von keinem Teilnehmer beobachtet.

Wie bei den vorhergehenden Ringversuchsrunden haben auch diesmal wieder ungefähr knapp die Hälfte der Teilnehmer selbstentwickelte (in-house) Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von Borrelien-DNA verwendet, kommerzielle Testsysteme wurden von 49 der 93 Teilnehmer eingesetzt.

Im Großen und Ganzen waren im Rahmen dieses Ringversuchs auch keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen zu beobachten. Dennoch kann angemerkt werden, dass von den 34 Teilnehmern, die ein falsch-negatives Ergebnis für die Probe # 1725351 mit relativ geringer Erregerlast berichteten, fünf davon durch in-house Testsysteme generiert wurden. Gegebenenfalls sollte also die Sensitivität der hauseigenen Testsysteme überprüft werden.

Darüber hinaus wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: GeneProof Borrelia burgdorferi PCR Kit (11x), HAIN Lifescience FluoroType Borrelia (5x), BIORON RealLine Borrelien Kit (2x), EliGene Borrelia RT von Elisabeth Pharmacon (1x), BactoReal B. burgdorferi von Ingenetix (1x), Attomol B. burgdorferi Realtime LT (1x) und VIASURE Tick Borne Diseases Real Time PCR Detection Kit (1x).

Vorab ein kurzer Hinweis: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Legionella pneumophila aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Er ist daher NICHT für die Abprüfung von immunologischen Direktnachweisverfahren wie L. pneumophila SG1 Urin-Antigen Testen o.ä. geeignet. Einzelne Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets können daher typischerweise auch relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von L. pneumophila-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine sehr stark positive Probe # 1725362, die mit einer Menge von ca. 5x10⁵ CFU/mL an Legionella pneumophila-Serogruppe 2 versetzt war, sowie eine Probe mit etwa hundertfach geringerer Menge (# 1725361, ca. 5x10³ CFU/mL) an Legionella pneumophila-Serogruppe 2. Die Probe # 1725363 des aktuellen Sets enthielt ca. 5x10⁴ CFU/mL an Legionella londiniensis. Die zweite „negative“ Probe # 1725364 des aktuellen Probensets enthielt neben humanem Zellmaterial lediglich E. coli.

Die relativ stark positive Probe # 1725362 mit ca. 5x10⁵ CFU/mL an Legionella pneumophila SG2 wurde dabei von nahezu allen der insgesamt 98 Teilnehmern korrekterweise als positiv befundet.

Auch die „richtig negative“ Probe # 1725364 (nur E. coli) wurde diesmal erfreulicherweise von 97 der insgesamt 98 Teilnehmer als negativ für Legionella pneumophila-DNA befundet. Lediglich ein Teilnehmer berichtete bei dieser Probe ein falsch-positives Ergebnis für L. pneumophila. Hier sollten mögliche laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. Kreuzkontaminationen während der individuellen Probenextraktion und -abarbeitung ggf. kontrolliert und bestmöglich korrigiert werden. Im Umkehrschluss sollte der eine Teilnehmer, der die relativ stark positive Probe # 1725362 fälschlicherweise als negativ befundet hat (sofern es sich hier nicht um einen banalen „Ergebnisverdreher“ mit Probe # 1725361 gehandelt hat), die analytische Sensitivität seines L. pneumophila-spezifischen PCR/NAT-Testsystems und die entsprechenden Arbeitsabläufe zur Probenaufarbeitungs- und Template-DNA Präparation überprüfen.

Die vierte Probe des ausgesandten Sets, die diesmal mit einer relativ hohen Menge an Legionella londiniensis (~5x10⁴ CFU/mL) versetzt war, wurde ebenfalls von nahezu allen Teilnehmern mit ihren L. pneumophila-spezifischen PCR-/NAT-Testsystemen korrekt als negativ befundet. Auch hier berichtete nur einer der insgesamt 98 Teilnehmer ein falsch-positives Ergebnis für L. pneumophila DNA, was auf eine Kreuzreaktion bzw. mangelnde Speziesspezifität der Zielsequenz zurückzuführen sein dürfte. Vor allem in-house real-time PCR Protokolle mit ribosomalen Zielsequenzen zeigten in der Vergangenheit immer wieder Probleme bei der Speziesspezifität.

Und hier noch eine kurze Anmerkung zu Legionella londiniensis: diese non-pneumophila Legionellen-Spezies wird überwiegend im Rahmen von Wasseruntersuchungen isoliert und bis auf einen einzelnen Fallbericht [3] gibt es bisher keine Hinweise auf eine pathogene Relevanz oder einen diagnostischen Nachweis aus klinischem Untersuchungsmaterial.

Geeignete Inhibitionskontrollen wurden von 97 der 98 Teilnehmer durchgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse wurden offenbar nicht beobachtet.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs kamen bei insgesamt 78 Teilnehmern kommerzielle NAT-Testsysteme für den Nachweis von L. pneumophila-DNA im Untersuchungsmaterial zum Einsatz. Signifikante Unterschiede bezüglich der analytischen Sensitivität zwischen kommerziellen und selbstentwickelten Testsystemen (von 42 Teilnehmern verwendet) fanden sich nicht.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP Bacterial Kit (5x), Autoimmun Diagnostika RDB2135 CAP Bakterien (1x), AmpliGnost L. pneumophila von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (4x), Mikrogen Diagenode Lpn-050 Kit (4x), Mikrogen ampliCube (1x), fast-track Diagnostics FTD Atypical CAP (3x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (3x), Seegene Seeplex PneumoBacter ACE detection (2x), ARGENE Legio pneumo/Cc r-gene (1x), ARGENE Amp-Mix (1x), Gerbion diarella Legionella real time PCR Kit LC und TM (1x), PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x), GeneProof Legionella pneumophila PCR Kit (1x), Vircell Speed-oligo Legionella (1x), Ingenetix Bacto Real L. pneumophila (1x), AnDiatec Quidel L. pneumophila (1x) und VIASURE L. pneumophila Real Time PCR Detection (1x).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine Probe mit relativ hoher Menge an Salmonella enterica Serovar Typhimurium (# 1725373 mit ~1x10⁴ CFU/mL), eine Probe mit Salmonella enterica Serovar Enteritidis (# 1725371 mit ~1x10⁴ CFU/mL) und zwei Proben ohne Zielorganismen (# 1725372 und # 1725374), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Die Verfügbarkeit von spezifischen und mittlerweile gut evaluierten selbstentwickelten bzw. kommerziellen NAT-gestützten Analysesystemen führte erfreulicherweise bei allen 4 Proben des Ringversuchssets zu sehr hohen Richtigkeitsquoten. Insgesamt war lediglich ein falsch-negatives Ergebnis bei der positiven Probe # 1725373 zu beobachten. Bei den übrigen 3 Proben innerhalb des aktuellen Sets, # 1725371, # 1725372 und # 1725374, wurden im Rahmen dieses Ringversuchs zum NAT-gestützten Nachweis von Salmonellen von den insgesamt 23 Teilnehmern durchwegs korrekt negative bzw. positive Ergebnisse berichtet. Im direkten Vergleich zu manchen der vorhergehenden Ringversuchsrunden deutet dies auf eine verbesserte Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden diagnostischen Laboratorien hin. Hoffentlich bestätigt sich diese erfreuliche Beobachtung auch in den zukünftigen Ringversuchsrunden.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ von einem Teilnehmer die Verwendung des folgenden Kits aufgeführt: r-biopharm RIDAGENE Bacterial Stool Panel (6x), BD Max Enteric Bacterial Panel (3x), TIB Molbiol LightMix Salmonella (1x), fast-track Diagnostics (1x) und Mikrogen ampliCube (1x).

In enger Abstimmung mit unserem Sollwert-Laboratorium am Bayerischen Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Oberschleißheim, werden wir weiterhin versuchen, ab und an ein etwas exotischeres Serovar von Salmonella enterica zu versenden und zumindest eine der 4 Proben mit einer relativ geringen Menge an Zielorganismen zu versetzen – auch wenn im Rahmen der gesetzlichen Vorschriften und/oder Richtlinien der einzelnen Fachgesellschaften derzeit noch keine genauen unteren Nachweisgrenzen für den NAT-gestützten Salmonellen-Nachweis festgelegt wurden.

Neben der wohl prominentesten Spezies Listeria monocytogenes sind auch eine Reihe weiterer Listerienspezies bekannt, für die inzwischen auch einige selbstentwickelte und kommerzielle NAT-gestützte Nachweisverfahren zur Verfügung stehen. Auch wenn diese Spezies (mit Ausnahme von L. ivanovii) zumeist nicht von humanpathogener Relevanz sind, werden wir uns bei der Konzeption des Probenmaterials für RV 538 vor allem zur Abprüfung der Spezifität individueller Testsysteme nicht nur auf L. monocytogenes beschränken. Daher werden, wie in dieser Ringversuchsrunde, auch andere Listerienspezies in der einen oder anderen Probe zu finden sein.

Probe # 1725384 des aktuellen Sets enthielt eine relativ hohe Menge an L. monocytogenes (ca. 1x10⁵ CFU/mL), die erfreulicherweise von allen der insgesamt 32 Teilnehmer korrekt erfasst wurde. Probe # 1725381 enthielt mit ca. 1x10⁴ CFU/mL eine etwa zehnfach geringere Menge an Zielorganismen, die ebenfalls von nahezu allen Teilnehmern mit ihren jeweiligen spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert werden konnte. Lediglich zwei Teilnehmer berichteten hier ein falsch-negatives Ergebnis. Erfreulicherweise wurde auch die Probe # 1725383, welche ausschließlich humanes Zellmaterial und E. coli enthielt, von allen Laboratorien als „negativ“ befundet, was erneut für eine sehr gute Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden Laboratorien spricht.

Zur Abprüfung von möglichen Kreuzreaktivitäten wurde in der aktuellen Ringversuchsrunde auch eine der 4 Proben (# 1725382) mit einer nennenswerten Menge an Neisseria meningitidis versetzt. Auch hier zeigten sich erfreulicherweise bei keinem der Teilnehmer Kreuzreaktionen mit den eingesetzten Listeria spp. oder L. monocytogenes-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen.

Wie bereits in vorangegangenen Ringversuchsrunden wurden von den Teilnehmern ganz überwiegend Listeria monocytogenes-spezifische Testsysteme eingesetzt (n=29). Auch wenn dieser Ringversuch ja von seiner Bezeichnung her formell auf die Abprüfung von Listeria spp.-spezifischen PCR/NAT-Testverfahren abzielt, besteht hier die explizite Option einer differenzierten Befundmitteilung: Hält ein Teilnehmer lediglich ein L. monocytogenes-spezifisches NAT-Verfahren vor, so kann er dies über den Zusatzcode [71] im Ergebnisfeld angeben, und für die Erstellung des individuellen Zertifikats seitens INSTAND e.V. werden dann auch nur die L. monocytogenes-spezifischen Ergebnisse zur Bewertung herangezogen.

Von allen 32 Teilnehmern wurden Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen verwendet. Vermeintliche Inhibitionsereignisse bei der Aufarbeitung und Analyse der Ringversuchsproben wurden nicht beobachtet.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: DYNEX Real Time PCR MeningoPlex (1x), Liferiver L. monocytogenes Real Time PCR Kit (1x) und VIASURE S. agalactiae, L. monocytogenes, E.coli Real Time PCR Detection (1x).

Zuerst einmal, wie gehabt, eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für den Direktnachweis von MRSA-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise Nasen- oder Wundabstrichen) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen an entsprechenden Zielorganismen. Für interessierte Teilnehmer soll an dieser Stelle noch einmal explizit darauf hingewiesen werden, dass sich mit Testsystemen, die üblicherweise für die Kulturbestätigung von S. aureus und/oder MRSA ausgelegt sind, diese geringen Mengen nicht immer zuverlässig nachweisen lassen werden. Eine Teilnahme an diesem Ringversuch ist daher nur für solche diagnostischen Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von MRSA etabliert haben bzw. im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie an dieser Stelle bereits mehrfach thematisiert basieren einige der derzeit etablierten eigenentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum Direktnachweis von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial auf einer getrennten Erfassung von S. aureus-spezifischen Markern, Staphylokokkenspezies-spezifischen Markern und dem mecA Gen in der entsprechenden Nukleinsäurepräparation. Da sowohl bei S. aureus als auch bei Koagulase-negativen Staphylokokken das mecA-Gen für die phänotypische Ausprägung einer Methicillin-Resistenz verantwortlich ist, ist die Aussagekraft dieser PCR-gestützten Testsysteme für den Direktnachweis von MRSA aus nativem Patientenmaterial eingeschränkt, wenn beim Patienten eine gleichzeitige Besiedelung mit S. aureus und Koagulase-negativen Staphylokokken (die als klinische Isolate zumeist mecA-positiv sind) vorliegt. Einen attraktiven Ansatzpunkt zur Lösung dieses Problems bieten sog. SCCmec-basierte PCR-Testkonzepte, die auf dem Nachweis der SCCmec-Kassette innerhalb eines für S. aureus charakteristischen Genbereiches beruhen und die relativ gut konservierte Integrationsstelle der SCCmec-Kassette im S. aureus Genom als Zielsequenz verwenden.

Dass aber auch die SCCmec-basierten Testkonzepte gewisse Limitationen haben, konnte im Rahmen einiger früherer Ringversuche eindrucksvoll aufgezeigt werden: hier wurden bereits einige MRSA-Isolate mit selten vorkommenden SCCmec-Subtypen oder MSSA-Isolate mit einer an den jeweiligen Enden typischen SCCmec-Sequenz, aber mit einer natürlichen Deletion des üblicherweise innerhalb der SCCmec-Kassette vorhandene mecA-Gens versandt. Da wir uns im Rahmen dieser Ringversuchsserie zum Ziel gesetzt haben, primär die analytische Sensitivität und Spezifität (und somit die Routinetauglichkeit) der jeweils eingesetzten Testsysteme abzuprüfen, befanden sich im aktuellen Ringversuch neben einem klassischen und vermeintlich unkomplizierten cMRSA-Isolat ein „gewöhnliches“ MSSA-Isolat sowie wieder einmal eine Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies (eine Konstellation, die in der täglichen Praxis ja nicht gerade selten beobachtet wird…).

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 12) der statistischen Auswertung dargestellt, enthielt die Probe # 1725394 diesmal ein Gemisch aus einem S. aureus-Isolat (MSSA, PVL-negativ, ~5x10⁴ CFU/mL) und einer Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies (S. epidermidis; mecA-positiv, ~5x10⁴ CFU/mL), die Probe # 1725391 ein Methicillin-sensibles Staphylococcus aureus-Isolat (MSSA; mecA-negativ, PVL-negativ; ~5x10⁴ CFU/mL) und Probe # 1725392 eine relativ hohe Menge eines Methicillin-resistenten S. aureus-Patientenisolats (cMRSA; PVL-positiv; spa: t310; ~5x10⁵ CFU/mL). Die letzte der 4 Proben, # 1725393, enthielt neben humanem Zellmaterial lediglich eine nennenswerte Menge an E. coli.

Erfreulicherweise wurden im aktuellen Ringversuch bei der relativ stark positiven cMRSA-Probe # 1725392 nahezu von allen der 272 Teilnehmer durchweg korrekt positive PCR/NAT-Ergebnisse mitgeteilt und die entsprechende Richtigkeitsquote von über 98% kann man durchaus als respektabel bezeichnen. Der technische oder methodische Hintergrund der 4 falsch-negativen Ergebnisse bei dieser Probe ist seitens des Ringversuchsleiters nicht näher zu ergründen. Möglicherweise wurden von diesen 4 Teilnehmern selbstentwickelte (in-house) PCR-Testsysteme mit unzureichender analytischer Sensitivität eingesetzt oder es ging während der Probenaufarbeitung ein gewisser Anteil der Template-DNA bei der DNA-Isolierung oder der Komplettierung der PCR-Ansätze verloren. Angesichts der mit 5x10⁵ CFU/mL ehrlicherweise nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollten falsch-negative Ergebnisse bei Probe # 1725392 den betroffenen Ringversuchsteilnehmern durchaus Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihrer entsprechenden NAT-gestützten Testsysteme geben.

Die Probe # 1725391 mit nennenswerten Mengen eines Methicillin-sensiblen S. aureus-Isolats (MSSA) Isolats wurde ebenfalls von dem Großteil der 272 Teilnehmer richtig negativ für MRSA befundet. Bei den 8 falsch-positiven Ergebnissen für diese Probe könnte eventuell über laborspezifische Kontaminationsprobleme oder auch an eine simple Proben- bzw. Ergebnisverwechslung nachgedacht werden.

Im Vergleich zu früheren Ringversuchen mit vergleichbarer Probenkonstellation wurde bei Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies in Probe # 1725394 diesmal eine erfreulicherweise hohe Richtigkeitsquote erzielt. Von 245 der insgesamt 272 Teilnehmer wurde dieses Gemisch mit den jeweils eingesetzten Testsystemen korrekt als „MRSA-negativ“ befundet, weitere 9 Teilnehmer haben ihr Ergebnis bei dieser Probe als „fraglich“ klassifiziert. Von 7 dieser 9 Teilnehmer mit fraglichem Befund wurde explizit die Verwendung eines PCR-Testsystems angegeben, das auf einer getrennten Erfassung von S. aureus-spezifischen Markern und dem mecA-Gen beruht. Da mit dieser Art von Testsystemen zwar die Anwesenheit des mecA-Gens nachgewiesen werden kann, dessen Herkunft aber nicht zweifelsfrei dem Genom der ebenfalls nachgewiesenen S. aureus und/oder der Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies zugeordnet werden kann, ist in diesem Fall „fraglich“ auch das wissenschaftlich korrekte Untersuchungsergebnis.

Die restlichen Teilnehmer berichteten bei dieser Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies falsch-positive Ergebnisse für MRSA. Diesen 18 Teilnehmern mit falsch-positivem Ergebnis für Probe # 1725394 ist dringend anzuraten, ihre Testsysteme zu überprüfen bzw. die methodische Eignung ihres jeweiligen Testkonzepts zu hinterfragen. In der mikrobiologischen Praxis wird relativ häufig die gleichzeitige Anwesenheit einer Methicillin-resistenten (also mecA-positiven) Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies und eines Methicillin-empfindlichen (also mecA-negativen) S. aureus-Isolates in dem entsprechenden Abstrichmaterial beobachtet. In diesem Fall würden die Testsysteme der letztgenannten 18 Teilnehmer vermutlich fälschlicherweise einen Hinweis auf das Vorliegen einer MRSA-Infektion bzw. -Besiedelung anzeigen (mit allen hinlänglich bekannten Konsequenzen für den betroffenen Patienten!).

Wenn man sich die entsprechenden Richtigkeitsquoten für Probe # 1725394 in Tab. 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 12) nach Testkonzepten differenziert betrachtet, dann wird schnell ersichtlich dass alle der derzeit etablierten SCCmec-basierten Testsysteme bei diesem Gemisch korrekterweise MRSA-negative Befunde liefern (da das S. aureus-Genom der MSSA-Komponente ja de facto keine integrierte SCCmec-Kassette aufweist).

Bei der Probe ohne Zielorganismen (# 1725393), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt, wurde im Rahmen des aktuellen Ringversuchs nur von 5 der 272 Teilnehmer ein falsch-positives MRSA-Ergebnis beobachtet. Dabei liegt das Auftreten von sporadischen laborinternen Kontaminationsereignisses oder einer Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung nahe. Solche „Ausreißer“ sind bei technisch aufwändigen Ringversuchen mit über 200 Teilnehmern nichts Ungewöhnliches und bedürfen meines Erachtens keiner weiteren Diskussion, denn signifikante technische oder methodische Kreuzreaktionen von Staphylokokken- oder MRSA-spezifischen PCR/NAT-Protokollen mit E. coli-DNA sind meines Wissens bisher noch nicht berichtet worden.

Insgesamt bleibt festzuhalten, dass der erfreulich große Anteil von richtig-positiven Ergebnissen bei der positiven Probe sowie die überwiegend richtig-negativen Befunde bei den übrigen 3 MRSA-negativen Proben erneut für ein hervorragendes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminations- und Verschleppungsereignissen spricht.

Abgesehen von dem „Problemkind“ mit der Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies spricht die Ergebnislage dieses Ringversuchs erneut für eine hohe Zuverlässigkeit des NAT-gestützten Direktnachweises von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial. Für Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen interessiert sind, stehen mit den Proben dieses Ringversuchs wieder standardisierte Rückstellproben zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Optional wird im Rahmen unserer Ringversuchsreihe auch der molekulargenetische Nachweis des putativen Pathogenitätsfaktors PVL (Panton-Valentine-Leukozidin) bzw. dessen kodierende Gene lukF/S-PV abgefragt. Entsprechende Ergebnisse wurden von 46 der insgesamt 272 teilnehmenden Laboratorien mitgeteilt und mit Ausnahme eines Teilnehmers waren diesmal sowohl die negativen, als auch die positiven Ergebnisse für die molekularbiologische PVL-Testung durchweg korrekt. Nähere Informationen zu der nach wie vor hochaktuellen und in einzelnen klinischen Konstellationen bisweilen auch lebensbedrohlichen cMRSA bzw. CA-MRSA Problematik finden sich beispielsweise in [4] oder [5]. Ein gut evaluiertes real-time PCR Protokoll für den gezielten Nachweis von PVL-positiven S. aureus-Isolaten findet sich beispielsweise in [6]. Mittlerweile sind auch schon einige kommerzielle real-time PCR-Testsysteme für den zuverlässigen molekulargenetischen Nachweis von PVL-Genen bei MRSA- und MSSA-Isolaten verfügbar (z.B. von r-biopharm oder von TIB Molbiol).

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: HAIN Lifescience Genotype MRSA (5x), HAIN Lifescience Genotype Staphylococcus (2x), Amplex easyplex MRSA (4x), VIASURE Methicillin Resistent S. aureus Real Time PCR Detection Kit (1x), VELA diagnostics Sentosa SA Direct MRSA Test (1x), Congen SureFast MRSA 4Plex (1x) und Diarella MRSA real time PCR Kit TM von Gerbion (1x).

Eine wichtige Anmerkung wie immer vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Chlamydia pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen.

Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von C. pneumoniae-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 13) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal eine Probe mit relativ hoher Menge an entsprechenden Zielorganismen (# 1725403; Chlamydia pneumoniae, ~1x10⁶ IFU/ml) und eine Probe mit etwa hundertfach geringerer Menge (# 1725402; Chlamydia pneumoniae, ~1x10⁴ IFU/ml), eine Probe mit ca. ~1x10⁴ CFU/mL an Haemophilus influenzae (# 1725401), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1725404), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Aus den in der Tab. 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 13) aufgeführten Daten ist zu entnehmen, dass im aktuellen Ringversuch nahezu alle der insgesamt 109 Teilnehmer die Zielorganismen in der sehr stark positiven Probe # 1725403 (ca. 10⁶ IFU/mL) sicher und zuverlässig nachweisen konnten. Die Probe # 1725402 mit einer etwa hundertfach geringeren Menge an Zielorganismen (ca. 10⁴ IFU/mL) wurde erfreulicherweise ebenfalls mit lediglich zwei Ausnahmen als richtig positiv für C. pneumoniae-DNA befundet.

Da in vorausgegangenen Ringversuchen auch noch etwa zehnfach geringere Erregerlasten (ca. 10³ IFU/mL) zuverlässig detektiert werden konnten, sollte ein falsch-negatives Ergebnis der C. pneumoniae-haltigen Proben sicherlich zum Anlass genommen werden, die Performance des verwendeten Testsystems und ggfs. auch die Prozessabläufe bei der Präanalytik und der Probenaufarbeitung sogfältig zu hinterfragen. Für die Proben ohne C. pneumoniae-Zielorganismen # 1725401 (Haemophilus influenzae) und # 1725404 (Escherichia coli) ist im Vergleich zu den vorhergegangenen Ringversuchen die Anzahl falsch-positiver Befunde wieder etwas zurückgegangen.

Bei beiden beiden negativen Proben fand sich jeweils ein Teilnehmer, der diese fälschlicherweise als positiv bewertet hat. Hierbei dürfte es sich am ehesten um laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung handeln. Kreuzreaktivitäten der mitterweile gut etablierten und evaluierten C. pneumoniae-spezifischen PCR/NAT-Testsysteme mit DNA von E. coli oder H. influenzae erscheinen eher als unwahrscheinlich.

Diesmal wiesen nahezu alle der von den Teilnehmern eingesetzten Testsysteme oder PCR/NAT-Protokolle die im Rahmen der regulatorischen Vorgaben geforderten Inhibitionskontrollen auf, eine nennenswerte Inhibition wurde aktuell von keinem der Teilnehmer berichtet.

Selbstentwickelte in-house NAT-Testsysteme zur Detektion von C. pneumoniae-DNA wurden von 45 Labors eingesetzt, kommerzielle Assays wurden von 64 Teilnehmern verwendet.

Aufgrund des leider noch relativ geringen Anteils und der nicht durchgehenden Spezifizierung von kommerziellen Testsystemen innerhalb des Teilnehmerfeldes lassen sich derzeit keine seriösen Vergleiche zwischen bestimmten kommerziellen Kits und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität oder Kontaminationsanfälligkeit führen.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs wurde von 14 Teilnehmern die Verwendung des TIB Molbiol LightMix C. pneumoniae Testsystems, von 5 Teilnehmern der Diagenode MP/CP Kit und von 5 Teilnehmern der kommerzielle AmpliGnost CP PCR Kit angegeben.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Autoimmun Diagnostika Kits (7x), fast-track Diagnostics Kits (7x), Seegene Kits (5x), GeneProof C. pneumoniae PCR Kit (4x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (4x), ARGENE Chla/Myco pneumo r-gene (1x), Mikrogen ampliCube (1x), AmpliSens M. pneumoniae/C. pneumoniae (1x), VIASURE C. pneumoniae, M. pneumoniae, L. pneumophila Real Time PCR Detection Kit (1x), Sacace Biotechnologies C. pneumoniae Real-TM (1x) und PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x).

Aufgrund zahlreicher Rückfragen von Teilnehmern der vergangenen Ringversuche hier eine wichtige Anmerkung vorab: der Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Mycoplasma pneumoniae ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Mycoplasma pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut, wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial, konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Dieses Mal waren jedoch keine Proben mit geringen Mengen an Zielorganismen im ausgesandten Probenset vertreten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 14) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal zwei positive Proben: Probe # 1725413 mit einer hohen Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x10⁵ Genomkopien/mL) und Probe # 1725411 mit einer etwa zehnfach geringeren Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x10⁴ Genomkopien/mL). Proben # 1725412 und # 1725414 enthielten ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli. Mit 6 bzw. 3 Ausnahmen konnten die 122 Teilnehmer die DNA von M. pneumoniae in den Proben # 1725411 und # 1725413 nachweisen. Für die „negativen“, mit E. coli versetzten Proben (# 1725412 und # 1725414) wurden lediglich 2 falsch-positive Ergebnisse berichtet. Inhibitionskontrollen wurden von allen Teilnehmern mitgeführt, für keine der ausgesandten Proben wurden Inhibitionsereignisse berichtet.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs wurde von 30 Teilnehmern die Verwendung von kommerziellen Testkits aufgeführt: LightMix M. pneumoniae [n=15], Minerva Biolabs Venor Mp [n=2], AmpliGnost MP PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe [n=4], Diagenode MP/CP [n=5] und r-Biopharm RIDAGENE Mp [n=4], sowie „andere kommerzielle Testsysteme“ [n=44]. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: fast-track Diagnostics Kits (10x), GeneProof M. pneumoniae PCR Detection Kit (5x), Autoimmun Diagnostika CAP Bacterial Kit (5x), Autoimmun Diagnostika RDB2135 CAP Bakterien (1x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (4x), Seegene Allplex Respiratory Panel 4 (3x), Seegene Anyplex RB5 detection (1x), ARGENE Chla/Myco pneumo r-gene (1x), Mikrogen ampliCube (1x), AmpliSens M. pneumoniae/C. pneumoniae-FRP PCR Kit (1x), PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x), VIASURE C. pneumoniae, M. pneumoniae, L.pneumophila Real Time PCR Detection Kit (1x) und Ingenetix Bacto Real Mycoplasma pneumoniae (1x).

Auch hier wieder eine Anmerkung vorweg: Der kombinierte Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Coxiella burnetii & Bacillus anthracis ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Coxiella burnetii- und Bacillus anthracis-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben ((Tab. 1: Anhang 1 [Anh. 1], S. 15)) enthielt zwei Proben mit verschiedenen Mengen an C. burnetii (~1x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 1725424 und ~1x10⁵ Genomkopien/mL in Probe # 1725422), zwei Proben mit verschiedenen Mengen an Bacillus anthracis UR-1 Isolat-DNA (~1x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 1725421 und ~1x10⁵ Genomkopien/mL in Probe # 1725422), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1725423), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Der Übersichtlichkeit halber haben wir uns bei diesem kombinierten Ringversuch entschlossen, die Ergebnislage für die beiden unterschiedlichen Erreger auch in zwei getrennten Tabellen darzustellen: für C. burnetii in den Tabellen 2 und 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 15) sowie für B. anthracis in den Tabellen 4 und 5 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 16). Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Altona diagnostics RealStar Anthrax PCR Kit (1x) und VIASURE Tick Borne Diseases Real Time PCR Detection Kit (1x).

Coxiella burnetii: Wie bereits im vorausgegangenen Ringversuch gestaltet sich auch in der aktuellen Runde die Ergebnislage erfreulich. Die etwas stärker positive Probe # 1725422 (mit ca. 1x10⁵ Genomkopien C. burnetii/mL) wurde von 30 der insgesamt 31 Teilnehmern mit ihren jeweiligen C. burnetii-spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert. Das berichtete falsch-negative Ergebnis sollte in dem betroffenen Labor zum Anlass genommen werden, die Performance des verwendeten Testsystems zu hinterfragen und die Prozesse der Probenaufarbeitung ggfs. zu optimieren.

Die zweite positive Probe # 1725424 des Probesets (ca. 1x10⁴ Genomkopien/mL von C. burnetii) wurde von allen Labors korrekt berichtet. Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von C. burnetii DNA der Teilnehmer enthielten durchwegs eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Relevante Inhibitionsereignisse wurden nicht beobachtet.

Bacillus anthracis: Die Ergebnislage des Ringversuchs „Bacillus anthracis-DNA“ ist ebenfalls relativ schnell dargestellt. Alle 15 Teilnehmer konnten die beiden Proben mit Zielorganismen (# 1725421 und # 1725422) sowie eine der beiden Proben ohne Zielorganismen (# 1725424) korrekt bewerten. Für die zweite „negative“ (# 1725423) hingegen wurde ein fragliches Ergebnis berichtet, alle anderen Teilnehmer klassifizierten diese Probe korrekt als „negativ“.

Wie immer stehen nach erfolgreichem Abschluss der aktuellen Ringversuchsrunde den Kolleginnen und Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen für C. burnetii DNA und B. anthracis DNA interessiert sind, mit den Proben dieses Ringversuchs auch gewissermaßen „standardisierte Rückstellproben“ zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter (udo.reischl@ukr.de) bezogen werden können.

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Francisella tularensis“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Francisella tularensis-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen in einem Hintergrund aus humaner und Nicht-Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], p. 17) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben: Probe # 1725434 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (F. tularensis spp. tularensis, ~5x10⁵ CFU/mL), Probe # 1725433 mit ca. ~5x10⁴ CFU/mL an F. tularensis spp. tularensis und Probe # 1725432 mit ca. ~1x10⁴ CFU/mL an F. tularensis spp. novicida. Im Ringversuchsprobenset befand sich zudem eine Probe ohne Zielorganismen (# 1725431), die nur humane Zellen und E. coli enthielt.

Ähnlich wie bei vorausgehenden Ringversuchen haben auch hier alle der 18 Teilnehmer die relativ stark positiven Proben # 1725434 (F. tularensis spp. tularensis, ~5x10⁵ CFU/mL) und # 1725433 (F. tularensis spp. tularensis, ~5x10⁴ CFU/mL) als positiv identifiziert. Drei Teilnehmer berichteten die Probe mit der geringsten Menge des Zielorganismus (# 1725432, F. tularensis spp. novicida, ~1x10⁴ CFU/mL) fälschlich als negativ. Die drei falsch-negativen Bewertungen sollten Anlass geben, die individuelle Art der Probenaufarbeitung und das verwendete Testsystem bezüglich Sensitivität zu evaluieren und gegebenenfalls zu optimieren, denn die hier verwendete Menge des Zielorganismus in einer klinischen Probe mit nicht-Ziel DNA-Hintergrund sollte trotzdem sicher detektiert werden können.

Die F. tularensis-negative Probe # 1725431 wurde diesmal erfreulicherweise von allen Teilnehmern korrekt als „negativ“ klassifiziert. Die Ergebnislage deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus vorherigen Ringversuchen und spricht erneut für ein gutes Funktionieren der bei den jeweiligen Teilnehmern etablierten Testsysteme. Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von F. tularensis-DNA der Teilnehmer enthielten durchwegs eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Der seit 2015 in das reguläre Ringversuchsprogramm von INSTAND e.V. aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Carbapenemase-Gene“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zur molekularen Resistenztestung bzw. dem Direktnachweis von charakteristischen Carbapenemase-Genen aus DNA-Präparationen von Reinkulturen an Enterobacteriaceae konzipiert. Zum orientierenden Herantasten an die technische Eignung und die „Praktikabilität“ der versandten Probenmaterialien werden wir uns in den ersten Runden dieses methodisch anspruchsvollen Ringversuchs zur molekularen Resistenztestung auf die Abprüfung eines kleinen Spektrums der derzeit häufigsten Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae beschränken: KPC, VIM, OXA-48-ähnliche Gene, GES-Carbapenemasen, NDM, IMP und GIM. Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], p. 18) der Auswertung dargestellt, enthielt das aktuelle Set drei Proben mit Carbapenem-resistenten Enterobacteriaceae: Probe # 1725441 enthielt Citrobacter freundii-complex-Zielorganismen mit den Genen für KPC-3 und VIM-4 (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL), Probe # 1725442 enthielt Serratia marcescens-Zielorganismen mit dem OXA-48-Gen (ca. 1x10⁶ Genomkopien/mL) und Probe # 1725443 enthielt Enterobacter cloacae-complex Zielorganismen mit dem NDM-7 Gen (ca. 1x10⁶ Genomkopien/mL). Die vierte Probe # 1725444 war als eine Art von Negativkontrolle ausgelegt – sie enthielt lediglich E. coli ohne Carbapenemase-Gene.

Alle 62 Teilnehmer stellten erfreulicherweise ein Carbapenemase-Gen in den Proben # 1725441 und # 1725442 fest. Allerdings wurde dem KPC-3- und VIM-4-positiven Citrobacter freundii-complex (# 1725441) von einem Teilnehmer fälschlicherweise eine OXA-48-like Carbapenemase nachgesagt. Für die Probe mit NDM-7 positiven Enterobacter cloacae-complex (# 1725444) wurden 58 korrekte Ergebnisse berichtet. Hier heißt es aufpassen, 4 Teilnehmern gelang der Carbapenemase-Nachweis in dieser Probe nicht! Auch der Teilnehmer mit dem falsch-positiven Ergebnis für die „negative“ Probe # 1725444 sollte die Prozesse im Labor und die Performance des verwendeten Tests nochmals genau evaluieren, man bedenke die klinischen Konsequenzen eines fälschlicherweise Carbapenemase-positiv berichteten Enterobacteriaceae-Isolats!

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Direktnachweis von Carbapenemase-Genen enthielten mit einer Ausnahme jeweils eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: AmpliGnost Carbapenemase PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), Amplex eazyplex SuperBug complete A (1x), VIASURE CPE Carbapenemase Enterobacteriaceae Real Time PCR Detection Kit (1x) und Autoimmun Diagnostika RDB 2290 Carbapenemase (1x).

Der neu ins Ringversuchsprogramm aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Clostridium difficile“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Clostridium difficile-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 19) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben drei positive Proben: Probe # 1725453 mit einen relativ hoher Menge an Clostridium difficile, (~1x10⁵ CFU/mL), Probe # 1725451 mit ca. zehnfach geringerer Menge (~1x10⁴ CFU/mL) und Probe # 1725452 mit ca. 5x10³ CFU/mL an Clostridium difficile; sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1725454), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt. Die beiden „hochpositiven“ Clostridium difficile-Proben # 1725451 und # 1725453 wurden erfreulicherweise von allen bzw. 101 der 102 teilnehmenden Laboratorien korrekt als „positiv“ klassifiziert. Falsch-negative Ergebnisse sollten auch hier zum Anlass genommen werden, das verwendete Testsystem bzgl. analytischer Sensitivität und Spezifität zu evaluieren und auch die laborinternen Prozesse der Probenaufbereitung und -abarbeitung kritisch zu hinterfragen. Letzteres gilt insbesondere für den Teilnehmer mit falsch-positivem Ergebnisse für die lediglich E. coli-enthaltende Probe # 1725454. Eine Kreuzreaktion der verwendeten Testsysteme mit E. coli erscheint unwahrscheinlich, am ehesten sind Kreuzkontaminationen im Prozess der Probenbearbeitung ursächlich.

Probe # 1725452 enthielt mit ~5x10³ CFU/mL die geringste Menge des Zielorganismus und wurde von 93 Teilnehmern korrekt als positiv berichtet, leider wurden auch 8 falsch-negative Ergebnisse sowie ein „fragliches“ Ergebnis eingereicht. Hier sollte ggfs. die analytische Sensitivität des Testsystems hinterfragt werden. Inhibitionskontrollen wurden von allen Teilnehmern mitgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse wurden für keine der Proben berichtet. Wie in Tab. 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 19) angegeben, verwendeten der Großteil der Teilnehmer kommerzielle Testsysteme, während selbstentwickelte Testkonzepte in 11 Laboratorien zum Einsatz kam. In dieser Ringversuchsrunde zeigten sich (vergleichbar mit der vorausgegangenen) zwischen den kommerziellen Testsystemen und den Eigenentwicklungen keine signifikanten Unterschiede bezüglich Sensitivität und Spezifität.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: r-Biopharm RIDAGENE CD Toxin A/B (4x), r-Biopharm RIDAGENE Hospital Stool Panel (3x), Altona diagnostic RealStar C. difficile PCR Kit (3x), HAIN Lifescience GenoType CDiff (4x), HAIN Lifescience FluoroType CDiff (1x), Meridian Bioscience illumigene C. difficile (3x), Seegene Allplex GI Bacteria Assay (2x), AmpliGnost C. difficile Toxin A und B von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), fast-track Diagnostics C. difficile (1x), eazyplex C. difficile complete Assay (1x), Congen SureFast C. difficile 3Plex (1x) und QUIDEL AmpliVue C. difficile Assay (1x).

Der ins Ringversuchsprogramm aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Vancomycin-resistente Enerokokken“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an DNA Vancomycin-resistenter Enterokokken aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 20) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben zwei positive Proben: Probe # 1725463 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (Enterococcus faecium mit van B-Gen, ~5x10⁵ CFU/mL) und Probe # 1725462 mit ca. hundertfach geringerer Menge an Enterococcus faecium mit van A-Gen (~5x10³ CFU/mL). Im Ringversuchsprobenset befanden sich zudem zwei Proben ohne Zielorganismen (# 1725461 und # 1725464), die nur humane Zellen und E. coli enthielten. Erfreulicherweise wurden die positiven Proben # 1725462 (Enterococcus faecium mit van A-Gen, ~5x10³ CFU/mL) und # 1725463 (E. faecium mit van B-Gen, ~5x10⁵ CFU/mL) von 37 der 38 teilnehmenden Laboratorien korrekt als „VRE-positiv“ berichtet. Wie bereits im vorangegangenen Ringversuch waren alle eingereichten vanA/vanB-Differenzierungen korrekt. Der Teilnehmer mit falsch-positivem Ergebnis für die E. coli-enthaltende Probe # 1725461 sollte die Prozesse der Probenaufbereitung und -analyse kritisch hinterfragen. Bei den eingesetzten Testsystemen hielten sich kommerziell erhältliche, vorkonfektionierte Systeme und Eigenentwicklungen in etwa die Waage. Bezüglich analytischer Sensitivität und Spezifität waren keine signifikanten Unterschiede zu verzeichnen, wenngleich einschränkend angemerkt werden muss, dass für eine verlässlichere Beurteilung weitere Ringversuchsrunden abgewartet werden sollten.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: HAIN Lifescience GenoType Enterococcus (8x), Roche LightCycler VRE Detection Kit (1x), Amplex easyplex VRE (1x) und VIASURE Vancomicin Resistente Real Time PCR Detection Kit (1x).

Der Ringversuch Nr 560 „Pilzgenomnachweis PCR/NAT Pneumocystis jirovecii“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis von Pneumocystis jirovecii-DNA in geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Das aktuelle Set enthielt zwei positive Proben (siehe Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 21)): eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1725602; Pneumocystis jirovecii, ca. 1x10⁵ Zielorganismen/mL), eine Probe mit eine geringerer Menge (# 1725604; Pneumocystis jirovecii, ca. 5x10³ Zielorganismen/mL), sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 1725601 und # 1725603), die lediglich nennenswerte Mengen an E. coli in einer Suspension aus humanen Zellen enthielten.

Der Nachweis des Zielorganismus aus der stärker positiven Probe (# 1725602, ca. 1x10⁵ Zielorganismen bzw. Genomkopien /mL) gelang nahezu allen Teilnehmern. Probe # 1725603 mit einer ca. zwanzigfach geringeren Erregermenge wurde noch von 85 der insgesamt 87 Teilnehmer korrekt als „positiv“ identifiziert. Für die Teilnehmer mit falsch-negativen Befunden in dieser Ringversuchsrunde bleibt unser Appell unverändert bestehen, die Sensitivität der verwendeten Testsysteme zu hinterfragen, da aus der Sicht der molekulardiagnostischen Praxis eine Erregermenge von 5x10³ und vor allem 1x10⁵ Zielorganismen pro mL (wie in der Probe # 1725602) nicht als „äußerst gering“ einzuschätzen ist.

Bei den Proben ohne Zielorganismen (# 1725601 und # 1725603), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielten, wurden im Rahmen des aktuellen Ringversuchs lediglich von einem Teilnehmer bei der ersten Probe ein falsch-positives Ergebnis berichtet (Tab. 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 21)). Dies legt ein laborinternes Kontaminationsereignis oder eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung nahe und sollte eine sorgfältige Aufarbeitung nach sich ziehen. Andererseits sprechen die mehrheitlich richtig-negativen Ergebnisse für ein hervorragendes Funktionieren von test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationsereignissen im Teilnehmerkreis. Diesmal wiesen alle eingesetzten Testsysteme oder PCR/NAT-Protokolle der Teilnehmer die im Rahmen der regulatorischen Vorgaben geforderten Inhibitionskontrollen auf, eine nennenswerte Inhibition wurde von keinem der Teilnehmer berichtet. Bei den verwendeten Testsystemen lagen in-house Assays zahlenmäßig fast gleichauf mit kommerziellen Testsystemen. Unterschiede in Sensitivität, Spezifität oder Kontaminationsanfälligkeit waren nicht zu erkennen.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [26] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: fast-track Diagnostics Pneumocystis jirovecii (4x), Altona diagnostics RealStar P. jirovecii PCR Kit (4x), Biolegio ReadyMax AP-1 Assay (2x), AmpliSens Pneumocystis jirovecii FRT (1x), SureFast P. jirovecii PLUS (1x) und VIASURE P. jirovecii Real Time PCR Detection (1x).

Wie gehabt möchten wir uns an dieser Stelle recht herzlich bei allen Kollegen in den zahlreichen nationalen und internationalen Sollwertlaboratorien sowie bei den Kollegen und Mitarbeitern in Jena, Salzburg, Hamburg, Oberschleißheim, Bonn, Dresden, München, Berlin, Bochum und Regensburg bedanken, die nach wie vor hochmotiviert an der praktischen Umsetzung unseres gemeinsamen Vorhabens zur externen Qualitätssicherung mitarbeiten.

Zugleich hoffen wir weiterhin auf rege Teilnahme und einen reibungslosen Ablauf der zukünftigen Ringversuchsrunden.