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GMS Zeitschrift zur Förderung der Qualitätssicherung in medizinischen Laboratorien

Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in medizinischen Laboratorien e. V. (INSTAND e. V.)

ISSN 1869-4241

Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis PCR/NAT: Auswertung des Ringversuchs November 2015 von INSTAND e.V. zur externen Qualitätskontrolle molekularbiologischer Nachweisverfahren in der bakteriologischen Diagnostik

Report

  • corresponding author Udo Reischl - Institut für Klinische Mikrobiologie und Hygiene, Universitätsklinikum Regensburg, Deutschland
  • Wulf Schneider - Institut für Klinische Mikrobiologie und Hygiene, Universitätsklinikum Regensburg, Deutschland
  • Martin Ehrenschwender - Institut für Klinische Mikrobiologie und Hygiene, Universitätsklinikum Regensburg, Deutschland
  • Andreas Hiergeist - Institut für Klinische Mikrobiologie und Hygiene, Universitätsklinikum Regensburg, Deutschland
  • Matthias Maaß - Labor Dr. Heidrich und Kollegen MVZ GmbH, Hamburg, Deutschland
  • Eberhard Straube - Institut für Medizinische Mikrobiologie, Klinikum der Friedrich-Schiller-Universität Jena, Deutschland
  • Dimitrios Frangoulidis - Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr, München, Deutschland
  • Gregor Grass - Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr, München, Deutschland
  • Heiner von Buttlar - Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr, München, Deutschland
  • Wolf Splettstößer - Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr, München, Deutschland
  • Volker Fingerle - Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Oberschleißheim, Deutschland
  • Andreas Sing - Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Oberschleißheim, Deutschland
  • Enno Jacobs - Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Technische Universität Dresden, Deutschland
  • Ingrid Reiter-Owona - Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Parasitologie (IMMIP), Universitätsklinikum Bonn, Deutschland
  • Martin Kaase - Nationales Referenzzentrum für Gram-negative Krankenhauserreger, Abteilung für Medizinische Mikrobiologie, Ruhr-Universität Bochum, Deutschland

GMS Z Forder Qualitatssich Med Lab 2015;6:Doc05

doi: 10.3205/lab000020, urn:nbn:de:0183-lab0000201

Dieses ist die deutsche Version des Artikels.
Die englische Version finden Sie unter: http://www.egms.de/en/journals/lab/2015-6/lab000020.shtml

Veröffentlicht: 22. Dezember 2015

© 2015 Reischl et al.
Dieser Artikel ist ein Open-Access-Artikel und steht unter den Lizenzbedingungen der Creative Commons Attribution 4.0 License (Namensnennung). Lizenz-Angaben siehe http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.


Zusammenfassung

Der vorliegende Beitrag liefert einen Auswertungsbericht der jüngsten Ringversuchsserie „Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis PCR/NAT“. Er fasst die Zielwerte, einige Bezugsgrößen und die Gesamtbewertung der Ergebnisse aller teilnehmenden Laboratorien zusammen.

Diese hochwillkommene Versuchsreihe zur externen Qualitätskontrolle (EQAS, external quality assessment scheme) von Methoden der molekularen Diagnostik auf dem Gebiet der medizinischen Mikrobiologie wurde 2002 von der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM) angestoßen und wird seither von Instand e.V., Düsseldorf organisiert. Dieses Segment der INSTAND e.V.-Ringversuchsserie wird für diagnostische Laboratorien weltweit angeboten. Unser Ringversuchskonzept entspricht der aktuellen Richtlinie der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen (RiLiBÄK), Teil B3, und basiert auf zwei Validierungsrunden pro Jahr (im Frühjahr und Herbst) unter einer permanent wachsenden Abdeckung der relevanten bakteriellen und fungalen humanpathogenen Erreger. Die entsprechenden Sets von Quality Control (QC)-Proben können dabei neben negativen Proben auch einige stark-positive Proben, Proben mit klinischen Varianten oder eng mit den Zielorganismen verwandte Spezies oder klinische Isolate enthalten. Weitergehende Informationen sowie die statistisch aufgearbeiteten und dokumentierten Ergebnisse der vergangenen Runden dieser Ringversuchsserie „Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis (PCR/NAT)“ können auf der Homepage von Instand e.V. (http://www.instandev.de) eingesehen werden. Obwohl die bevorzugte Sprache dieser Dokumente deutsch ist, streben wir an, zumindest eine kurze Diskussion der Ergebnisse sowie die wichtigsten wissenschaftlichen Aspekte in Englisch bereitzustellen und die Tabellen zweisprachig zu gestalten.


Gesamtübersicht und Auswertung der Ringversuchsergebnisse aller Teilnehmer

Nach erfolgreicher Etablierung dieser neuen Ringversuchs-Serie wollen wir hier auch für Kolleginnen und Kollegen, die bisher noch nicht an diesen Ringversuchen teilgenommen haben, die Ergebnisse der aktuellen Ringversuche für den PCR/NAT-gestützten Nachweis von Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, EHEC/STEC, Borrelia burgdorferi sensu lato, Legionella pneumophila, Salmonella enterica und Listeria spp., MRSA bzw. cMRSA, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetti, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Pneumocystis jirovecii (vorm. P. carinii) und der molekularen Resistenztestung für Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae sowie die beiden vor kurzem neu ins Programm aufgenommenen Ringversuche zum PCR/NAT-gestützten Nachweis von Clostridium difficile (Toxingene) und VRE (Vancomycin-resistente Enterokokken) darstellen und kurz diskutieren.

Für nähere Informationen über die Zusammensetzung der Ringversuchsproben, dem Sinn und Zweck dieser neuen Möglichkeit zur externen Qualitätskontrolle im Umfeld der Nukleinsäurediagnostik sowie zu den Eckdaten unseres flexiblen Ringversuchskonzepts sei hier auf unsere initiale Veröffentlichung in der Zeitschrift „Der Mikrobiologe“ verwiesen [1]. Gerne werden wir hier auch weiterhin in regelmäßigen Abständen und in ähnlicher Form über die Ergebnislage, Auswertung und Analyse unser zukünftigen Ringversuche berichten.

Wie bei allen anderen Ringversuchen erfolgt die Anmeldung zu ausgewählten Teilen der Reihe „Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis (PCR/NAT)“ über die Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in Medizinischen Laboratorien (INSTAND e.V.), Düsseldorf (http://www.instandev.de/). Nach Abschluss des jeweiligen Ringversuchs werden die Ergebnisse der einzelnen Teilnehmer dort zentral erfasst und anhand von individuellen Bewertungskriterien werden die schriftlichen Zertifikate erstellt. Zusätzlich stehen für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe weiterer Informationen auch im Internet unter http://www.udo-reischl.de, Unterpunkt „INSTAND-Ringversuche (PCR/NAT)“, sowie auf der Homepage von INSTAND e.V. als pdf-Files zum freien Download bereit.

Neben der Aussendung von lyophilisierten Probenmaterialien zur systematischen Abprüfung von NAT-gestützten Testsystemen für derzeit 16 unterschiedliche bakterielle und fungale Zielorganismen bzw. Pathogenitätsfaktoren gab es im Rahmen dieser Ringversuchsrunde auch wieder gewisse „Highlights“. So wurde beispielsweise im aktuellen RV 536 Legionella pneumophila zwei Proben mit der Spezies Legionella micdadei versandt, die von vielen unserer Ringversuchsteilnehmer fälschlicherweise als PCR-positiv getestet wurden.

Als weiteres „Highlight“ innerhalb der aktuellen Ringversuchsrunde wurde in einer der 4 Einzelproben des RV 539 MRSA/cMRSA ein mecC-positives MRSA-Isolat ausgesandt, das erwartungsgemäß nur von ca. einem Drittel der Teilnehmer mit ihren MRSA-spezifischen PCR-Testsystemen detektiert werden konnte. Im gleichen Probenset befand sich diesmal auch eine sog. mecA dropout Mutante bei der die SCCmec-Kassette zwar im S. aureus-Genom integriert vorliegt (d.h. die SCCmec-orfX-Übergangsregion, die bei den meisten der derzeit kommerziell erhältlichen MRSA-spezifischen PCR-Testsystemen als molekularer Surrogatmarker für die Anwesenheit eines mecA-Gens verwendet wird, ist in diesem Isolat also vorhanden), aber bei der das mecA-Gen großteils deletiert und daher phänotypisch nicht mehr funktionell ausgeprägt ist. Auch wenn solche mecA-Deletionsmutanten derzeit zumindest in unseren Breiten noch eher selten beobachtet werden, so soll mit der Mitführung dieses Isolats bei den Teilnehmern und innerhalb der Leserschaft dieser Ringversuchsdiskussion zumindest das Bewusstsein für das mögliche Vorkommen solcher MSSA-Isolate geweckt werden, die „leere“ SCCmec-Kassetten tragen. Diese Beobachtung bestätigt erneut die Sinnhaftigkeit und auch Notwendigkeit des im Rahmen der PCR/NAT-Ringversuchsdiskussionen bereits mehrfach thematisierten begleitenden kulturellen Nachweises von MRSA.

Die Aussendung des B. anthracis Stamm Pasteur (positiv für das Virulenzplasmid pXO2 und die B. anthracis-spezifischen chromosomalen Sequenzmarker rpoB und dhp61, jedoch negativ für das lethal- und edema-factor, sowie protective antigen-(pagA)-tragende Virulenzplasmid pXO1) in einer der 4 Proben des Ringversuchs RV 542: Coxiella burnetii & B. anthracis führte diesmal nur zu einem falsch-negativen Ergebnis innerhalb der Teilnehmerschaft.

Mit der Auswahl eines etwas breiteren Spektrums von relevanten Carbapenemase-Genen bestätigte sich im Rahmen des neu eingeführten Ringversuchs RV 544 Carbapenemase-Gene die Vermutung, dass viele der derzeit verwendeten Testsysteme zur molekularen Carbapenem-Resistenztestung noch gewisse Lücken hinsichtlich der Abdeckung von unterschiedlichen Carbapenemase-Genen aufweisen. So wurde das OXA-181-Gen in einer der Ringversuchsproben nur von ca. zwei Drittel und das IMP-14-Gen nur von einem Drittel der Teilnehmer mit ihren spezifischen Testsystemen erkannt.

Alle Teilnehmer sind natürlich weiterhin dazu aufgerufen, attraktive Parameter für eine zukünftige Erweiterung des Spektrums an Zielorganismen vorzuschlagen und deren mögliche Umsetzung mit dem Ringversuchsleiter zu diskutieren.


Untersuchungsergebnisse November 2015

Entsprechend des Grundgedankens unserer Ringversuchsaktivitäten wurde auch bei der Konzeption des aktuellen Ringversuchs zum „Bakteriengenomnachweis mittels PCR oder anderer Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT)“ bei einigen Zielorganismen der Versand von Proben mit relativ niedrigen Erregerzahlen angestrebt.

In den aktuellen Ringversuchssets befanden sich daher erneut einige Proben mit relativ geringer Menge folgender Zielorganismen: Helicobacter pylori (Probe # 1525331), Borrelia burgdorferi sensu stricto (Probe # 1525351 und Probe # 1525354), Legionella micdadei (Probe # 1525364), Listeria monocytogenes (Probe # 1525384), Chlamydia pneumoniae (Probe # 1525401), Coxiella burnetii (Probe # 1525421), Francisella tularensis (Probe # 1525434), Clostridium difficile (Probe # 1525452), sowie Pneumocystis jirovecii (Probe # 1525602).

Im Rahmen der Testentwicklung bzw. Testoptimierung können diese Probensätze, u. a. als Qualitätskontrollen oder als standardisierte Sensitivitätsmarker, für die Austestung der unteren Nachweisgrenze von eigenentwickelten Nukleinsäure-gestützten Testsystemen dienen.

An dieser Stelle möchten wir auch darauf hinweisen, dass zahlreiche Rückstell-Probensätze der früheren Ringversuche noch verfügbar sind, und bei Bedarf über den Ringversuchsleiter formlos nachbestellt werden können.

Mit Ausnahme der zuvor erwähnten „grenzwertig positiven“ Einzelproben wurden die Mengen der entsprechenden Zielorganismen in den Probensätzen der aktuellen Ringversuchsrunde wieder relativ deutlich über der Nachweisgrenze von „durchschnittlich sensitiven PCR/NAT-Testkonzepten“ eingestellt. Diese definieren wir wie folgt: als Richtwert für die Bewertung von Ringversuchsergebnissen gilt das 10- bis 50-fache der unteren Nachweisgrenze durchschnittlich sensitiver PCR-Protokolle unter Standardbedingungen (50 µl Block-Cycler Reaktionsansätze, 35 PCR-Zyklen, ggf. entsprechende real-time PCR Protokolle; gut evaluierte Primersequenzen).

Bei den meisten Probenmaterialien der aktuellen Ringversuchsrunde stellen falsch-negative Ergebnisse damit einen deutlichen Hinweis auf ernstzunehmende Mängel innerhalb der eingesetzten Verfahren zur Nukleinsäure-Extraktion, Amplifikation und Detektion dar.

Falsch-positive Ergebnisse sind dagegen in der Regel als Hinweis auf eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung und/oder auf mangelnde Spezifität der eingesetzten Testsysteme zu betrachten.

In bewährter Form werden im Folgenden die Ergebnisse der jeweiligen erregerspezifischen Ringversuche dargestellt. Die Tabellen 1 (Anhang 1 [Anh. 1]) zeigen dabei die Probenzusammensetzung und das erwartete Ergebnis (Sollwert) mit den entsprechenden Codenummern der Ergebnisbögen. Die von den einzelnen Teilnehmern mitgeteilten Ergebnisse werden in den Tabellen 2 (Anhang 1 [Anh. 1]) nach der Häufigkeit der Mitteilung von positiven oder negativen Ergebnissen, und in den Tabellen 3 (Anhang 1 [Anh. 1]) nach der absoluten Anzahl der richtig positiven und richtig negativen Ergebnisse, sowie deren prozentualem Anteil (Befundhäufigkeit) je Amplifikationssystem bzw. Testkonzept aufgeschlüsselt.

Für die objektive Bewertung von kommerziellen Testsystemen sollten neben der rein statistischen Betrachtung der mitgeteilten Ringversuchsergebnisse auch die Anzahl und vor allem die methodische bzw. technische Qualifikation der individuellen Teilnehmer berücksichtigt werden. Da wir im Zuge unserer Ringversuche aber das gesamte Spektrum von spezialisierten Expertenlabors bis hin zum „Gelegenheitsanwender“ abdecken, müssen die arithmetisch ermittelten Richtigkeitsquoten bei der Bewertung einzelner Testsysteme immer mit einem gewissen Toleranzbereich betrachtet werden.

V 530: Neisseria gonorrhoeae & Chlamydia trachomatis

Die Ergebnislage des aktuellen Ringversuchs deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus vorangegangenen Ringversuchen zum kombinierten NAT-gestützten C. trachomatis- und Gonokokken-Nachweis. Trotz der relativ geringen Erregermenge in den vier unterschiedlich zusammengesetzten positiven Proben führte auch diesmal die Verfügbarkeit gut evaluierter und zum Teil automatisierter NAT-gestützter Analysesysteme für Chlamydia trachomatis zu hohen Richtigkeitsquoten sowohl für positive, als auch für negative Befunde.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt jeweils eine Probe mit ca. ~1x104 IFU/mL an C. trachomatis (# 1525301), eine Probe mit einer ca. 10-fach höheren Menge an C. trachomatis (# 1525304, ~1x105 IFU/mL), eine Probe (# 1525301) mit ca. 1x104 CFU/mL an N. gonorrhoeae sowie eine Probe mit einer ca. 10-fach höheren Menge an N. gonorrhoeae-Zielorganismen (# 1525302; ~1x105 CFU/mL).

Der Übersichtlichkeit halber werden wir bei diesem kombinierten Ringversuch (CT/NG) die Ergebniskonstellation zukünftig in 7 getrennten Tabellen darstellen. Damit wird die diagnostische Performance der jeweiligen Testsysteme beim Nachweis von CT und NG aussagekräftiger (Anhang 1 [Anh. 1], S. 1-3: Tabelle 4: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei CT, Tabelle 6: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei NG; jeweils gefolgt von den Richtigkeitsquoten nach aufgeführten Testsystemen in den Tabellen 5 und 7).

Auch wenn die schwach positive Probe # 1525301 des aktuellen Ringversuchs diesmal nur mit einer relativ geringen Menge an C. trachomatis-Zielorganismen versetzt worden war, fanden sich unter den von insgesamt 202 Teilnehmern mitgeteilten NAT-Ergebnissen für C. trachomatis diesmal erfreulicherweise keine falsch-negativen Ergebnisse. Bei der ca. 10-fach stärker CT-positiven Probe # 1525304 des aktuellen Probensets wurden von den 202 Teilnehmern diesmal nur insgesamt ein falsch-negatives Ergebnis mitgeteilt. Da hier von einem Großteil der Anwender mit den unterschiedlichsten Testsystemen durchweg korrekte Ergebnisse berichtet wurden, handelt es sich bei dem falschen Ergebnis vermutlich um Ringversuchstypische „sporadische Ausreißer“. Der betreffende Teilnehmer führte auf seinem Ergebnisformular die Verwendung eines „other commercial tests“ an. Für die beiden C. trachomatis-negativen Proben # 1525301 und # 1525303 fanden sich diesmal 3 falsch-positive Ergebnisse.

Im Rahmen des NAT-gestützten Gonokokken-Nachweises wurden für die beiden positiven Proben # 1525301 und # 1525302 (N. gonorrhoeae; ca. 1x104 bzw. 1x105 CFU/mL) diesmal nur von zwei der insgesamt 202 Teilnehmer jeweils ein falsch-negatives Ergebnisse für Gonokokken DNA mitgeteilt. Bei den beiden GO-negativen Proben wurden jedoch von 5 bzw. 2 Teilnehmern falsch-positive Ergebnisse berichtet. Dieser im Vergleich zu früheren Ringversuchsrunden doch überraschend hohe Anteil an falsch-positiven Ergebnissen deutet auf Kontaminationsereignisse bei der Probenaufbereitung und -abarbeitung hin. Den betroffenen Laboratorien sollten diese Ergebnisse Anlass geben, ihren individuellen diagnostischen Workflow hinsichtlich der Kontaminationssicherheit während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik zu überprüfen und gegebenenfalls zu optimieren.

Angesichts der mit 1x104 bzw. 1x105 IFU/mL ehrlicherweise nicht als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen in den CT-positiven Proben # 1525301 und # 1525304 sowie 1x104 bzw. 1x105 CFU/mL an Zielorganismen in den GO-positiven Proben # 1525301 und # 1525302 sollten falsch-negative Ergebnisse bei betroffenen Ringversuchsteilnehmern ebenfalls Anlass zur Optimierung ihrer jeweiligen spezifischen NAT-gestützten Testsysteme geben.

Da die beobachteten „Sensitivitätsprobleme“ diesmal nur äußerst marginal ausfallen, sich offensichtlich nicht auf bestimmte Testkonzepte eingrenzen lassen und sporadisch durch das ganze Portfolio der eingesetzten Testsysteme gehen, kann dem großen Rest des Teilnehmerfeldes erneut eine erfreulich gute analytische Sensitivität und Spezifität ihrer CT- und GO-spezifischen NAT-Testsysteme, sowie der angewandten Prozeduren zur Probenaufarbeitung und -prozessierung attestiert werden.

Angesichts der streng normierten und standardisierten Abarbeitungsprotokolle von kommerziellen Testsystemen bleibt es für den Ringversuchsleiter jedes Mal aufs Neue verwunderlich, dass ein nennenswerter Anteil der teilnehmenden Laboratorien mit den betroffenen Testsystemen erfolgreich die vorgegebenen Zielwerte erreicht. Ohne denjenigen Teilnehmern, die mit bestimmten kommerziellen Testsystemen die Zielwerte nicht erreichen, zu nahe treten zu wollen, deutet dieser Umstand in diesen Fällen dann wohl eher auf individuelle Abweichungen vom Protokoll oder bestimmte Fehler bei der Probenabarbeitung, als auf intrinsische Unzulänglichkeiten, der in der Regel gut evaluierten Testsysteme hin.

Ich glaube, es ist auch für den Leser dieser Ringversuchsdiskussion weitgehend nachvollziehbar, dass wir als Organisatoren von Testkonzept- und Testplattform-übergreifenden Ringversuchen bei der Konfektionierung unserer Probenmaterialien leider nicht jede Besonderheit im Abarbeitungsprotokoll von kommerziellen Testsystemen berücksichtigen oder unterschiedliche Arten von Ringversuchsprobenmaterial für bestimmte Testsysteme bereitstellen können.

Auf diesen Umstand wurde bereits bei früheren Ringversuchen mehrfach im Zusammenhang mit den RNA-Zielsequenzen der AMPLIFIED CT Testkits oder der APTIMA COMBO 2 Testkits (Hersteller: Gen-Probe Inc.) hingewiesen. Werden von Teilnehmern bestimmte NAT-Testsysteme eingesetzt, die erregerspezifische RNA-Zielsequenzen nachweisen oder auf einem RNA-basierten Amplifikationsprozess (TMA; Transcription-Mediated Amplification, o.ä.) beruhen, so kann mit dem hier versandten Probenmaterial offiziell keine regelgerechte Abprüfung der entsprechenden Sensitivitäten unter Routinebedingungen gewährleistet werden. Aber selbst wenn das Herstellungsverfahren unserer Ringversuchsproben primär nicht auf die Stabilisierung von RNA-Molekülen hin optimiert und getestet wurde, so konnten dennoch sowohl bei der aktuellen, wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchsrunden, von vielen Teilnehmern mit RNA-gestützten Testsystemen hohe Richtigkeitsquoten erzielt werden. Aktuell wurden sowohl die C. trachomatis- als auch die Neisseria gonorrhoeae-Zielorganismen von allen 10 Teilnehmern mit RNA-basierten Gen-Probe-Testsystemen erfolgreich nachgewiesen.

Entsprechende Inhibitionskontrollen wurden von allen 202 Teilnehmern durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal nicht mitgeteilt.

Bei den ermittelten Richtigkeitsquoten für Teilnehmer mit dem Roche COBAS Amplicor, COBAS TaqMan, dem Becton Dickinson ProbeTec, Abbott RealTime CT/NG, Artus CT, LightMix CT/NG oder anderen Testsystemen muss berücksichtigt werden, dass im Rahmen dieser Ringversuchsauswertung in Tab. 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 1) nicht zwischen dem spezifischen Nachweis von Chlamydien und Gonokokken differenziert wurde. Mit dem Großteil dieser kombinierten Testsysteme wurden insgesamt erfreulich hohe Richtigkeitsquoten sowohl für die positiven als auch für die negativen Ergebnisse beobachtet. Um diesmal und auch zukünftig eine detaillierte Bewertung der C. trachomatis- und GO-spezifischen NAT-Komponenten dieser kombinierten Testsysteme zu ermöglichen, haben wir zusätzlich die Tabellen 4 bis 7 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 2-3) angefertigt. In den Tabellen 4 und 5 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 2) sind dabei nur die C. trachomatis (CT)-spezifischen Ergebnisse und in den Tabellen 6 und 7 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 3) nur die Neisseria gonorrhoeae (GO)-spezifischen Ergebnisse dargestellt und statistisch ausgewertet.

Anmerkung: Bevor durch einen kurzen Blick auf die prozentualen Richtigkeitsquoten in diesen Tabellen ein eventuell etwas zu voreiliger Rückschluss auf die diagnostische „Performance“ bestimmter kommerzieller Testsysteme gezogen wird, sollten erst die effektiven Teilnehmerzahlen berücksichtigt werden, die den dargestellten Richtigkeitsquoten arithmetisch zugrunde liegen.

Im handschriftlichen Kommentarfeld der Ergebnisformulare wurden unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: HAIN Lifescience FluoroType CT (13x), HAIN Lifescience FluoroType NG (11x), HAIN Lifescience GenoQuick CT (1x), GeneProof N. gonorrhoeae PCR Kit (7x), GeneProof C. trachomatis PCR Kit (5x), VERSANT CT/GC DNA Assay von Siemens (3x), Amplex Hyplex STD Chlamydia und Neisseria (2x), Urethritis basic von fast-track Diagnostics (2x), Bioron RealLine C. trachomatis/N. gonorrhoeae (2x), Sacace Biotechnologies N. gonorrhoeae Real-TM (2x), Sacace Biotechnologies C. trachomatis Real-TM (2x), Seegene Anyplex™ II STI-7 Detection (2x), Mikrogen Diagenode N. gonorrhoeae Real Time PCR kit (2x), Mikrogen Diagenode C. trachomatis Real Time PCR kit (1x), QIAGEN artus CT/GC QS-RGQ Kit (1x), Aptima Combo 2 assay CT/GC (1x), Elisabeth Pharmacon EliGene Neisseria UNI Kit (1x), N. gonorrhoeae Amplex Multiplex PCR-ELISA (1x), Medac/Goffin CT/NG Assay (1x), C. trachomatis RG detect von Institute of Applied Biotechnologies (1x) und N. gonorrhoeae RG detect von Institute of Applied Biotechnologies (1x).

Unabhängig von der Art des verwendeten Testsystems soll in diesem Zusammenhang auch noch einmal darauf hingewiesen werden, dass in Gegenwart von relativ hohen Mengen an Zielorganismen (bzw. deren Nukleinsäure) die interne Kontrollreaktion aufgrund der „Konkurrenzsituation“ mit der Amplifikation der eigentlichen Zielsequenz durchaus negativ ausfallen kann, obwohl keine Inhibition der PCR-Reaktion im eigentlichen Sinne vorliegt.

RV 531: Chlamydia trachomatis

Das aktuelle Ringversuchsset enthielt diesmal eine Probe mit ca. 1x104 IFU/mL an C. trachomatis (# 1525312), eine Probe mit ca. 1x105 IFU/mL an C. trachomatis (# 1525314) sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 1525311 und # 1525313), die ausschließlich nicht infizierte Zellen und Escherichia coli enthielten.

Wie Tab. 2 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 4) der statistischen Auswertung zu entnehmen ist, wurden von den insgesamt 99 Teilnehmern bei den zwei positiven und den zwei negativen Proben überwiegend korrekte Ergebnisse mitgeteilt. Bei den beiden negativen Proben # 1525311 und # 1525313, die ausschließlich nicht infizierte Humanzellen und Escherichia coli enthielt, sollten die falsch-positiven Ergebnisse bei den vier betroffenen Ringversuchsteilnehmern jedoch Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihres DNA-Isolierungsprozesses bzw. des jeweiligen Chlamydia trachomatis-spezifischen NAT-gestützten Testsystems geben. Bei der anzunehmenden sequenziellen Abarbeitung der vier Einzelproben deutet diese Ergebniskonstellation diesmal eher nicht auf Kontaminationsereignisse bei der Probenaufbereitung durch Verschleppung von positivem Probenmaterial oder Nukleinsäure aus den Proben # 1525312 oder # 1525314 hin.

Die markante Übereinstimmung der aktuellen Ergebniskonstellation mit den Beobachtungen und Richtigkeitsquoten vorhergegangener Ringversuche mit ähnlicher Menge an C. trachomatis-Zielorganismen kann, zumindest indirekt, erneut als Beleg für eine hohe Zuverlässigkeit und Konstanz der eingesetzten Testsysteme und der Probenabarbeitung angesehen werden.

Auch wenn mit ca. 1x104 IFU/mL an Zielorganismen im Probenmaterial die untere Nachweisgrenze hochsensitiver und standardisierter PCR/NAT-gestützter Testsysteme noch nicht erreicht oder unterschritten sein sollte, sollten bei Ringversuchsteilnehmern mit hohem Anspruch an die individuelle Testsensitivität sowohl falsch-negative, als auch falsch-positive Ergebnisse Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihres jeweiligen NAT-gestützten Testsystems geben. Angesichts der nach wie vor anhaltenden Diskussion um das „Pooling“ von entsprechendem Untersuchungsmaterial bleibt der Aspekt der analytischen Sensitivität der jeweils eingesetzten Testsysteme bedeutsam.

Inhibitionskontrollen wurden von allen 99 Teilnehmern durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal nicht mitgeteilt. In diesem Zusammenhang sei kurz angemerkt, dass wir auch im aktuellen Ringversuch keine der Einzelproben absichtlich mit inhibitorischen Substanzen versetzt haben. Erfreulicherweise waren im Rahmen dieses Ringversuchs im Großen und Ganzen keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität und Spezifität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und den selbstentwickelten in-house-Testsystemen zu beobachten. Trotz der relativ geringen Menge an Zielorganismen bewegten sich die Richtigkeitsquoten dabei durchweg auf hohem Niveau mit geringer statistischer Streuung.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. folgende Testsysteme aufgeführt: GeneProof C. trachomatis PCR Kit (3x), HAIN Lifescience GenoQuick CT (3x), Autoimmun Diagnostika Gen ID STD Kit (2x), AmpliSens C. trachomatis (1x), Sacace Biotechnologies C. trachomatis Real-TM (1x), QIAGEN Chlamydiaceae (XII species) quantification kit (1x), VERSANT CT/GC DNA Assay von Siemens (1x) und AmpliGnost C. trachomatis PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x).

RV 532: Bordetella pertussis

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1525322; B. pertussis, ~1x104 CFU/ml), eine Probe mit einem klinischen Isolat von Bordetella bronchiseptica (# 1525321 mit 1x105 CFU/mL), und eine Probe mit einem klinischen Isolat von Bordetella parapertussis (# 1525324 mit 1x105 CFU/mL) als zum Zielorganismus verwandte Spezies. Die Probe # 1525323 enthielt diesmal keine Bordetellen, sondern lediglich E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen.

Wie schon im letzten Ringversuch bereitete der Nachweis von Bordetella pertussis-DNA in der Probe # 1525322 den Teilnehmern keine allzu großen Schwierigkeiten. Bei einer Erregermenge von ~1x104 CFU/mL wurden hier nur von zwei der insgesamt 146 Teilnehmer falsch-negative Ergebnisse berichtet. Bei einer Menge von 104 CFU/mL an B. pertussis-Zielorganismen (entspricht ca. 103 CFU in dem für PCR-Untersuchungen typischerweise prozessierten Probenvolumen von 100 µL) liegt man deutlich über den in früheren Ringversuchsrunden beobachteten unteren Nachweisgrenzen entsprechender PCR-Testsysteme.

In der mikrobiologischen Praxis sind vor allem bei Rachenabstrichen gelegentlich auch geringe Erregermengen zu erwarten – daher sollten falsch-negative Ergebnisse bei den betroffenen Teilnehmern durchaus Anlass zur Überprüfung und Optimierung seines jeweiligen NAT-gestützten Testsystems geben.

Für die Proben # 1525321 und # 1525324 mit ~1x105 CFU/mL an Bordetella bronchiseptica und Bordetella parapertussis wurden insgesamt 6 falsch-positive Ergebnis beobachtet und auch die nur mit Escherichia coli versetzte Probe #1525323 wurde von zwei Teilnehmern als positiv für Bordetella pertussis eingestuft. Hierbei handelt es sich offensichtlich um mangelnde analytische Spezifität der eingesetzten B. pertussis-spezifischen PCR/NAT-Testsysteme und, vor allem bei der Probe #1525323, um laborinterne Kontaminationsereignisse oder um Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung. Von den übrigen 142 der insgesamt 146 Teilnehmer wurden ausnahmslos richtig-negative Ergebnisse mitgeteilt.

Von einem Teilnehmer wurde das Ergebnis bei der positiven Probe # 1525321 als „fraglich“ klassifiziert. Anmerkung des Ringversuchsleiters: bei der Mitteilung von fraglichen Ergebnissen werden die entsprechenden Zertifikate nur dann erteilt, wenn diese Teilnehmer bei den übrigen 3 Proben des Ringversuchs korrekte Ergebnisse angegeben haben.

Inhibitionskontrollen wurden von 144 der insgesamt 146 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden dabei von keinem Teilnehmer beobachtet.

Wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchen verwendete die überwiegende Anzahl der Teilnehmer selbstentwickelte (in-house) Testsysteme (59 Teilnehmer) oder auf dem Ergebnisformular nicht näher spezifizierte kommerzielle Testkits mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen (39 Teilnehmer) zum NAT-gestützten Nachweis von B. pertussis.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: GeneProof B. pertussis/parapertussis PCR Kit (9x), Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP B. pertussis (4x), Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP Bacterial Kit (2x), AmpliGnost B. pertussis/parapertussis PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (4x), ARGENE Bordetella R-gene (3x), fast-track Diagnostics Bordetella (2x), fast-track Diagnostics Respiratory pathogens 33 (1x), Attomol Bordetella Realtime LT (1x), SIMPLEXA Bordetella Universal Direct Assay (1x), Meridian Bioscience illumigene Pertussis (1x), Vircell Speed-oligo Bordetella (1x), AmpliSens Bordetella multi FRT PCR Kit (1x), Labsystems Diagnostics B. pertussis + B. parapertussis Duplex Real-Time PCR (1x) und Seegene Seeplex PneumoBacter ACE Detection (1x).

RV 533: Helicobacter pylori

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 6) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben in einer Art Verdünnungsreihe. Eine Probe mit einer sehr hohen Menge an Clarithromycin-resistenten H. pylori (# 1525333; ~1x106 CFU/mL), eine mit ca. zehnfach geringerer Menge (# 1525334; ~105 CFU/mL), eine Probe mit ca. hundertfach geringerer Menge (# 1525331, ~104 CFU/mL), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1525332), die nur humanes Zellmaterial und E. coli enthielt.

Erfreulicherweise wurden alle drei H. pylori-positiven Proben (#1525331, #1525333 und # 1525334) von allen der insgesamt 37 Teilnehmer ausnahmslos als richtig-positiv bewertet. Wie bereits in den letzten Ringversuchen zeigte sich erneut die Verfügbarkeit gut evaluierter NAT-gestützter Analysesysteme mit hoher analytischer Sensitivität. Für das aktuelle Probenset wurden bei keinem der Teilnehmer falsch-positive PCR/NAT-Ergebnisse durch Kreuzreaktionen o.ä. beobachtet. Inhibitionskontrollen wurden von allen 37 Teilnehmern durchgeführt und von keinem Teilnehmer wurden Inhibitionsereignisse bei den 4 Einzelproben beobachtet.

Sowohl die kommerziellen, als auch die eigenentwickelten Testsysteme schnitten im aktuellen Ringversuch wieder einmal erfreulich gut ab. So erreichten die in-house Testsysteme wie auch die kommerziellen Assays eine Richtigkeitsqoute von 100%, was die richtig-positiven Ergebnisse betrifft. Auch bei den richtig-negativen Ergebnissen waren keine signifikanten Unterschiede in den Richtigkeitsquoten von in-house Testsystemen und kommerziellen Assays auszumachen.

Bis auf 24 Teilnehmer mit kommerziellen Testsystemen (im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ 4 x RIDAGENE Helicobacter pylori von r-Biopharm angegeben) verwendeten die Teilnehmer zum NAT-gestützten Nachweis von H. pylori selbstentwickelte, sog. in-house Testsysteme.

Wie in der Testbeschreibung des RV 533 vermerkt, konnten die Teilnehmer auf freiwilliger Basis auch die vermeintliche Clarithromycin-Resistenz der untersuchten H. pylori-Isolate mitteilen. Diese Spezialuntersuchung zur molekularbiologischen Resistenztestung erfolgt in der Regel über die Amplifikation und Sequenzierung von charakteristischen Bereichen, innerhalb der H. pylori 23S rDNA bzw. der Sequenzanalyse dieses Genombereichs, mittels Hybridisierungssonden. Ergebnisse wurden hier von 34 der insgesamt 37 Teilnehmer mitgeteilt, und mit Ausnahme eines einzigen Teilnehmers waren die mitgeteilten Ergebnisse der molekularen Resistenztestung auch durchweg korrekt.

RV 534: EHEC/STEC

Wie auch bereits bei den vorhergegangenen Runden dieses Ringversuchs mehrfach diskutiert, besteht die eigentliche Herausforderung bei dem Nukleinsäure-gestützten Nachweis von EHEC/STEC prinzipiell nicht so sehr in dem Nachweis sehr geringer Mengen an Zielorganismen, sondern vielmehr in der differenzierten Analyse und der Typisierung unterschiedlicher Shiga-Toxin-Genen und anderer putativer Pathogenitätsfaktoren (wie das für Intimin kodierende eae-Gen oder das für Enterohämolysin kodierende hlyA-Gen).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt daher zwei unterschiedliche, aber relativ stark EHEC-positive Proben: mit ca. 1x105 CFU/mL (# 1525342: E. coli, stx2d-positiv) und mit ca. 5x104 CFU/mL (# 1525343: E. coli, stx2c- und O157-positiv) sowie eine Probe mit 5x105 CFU/mL eines ST- und LT-positiven ETEC-Isolats (# 1525341). Probe # 1525344 enthielt einen E. coli-Stamm (eae-, hlyA-negativ).

In diesem Ringversuch waren keine „exotischen“ Shiga-Toxin-Gene vertreten, sodass, begründet auf die Verfügbarkeit von mittlerweile bestens etablierten NAT-gestützten Testsystemen und molekularbiologischen Differenzierungsstrategien für EHEC, bei allen Proben durchwegs hohe Richtigkeitsquoten – sowohl für positive, als auch für negative Befunde – verzeichnet werden konnten. Die beiden EHEC-positiven Proben # 1525342 bzw. # 1525343 wurden von 118 bzw. 117 Teilnehmern als richtig-positiv berichtet. Eine naheliegende Erklärung für die 6 falsch-negativen Ergebnisse bei der stx2d-, hly- und eae-positiven Probe # 1525342 und 7 falsch-negativen Ergebnisse bei der stx2c-, hly- und eae-positiven Probe # 1525343 (diesmal hier vorwiegend Teilnehmer mit selbstentwickelten PCR/NAT-Testsystemen) gibt es aus Sicht der Ringversuchsauswertung nicht. Eventuell decken die eingesetzten Testkonzepte der entsprechenden Teilnehmer nicht das gesamte zu erwartende Spektrum an „üblichen“ stx-1 und stx-2 Genen ab. Die Probe # 1525344 (E. coli K12 Stamm, eae-, hlyA-negativ) wurde diesmal von 121 der insgesamt 124 Teilnehmer korrekterweise als negativ befundet. Probe # 1525341, welche in der aktuellen Ringversuchsrunde ca. 5x105 CFU/mL eines ST- und LT-positiven ETEC-Isolats enthielt, wurde erfreulicherweise von nahezu allen der insgesamt 124 Teilnehmer korrekt als negativ für EHEC/STEC befundet. Von zwei bzw. drei Teilnehmern wurden die EHEC-negativen Proben # 1525341 und # 1525344 als positiv für EHEC eingestuft. Bei der ersten Probe (ETEC) handelt es sich dabei eventuell um mangelnde analytische Spezifität der eingesetzten EHEC-spezifischen PCR/NAT-Testsysteme oder (bei beiden Proben) um laborinterne Kontaminationsereignisse oder um Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung. Angesichts der streng normierten und standardisierten Abarbeitungsprotokolle von kommerziellen Testsystemen ist es auch hier etwas verwunderlich, dass der überwiegende Anteil der teilnehmenden Laboratorien mit den betroffenen Testsystemen erfolgreich die vorgegebenen Zielwerte erreicht, aber einzelne Laboratorien mit den identischen Testsystemen immer wieder aufs Neue falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse berichten. Ohne denjenigen Teilnehmern, die mit bestimmten kommerziellen Testsystemen die Zielwerte nicht erreichen, zu nahe treten zu wollen, deutet dieser Umstand in diesen Fällen dann wohl eher auf individuelle Abweichungen vom Protokoll oder bestimmte Fehler bei der Probenabarbeitung, als auf intrinsische Unzulänglichkeiten der in der Regel gut evaluierten Testsysteme hin.

Da in den meisten der teilnehmenden Laboratorien ein NAT-gestützter Nachweis von Shiga-Toxin-Genen im Umfeld der EHEC-Diagnostik primär als Kulturbestätigungstest eingesetzt wird, werden bei zukünftigen Ringversuchen auch die meisten der positiven Proben wieder relativ hohe Mengen an Zielorganismen enthalten, und der Schwerpunkt bleibt auf der Abprüfung der analytischen Spezifität der eingesetzten Testsysteme, und weniger auf der dabei erzielten unteren Nachweisgrenze.

Neben in-house Testsystemen werden zunehmend vorkonfektionierte kommerzielle Assays eingesetzt. In den Richtigkeitsquoten zeigte sich keine Über- bzw. Unterlegenheit eines Systems, was für die breite Etablierung PCR-/NAT-gestützter Testsysteme spricht. Inhibitionskontrollen wurden von 123 der 124 Teilnehmer durchgeführt, Inhibitionsereignisse wurden in keinem Fall beobachtet.

Zudem wurden von 104 Teilnehmern die Ergebnisse der molekulargenetischen Shiga-Toxin-Subtypisierung sowie des gezielten Nachweises von Intimin- (eae) und/oder Enterohämolysin (hlyA)-Genen mitgeteilt. Wenn auch die Typisierung nicht immer vollständig durchgeführt wurde, so waren diese Angaben zur Typisierung, zumindest in dem mitgeteilten Umfang, großteils korrekt. Lediglich ein Teilnehmer berichtete hier falsche Ergebnisse.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: RealStar EHEC PCR Kit von Altona diagnostic (1x), TIB Molbiol LightMix modular stx-1/stx-2/eae (2x), BD Max Enteric Panel (2x), Sacace Biotechnologies EHEC Real-TM (1x), AmpliGnost Verotoxin 1/2 (Differenzierung) PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), fast-track Diagnostics (1x) und Mast Isoplex VTEC (1x).

RV 535: Borrelia burgdorferi

Nachdem die Probenauswahl des letzten Ringversuchs mehr auf die analytische Spezifität der eingesetzten Testsysteme abzielte, haben wir uns im aktuellen Ringversuch wieder einmal auf die Prüfung der analytischen Sensitivität fokussiert. Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt somit eine Probe mit einer hohen Menge an Borrelia burgdorferi sensu stricto (# 1525353, ~1x104 Organismen/mL), zwei mit relativ geringer Menge (# 1525351 und # 1525354, je ~1x103 Organismen/mL), sowie eine Probe mit eine sehr hohe Menge an Borrelia garinii OspA Typ 8 (# 1525352, ~1x105 Organismen/mL).

Die Detektion von Borrelia burgdorferi sensu stricto und Borrelia garinii in den Proben mit relativ hoher Erregerlast (# 1525352 mit ~1x105 Organismen/mL bzw. # 1525353 mit ~1x104 Organismen/mL) bereitete dem Großteil der Teilnehmer keinerlei Probleme, sodass für beide Proben eine hohe Quote richtig-positiver Ergebnisse erreicht wurde. Wie zu erwarten und auch im Rahmen der vorhergehenden Ringversuche stets zu beobachten war, werden mit abnehmender Erregerlast deutlich mehr falsch-negative Ergebnisse beobachtet – der Anteil an falsch-negativen Resultaten betrug bei einer Erregerlast von ~1x104 Organismen/mL ca. 10% und bei Erregerlasten von ~1x103 Organismen/mL bereits an die 20%.

Aufgrund der geringen Erregeranzahl von ~1x103 Organismen/mL in den Proben #1525351 und #1525354 und da beide Proben identische Stämme enthielten, wurden die berichteten negativen Ergebnisse diesmal nicht für beide Proben als „falsch-negativ“ gewertet.

Die Probe #1525354 mit ~1x103 Organismen/mL. (schraffiert dargestellt) wurde deshalb als „educational“ bewertet und nicht in die Bewertung einbezogen. Somit bestehen den Ringversuch alle diejenigen Teilnehmer, die beide besagten Proben falsch-negativ befundet haben – natürlich unter dem Vorbehalt, dass sie kein weiteres falsches Ergebnis innerhalb des aktuellen Probensets berichtet haben.

Allerdings sollte der aktuelle Ringversuch (und insbesondere ein falsch-negatives Ergebnis für die Probe #1525352) zum Anlass genommen werden, die analytische Sensitivität des verwendeten Testsystems kritisch zu hinterfragen. Speziell sollten die Testsysteme auf die Detektionsfähigkeit für B. burgdorferi s.s. überprüft werden.

Interne oder externe Inhibitionskontrollen wurden von allen 111 Teilnehmern mitgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse der PCR-Reaktion wurden im Rahmen dieser Ringversuchsrunde von keinem Teilnehmer beobachtet.

Wie bei den vorhergehenden Ringversuchsrunden haben auch diesmal wieder ungefähr knapp die Hälfte der Teilnehmer selbstentwickelte (in-house) Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von Borrelien-DNA verwendet, kommerzielle Testsysteme wurden von 61 der 111 Teilnehmer eingesetzt.

Im Großen und Ganzen waren im Rahmen dieses Ringversuchs auch keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen (Sensitivität zwischen 87 und 100%) und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen (durchschnittliche Sensitivität ca. 92%) zu beobachten. Das aktuell schlechte Abschneiden des Demeditec GenFlow Assays sollte angesichts der insgesamt nur 3 Teilnehmer in diesem Zusammenhang nicht überbewertet werden. Dennoch kann angemerkt werden, dass von den 25 Teilnehmern, die insgesamt 32 falsch-negative Ergebnisse für die beiden Proben # 1525351 und # 1525354 mit relativ geringer Erregerlast berichteten, 14 davon durch in-house Testsysteme generiert wurden. Deshalb sollte also auch die Sensitivität der entsprechenden hauseigenen Testsysteme überprüft werden. Darüber hinaus wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: GeneProof Borrelia burgdorferi PCR Kit (8x), HAIN Lifescience FluoroType Borrelia (6x), Autoimmun Diagnostika GenID Zecken Screening Kit (2x), BIORON RealLine Borrelien Kit (1x), ixSave Borrelia real time PCR kit TM von Gerbion (1x), EliGene Borrelia RT von Elisabeth Pharmacon (1x), Immundiagnostik MutaGEL Borrelia (1x), BactoReal B. burgdorferi von Ingenetix (1x) und Attomol B. burgdorferi Realtime LT (1x).

RV 536: Legionella pneumophila

Wie schon beim letzten Mal hier vorab nochmals der Hinweis: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Legionella pneumophila aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Er ist daher NICHT für die Abprüfung von immunologischen Direktnachweisverfahren wie L. pneumophila SG1 Urin-Antigen Testen o.ä. geeignet. Einzelne Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets können daher typischerweise auch relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von L. pneumophila-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine einzige positive Probe # 1525362, die mit einer Menge von ca. 105 CFU/mL an Legionella pneumophila-Serogruppe 2 versetzt war, Die Probe # 1525363 des aktuellen Sets enthielt ca. 106 CFU/mL an Legionella micdadei und Probe # 15253634 enthielt eine ca. hundertfach geringerer Menge an Legionella micdadei (104 CFU/mL) Die dritte für den entsprechenden Zielorganismus „negative“ Probe # 1525361 des aktuellen Probensets enthielt neben humanem Zellmaterial lediglich E. coli. Diese wurde erfreulicherweise von 103 der insgesamt 104 Teilnehmer als negativ für Legionella pneumophila-DNA befundet. Ein Teilnehmer berichtete hier ein als „fraglich“ klassifiziertes Ergebnis.

Die relativ stark positive Probe # 1525362 mit ca. 105 CFU/mL an Legionella pneumophila SG2 wurde von allen 104 Teilnehmern korrekterweise als positiv interpretiert.

Die beiden mit relativ hohen Mengen an Legionella micdadei (~1x106 bzw. ~1x104 CFU/mL) versetzten Proben wurden von 94 bzw. von 98 Teilnehmern mit ihren L. pneumophila-spezifischen PCR-/NAT-Testsystemen korrekt als negativ befundet. Neun bzw. 5 Teilnehmer berichteten hier ein falsch-positives Ergebnis für L. pneumophila-DNA, was auf eine Kreuzreaktion bzw. mangelnde Speziesspezifität der Zielsequenz zurückzuführen sein dürfte. Vor allem in-house real-time PCR-Protokolle mit ribosomalen Zielsequenzen zeigten in der Vergangenheit immer wieder Probleme bei der Speziesspezifität. Bei Verwendung von nested Block-Cycler PCR-Protokollen zur Amplifikation von spezifischen Bereichen der 16S rDNA und anschließender DNA-Sequenzierung sollte jedoch der Fehler eher auf Anwenderseite gesucht werden (beispielsweise Kontaminationsereignisse bei der Probenaufbereitung und -abarbeitung), da dieses Testkonzept in jedem Fall die Unterscheidung der Spezies erlauben sollte.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs kamen bei insgesamt 63 Teilnehmern kommerzielle NAT-Testsysteme für den Nachweis von L. pneumophila-DNA im Untersuchungsmaterial zum Einsatz. Signifikante Unterschiede bezüglich der analytischen Sensitivität zwischen kommerziellen und selbstentwickelten Testsystemen (von 43 Teilnehmern verwendet) fanden sich nicht. Inhibitionskontrollen wurden offenbar von 103 der 104 Teilnehmer durchgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse wurden nicht berichtet.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs kamen bei insgesamt 43 Teilnehmern kommerzielle NAT-Testsysteme für den Nachweis von L. pneumophila-DNA im Untersuchungsmaterial zum Einsatz. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP Bacterial Kit (9x), AmpliGnost L. pneumophila von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (6x), Mikrogen Diagenode Lpn-050 Kit (6x), r-Biopharm RIDAGENE Legionella (4x), fast-track Diagnostics Respiratory pathogens 33 (2x), Gerbion diarella Legionella real time PCR Kit LC und TM (2x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (2x), ARGENE Legio pneumo/Cc r-gene (2x), Euroclone Duplica Real Time L. pneumophila Detection Kit (2x), Seegene Seeplex PneumoBacter ACE detection (1x), GeneProof Legionella pneumophila PCR Kit (1x), Vircell Speed-oligo Legionella (1x) und Progenie Molecular RealCycler M. pneumoniae + C. pneumoniae + Legionella spp. (1x).

RV 537: Salmonella enterica

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal drei positive Proben. Eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1525371; Salmonella enterica ser. Enteritidis, ~5x105 CFU/mL), zwei mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1525373; Salmonella enterica ser. Enteritidis und # 1525372; Salmonella enterica ser. Grumpensis; ~5x104 CFU/mL), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1525374), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Die Verfügbarkeit von spezifischen und mittlerweile gut evaluierten selbstentwickelten bzw. kommerziellen NAT-gestützten Analysesystemen führte diesmal bei allen 4 Proben des Ringversuchssets zu sehr hohen Richtigkeitsquoten. Im Gegensatz zu manch früheren Salmonella enterica PCR/NAT-Ringversuchen war diesmal kein falsch-positives Ergebnis bei der negativen Probe # 1525374 zu beobachten. Dies deutet auf eine verbesserte Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden diagnostischen Laboratorien hin. Hoffentlich bestätigt sich diese erfreuliche Beobachtung auch in den zukünftigen Ringversuchsrunden.

Zusammenfassend wurden im Rahmen dieses Ringversuchs zum NAT-gestützten Nachweis von Salmonellen von den insgesamt 20 Teilnehmern nur je ein falsch-negatives Ergebnis bei zwei unterschiedlichen Proben mitgeteilt. Die Richtigkeitsquoten lagen somit annähernd bei 100%. Inhibitionskontrollen wurden von allen Teilnehmern durchgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse wurden für keine der Proben berichtet.

Kommerzielle Testsysteme kamen in 11 Fällen, selbstentwickelte Testsysteme in 9 Fällen zum Einsatz. Signifikante Unterschiede bezüglich Sensitivität oder Spezifität waren nicht zu erkennen.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ von einem Teilnehmer die Verwendung des folgenden Kits aufgeführt: r-biopharm RIDAGENE Bacterial Stool Panel (5x), Congen SureFood pathogen Salmonella PLUS (1x), TIB Molbiol LightMix Salmonella (1x), BD Max Enteric Panel (1x) und fast-track Diagnostics (1x).

RV 538: Listeria spp.

Neben der wohl prominentesten Spezies Listeria monocytogenes sind auch eine Reihe weiterer Listerienspezies bekannt, für die inzwischen auch einige selbstentwickelte und kommerzielle NAT-gestützte Nachweisverfahren zur Verfügung stehen. Auch wenn diese Spezies (mit Ausnahme von L. ivanovii) zumeist nicht von humanpathogener Relevanz sind, werden wir uns bei der Konzeption des Probenmaterials für RV 538 vor allem zur Abprüfung der Spezifität individueller Testsysteme nicht nur auf L. monocytogenes beschränken. Daher werden gelegentlich auch andere Listerienspezies in der einen oder anderen Probe dieses Ringversuchs zu finden sein. Im aktuellen Ringversuch wurde jedoch eine Art Verdünnungsreihe von Listeria monocytogenes angefertigt, um primär die untere Nachweisgrenze der derzeit eingesetzten Testsysteme abzuprüfen. Probe # 1525383 enthielt eine relativ hohe Menge an L. monocytogenes (ca. 5x105 CFU/mL), die auch von allen der insgesamt 32 Teilnehmer korrekt erfasst wurde. Probe # 1525382 enthielt mit ca. 105 CFU/mL eine etwa fünffach geringere Menge an Zielorganismen, die ebenfalls von allen Teilnehmern mit ihren jeweiligen spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert werden konnte. Mit ca. 103 CFU/mL L. monocytogenes Probenmaterial enthielt die Probe # 1525384 diesmal eine sehr geringe Menge der entsprechenden Zielorganismen. Erfreulicherweise konnte selbst diese schwach-positive Probe noch von 27 der insgesamt 32 Teilnehmer als „positiv“ klassifiziert werden. Lediglich 5 Teilnehmer berichteten hier ein negatives Ergebnis – vermutlich wurde in diesen Fällen ein Testsystem mit unzureichender analytischer Sensitivität verwendet.

Bei der Probe ohne Zielorganismen (# 1525381), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielten, wurde im Rahmen des aktuellen Ringversuchs von keinem der 32 Teilnehmer ein falsch-positives Ergebnis beobachtet. Im Vergleich zu den vorhergegangenen Ringversuchen deutet dies auf eine kontinuierlich verbesserte Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden diagnostischen Laboratorien hin.

Da wir uns innerhalb dieses Ringversuchsprogramms gelegentlich auch mit einzelnen Proben an die derzeit technisch machbare untere Nachweisgrenze annähern wollen (Anmerkung: wir sind uns dabei sehr wohl bewusst, dass bei vielen Fragestellungen das „technisch machbare“ nicht unmittelbar gleichbedeutend mit dem „diagnostisch sinnvollen“ ist), bestand beim aktuellen Listerien-Ringversuch die diagnostische Herausforderung in der Abprüfung der analytischen Sensitivität individueller Testkonzepte. Der möglichst selektiven Detektion bzw. differenzierten Erfassung von non-monocytogenes Listerienspezies werden wir uns wieder in einigen der zukünftigen Ringversuchsrunden widmen.

Für Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen interessiert sind, stehen mit dem aktuellen Ringversuch auch wieder standardisierte Rückstellproben mit geringerer Menge an Zielorganismen zur Verfügung, die als untere Messlatte bezüglich der analytischen Sensitivität dienen können und direkt über den Ringversuchsleiter zu beziehen sind. Von allen 32 Teilnehmern wurden Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen verwendet. Vermeintliche Inhibitionsereignisse bei der Aufarbeitung und Analyse der Ringversuchsproben wurden nicht beobachtet.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Sacace Biotechnologies L. monocytogenes Real-TM (1x), DYNEX Real Time PCR MeningoPlex (1x), Liferiver L. monocytogenes Real Time PCR Kit (1x) und Seegene Seeplex Meningitis ACE Detection (1x).

Bei diesem Ringversuch besteht explizit die Option einer differenzierten Befundmitteilung. Hält ein Teilnehmer lediglich ein L. monocytogenes-spezifisches NAT-Verfahren vor, so kann er dies über den Zusatzcode [71] im Ergebnisfeld angeben und für die Erstellung des individuellen Zertifikats seitens INSTAND e.V. werden dann auch nur die L. monocytogenes-spezifischen Ergebnisse zur Bewertung herangezogen.

RV 539: MRSA

Zuerst einmal, wie gehabt, eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für den Direktnachweis von MRSA-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise Nasen- oder Wundabstrichen) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen an entsprechenden Zielorganismen. Für interessierte Teilnehmer soll an dieser Stelle noch einmal explizit darauf hingewiesen werden, dass sich mit Testsystemen, die üblicherweise für die Kulturbestätigung von S. aureus und/oder MRSA ausgelegt sind, diese geringen Mengen nicht immer zuverlässig nachweisen lassen werden. Eine Teilnahme an diesem Ringversuch ist daher nur für solche diagnostischen Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von MRSA etabliert haben bzw. im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie an dieser Stelle bereits mehrfach thematisiert basieren einige der derzeit etablierten eigenentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum Direktnachweis von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial auf einer getrennten Erfassung von S. aureus-spezifischen Markern, Staphylokokkenspezies-spezifischen Markern und dem mecA-Gen in der entsprechenden Nukleinsäurepräparation. Da sowohl bei S. aureus als auch bei Koagulase-negativen Staphylokokken das mecA-Gen für die phänotypische Ausprägung einer Methicillin-Resistenz verantwortlich ist, ist die Aussagekraft dieser PCR-gestützten Testsysteme für den Direktnachweis von MRSA aus nativem Patientenmaterial eingeschränkt, wenn beim Patienten eine gleichzeitige Besiedelung mit S. aureus und Koagulase-negativen Staphylokokken (die als klinische Isolate zumeist mecA-positiv sind) vorliegt. Einen attraktiven Ansatzpunkt zur Lösung dieses Problems bieten sog. SCCmec-basierte PCR-Testkonzepte, die auf dem Nachweis der SCCmec-Kassette innerhalb eines für S. aureus charakteristischen Genbereiches beruhen und die relativ gut konservierte Integrationsstelle der SCCmec-Kassette im S. aureus-Genom als Zielsequenz verwenden.

Dass aber auch die SCCmec-basierten Testkonzepte gewisse Limitationen haben, konnte im Rahmen einiger früherer Ringversuche eindrucksvoll aufgezeigt werden: hier wurden bereits einige MRSA-Isolate mit selten vorkommenden SCCmec-Subtypen oder MSSA-Isolate mit einer an den jeweiligen Enden typischen SCCmec-Sequenz, aber mit einer natürlichen Deletion des üblicherweise innerhalb der SCCmec-Kassette vorhandene mecA-Gens versandt. Auch wenn wir uns im Rahmen dieser Ringversuchsserie zum Ziel gesetzt haben, primär die analytische Sensitivität und Spezifität (und somit die Routinetauglichkeit) der jeweils eingesetzten Testsysteme abzuprüfen, befand sich im aktuellen Ringversuch neben einem klassischen und unkomplizierten MRSA-Isolat auch ein derzeit noch eher selten anzutreffendes mecC-positives MRSA-Isolat und ein spezielles MSSA-Isolat mit mecA-Deletion innerhalb der SCCmec-Kassette.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 12) der statistischen Auswertung dargestellt, enthielt die Probe # 1525391 eine relativ hohe Menge eines mecC-positiven Methicillin-resistenten S. aureus-Patientenisolats (MRSA; PVL-negativ; spa: spa:t10009; ~1x105 CFU/mL), die Probe # 1525393 ein typisches MRSA-Patientenisolat (MRSA; PVL-negativ, ~1x105 CFU/mL), und die Probe # 1525392 eine relativ hohe Menge eines Methicillin-sensiblen S. aureus-Patientenisolats mit mecA-Deletion innerhalb der integrierten SCCmec-Kassette (sog. mecA dropout Mutante) (MSSA; PVL-negativ; ~5x105 CFU/mL). Die letzte der 4 Proben, # 1525394, enthielt neben humanem Zellmaterial lediglich eine nennenswerte Menge an E. coli.

Erfreulicherweise wurden im aktuellen Ringversuch bei der positiven MRSA Probe # 1525393 von nahezu allen der 314 Teilnehmer durchweg korrekt positive PCR/NAT-Ergebnisse mitgeteilt. Der technische oder methodische Hintergrund des einen als „fraglich“ klassifizierten und der 3 falsch-negativen Ergebnisse bei dieser Probe ist seitens des Ringversuchsleiters nicht näher zu ergründen. Möglicherweise wurden PCR-Testsysteme mit unzureichender analytischer Sensitivität eingesetzt oder es ging während der Probenaufarbeitung ein gewisser Anteil der Template-DNA bei der DNA-Isolierung oder der Komplettierung der PCR-Ansätze verloren. Angesichts der mit 1x105 CFU/mL ehrlicherweise nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollten falsch-negative Ergebnisse bei Probe # 1525393 den betroffenen Ringversuchsteilnehmern durchaus begründeten Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihrer entsprechenden NAT-gestützten Testsysteme geben.

Bei der Probe # 1525394, die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt, wurden im Rahmen des aktuellen Ringversuchs nur von je einem der 314 Teilnehmer ein als „fraglich“ klassifiziertes und ein falsch-positives MRSA-Ergebnis beobachtet. Hier liegt (auch angesichts der sequenziellen Folge direkt nach der MRSA-positiven Probe #1525393) das Auftreten eines sporadischen laborinternen Kontaminationsereignisses oder einer Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung nahe. Wie bereits mehrfach im Rahmen dieser ausführlichen Ringversuchsdiskussionen erwähnt, sind solche „Ausreißer“ bei technisch aufwändigen Ringversuchen mit über 300 Teilnehmern nichts Ungewöhnliches und bedürfen meines Erachtens keiner weiteren Diskussion.

Die augenscheinlich „schlechte Datenlage“ bei der MRSA-positiven Probe # 1525391 ist bei näherer Betrachtung schnell erklärt. Hierbei handelt es sich um ein S. aureus-Patientenisolat, dessen phänotypische Oxacillin-Resistenz nicht über die Anwesenheit des „üblichen“ mecA-Gens sondern vielmehr über das mecC-Gen kodiert bzw. vermittelt wird. Hierbei handelt es sich um mittlerweile zwar mehrfach aber insgesamt jedoch noch sehr sporadisch beobachtete Oxacillin-resistente S. aureus-Isolate, die auf Gesamtgenomebene alle üblicherweise verwendeten S. aureus-Speziesmarker aufweisen, sich in der SCCmec-orfX-Region aber auf Sequenzebene von den „typischen“ MRSA-Isolaten deutlich unterscheiden und zusätzlich noch anstatt des „populären“ mecA-Gens ein resistenzvermittelndes mecC-Gen mit stark abweichender Gensequenz tragen. Bei den mit diesem mecA-Homolog ausgestatteten Bakterienisolaten erfolgt die Integration des mecC-Gens innerhalb einer neuartigen SCCmec-Genkassette vom Typ XI in das S. aureus-Genom (selbst auf Aminosäureebene weisen das mecA- und mecC-Genprodukt eine Homologie von weniger als 63% auf). Diese signifikanten Sequenzunterschiede führen bei allen kommerziellen oder in-house SCCmec-basierten PCR-Testsystemen, die nicht auf die speziellen Gensequenzen des mecC-Gens hin optimiert wurden, zwangsläufig zur „Nichterkennung“ solcher mecC-positiven MRSA-Isolate. Das MRSA-Isolat im Probe # 1525391 konnte daher (erwartungsgemäß) nur von denjenigen Teilnehmern erkannt werden die speziell auf dieses „neue“ Methicillin-Resistenzgen abgestimmte Testsysteme in Verwendung haben.

Interessant ist hier der direkte Vergleich zum MRSA-Ringversuch vom Mai 2014: damals wurde nämlich das gleiche mecC-positive MRSA-Isolat ausgesandt und von insgesamt 298 Teilnehmern konnten vor Jahresfrist lediglich 59 Teilnehmer (19%) einen positiven PCR/NAT MRSA-Nachweis führen. In der aktuellen Ringversuchsrunde wurden immerhin schon von 115 der insgesamt 314 Teilnehmer (36%) korrekt positive PCR/NAT-Ergebnisse berichtet. Auch wenn solche mecC-positiven MRSA-Isolate derzeit zumindest in unseren Breiten noch sehr selten nachgewiesen werden, so soll mit der erneuten Mitführung dieses Isolats bei den Teilnehmern und innerhalb der Leserschaft dieser Ringversuchsdiskussion zumindest das Bewusstsein für das mögliche Vorkommen solcher mecC-positiven MRSA-Isolate geweckt werden. Derzeit beschränkt sich der Nachweis von mecC-positiven MRSA-Isolaten (methoden- oder prävalenzbedingt?) noch auf einige wenige Einzelfälle – diese diagnostische Lücke gelangt aber zunehmend in das Bewusstsein der Testhersteller einige der kommerziellen PCR/NAT-Testsysteme wurden bereits um eine mecC-Komponente erweitert.

Als weiteres „Highlight“ innerhalb der aktuellen Ringversuchsrunde wurde in Probe # 1525393 eine sog. mecA dropout-Mutante ausgesandt. Bei solchen speziellen MSSA-Isolaten liegt die SCCmec-Kassette zwar im S. aureus-Genom integriert vor (d.h. die SCCmec-orfX Übergangsregion, die bei den meisten der derzeit kommerziell erhältlichen MRSA-spezifischen PCR-Testsystemen als molekularer Surrogatmarker für die Anwesenheit eines mecA-Gens verwendet wird, ist in diesem Isolat vorhanden), aber innerhalb dieser SCCmec-Kassette ist das Methicillin-Resistenz vermittelnde mecA-Gen großteils deletiert und daher phänotypisch nicht mehr funktionell ausgeprägt. Auch wenn solche mecA-Deletionsmutanten derzeit noch eher selten beobachtet werden, so soll mit der Mitführung dieses Isolats bei den Teilnehmern und innerhalb der Leserschaft dieser Ringversuchsdiskussion zumindest das Bewusstsein für das mögliche Vorkommen solcher MSSA-Isolate geweckt werden, die „leere“ SCCmec-Kassetten tragen.

Auch hier ist wieder der direkte Vergleich zu einem unserer früheren MRSA-Ringversuche interessant (in diesem Fall der vom November 2012): damals wurde nämlich das gleiche mecA dropout MRSA-Isolat ausgesandt und von insgesamt 210 Teilnehmern konnten lediglich 63 Teilnehmer (30%) einen korrekt negativen PCR/NAT MRSA-Nachweis führen. In der aktuellen Ringversuchsrunde wurden immerhin schon von 167 der insgesamt 314 Teilnehmer (53%) korrekt negative PCR/NAT-Ergebnisse für MRSA berichtet.

Zugegebenermaßen sind sowohl die mecC-Resistenzgene als auch mecA dropout-Mutanten unter den MRSA- bzw. MSSA-Patientenisolaten noch relativ selten und die Ergebniskonstellation dieses Ringversuchs sollte den diagnostischen Wert von SCCmec-basierten PCR-Testkonzepte in der mikrobiologischen Praxis nicht schmälern. Ungeachtet des verwendeten Testsystems wurde bei der Erstellung der Zertifikate ein negatives Ergebnis für die Probe # 1525391 und/oder ein positives Ergebnis für die Probe # 1525392 nicht als „falsch“ bewertet. Damit nun die Erteilung der entsprechenden Zertifikate für diese Ringversuchsrunde aber nicht allzu willkürlich ausfällt (denn ein Fehler unter 4 Ergebnissen wird ja laut Bewertungsschema toleriert), ist in Tab. 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 12) nur eine der „besonderen“ Proben (i.e. Probe #1525392) schraffiert dargestellt. Somit bestehen den Ringversuch selbst diejenigen Teilnehmer, die schlimmstenfalls beide der edukativen Proben falsch befundet haben – natürlich unter dem Vorbehalt, dass sie kein weiteres falsches Ergebnis innerhalb des aktuellen Probensets berichtet haben.

Allerdings sollte bei dem aktuellen MRSA-Ringversuch insbesondere ein falsch-negatives Ergebnis für Probe #1525393 oder ein ein falsch-positives Ergebnis für Probe #1525394 zum Anlass genommen werden, die analytische Sensitivität bzw. die Kontaminationsanfälligkeit des verwendeten Testsystems kritisch zu hinterfragen.

Für Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen interessiert sind und/oder überprüfen wollen, ob ihr spezifisches Testsystem mecA-Deletionsmutanten oder MRSA mit mecC-Gen bzw. mit SCCmec-Genkassetten vom Typ XI erfassen kann, stehen mit den Proben dieses Ringversuchs wieder standardisierte Rückstellproben zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Darüber hinaus bestätigen die beiden „besonderen“ MRSA- bzw. MSSA-Isolate der aktuellen Ringversuchsrunde erneut die Sinnhaftigkeit und auch Notwendigkeit des im Rahmen der PCR/NAT-Ringversuchsdiskussionen bereits mehrfach thematisierten begleitenden kulturellen Nachweises von MRSA.

Optional wird im Rahmen unserer Ringversuchsreihe auch der molekulargenetische Nachweis des putativen Pathogenitätsfaktors PVL (Panton-Valentine-Leukozidin) bzw. dessen kodierende Gene lukF/S-PV abgefragt. Entsprechende (PVL-negative) Ergebnisse der molekularbiologischen PVL-Testung wurden von 85 der insgesamt 314 teilnehmenden Laboratorien mitgeteilt und mit Ausnahme von zwei falsch-positiven PVL-Ergebnissen waren diese diesmal durchweg korrekt. Nähere Informationen zu der, nach wie vor hochaktuellen, cMRSA-bzw. CA-MRSA-Problematik finden sich beispielsweise in Linde und Lehn [2] oder Witte et al. [3]. Ein gut evaluiertes real-time PCR-Protokoll für den gezielten Nachweis von PVL-positiven S. aureus-Isolaten findet sich beispielsweise in Reischl et al. [4]. Mittlerweile sind auch schon einige kommerzielle real-time PCR Testsysteme für den zuverlässigen molekulargenetischen Nachweis von PVL-Genen bei MRSA- und MSSA-Isolaten verfügbar (z.B. von r-biopharm oder von TIB Molbiol).

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: HAIN Lifescience Genotype MRSA (6x), HAIN Lifescience Genotype Staphylococcus (2x), HAIN Lifescience Genoquick MRSA (2x), Roche Cobas 4800 (2x), GeneProof MRSA PCR Kit (1x), r-biopharm RIDAGENE PVL PCR (1x), Seegene Magicplex sepsis Real-time test (1x), Amplex easyplex MRSA (1x) und Greiner Bio-One Genspeed MRSA (1x).

RV 540: Chlamydia pneumoniae

Eine wichtige Anmerkung wie immer vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Chlamydia pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von C. pneumoniae-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 13) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal eine Probe mit relativ hoher Menge an entsprechenden Zielorganismen (# 1525403; Chlamydia pneumoniae, ~1x106 IFU/mL) und eine Probe mit etwa hundertfach geringerer Menge (# 1525401; Chlamydia pneumoniae, ~1x104 IFU/mL), eine Probe mit ca. ~1x105 Genomkopien/mL an Mycoplasma pneumoniae (# 1525402), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1525404), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Aus den in der Tab. 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 13) aufgeführten Daten ist zu entnehmen, dass im aktuellen Ringversuch alle Teilnehmer die Zielorganismen in der positiven Probe # 1525403 (ca. 106 IFU/mL) sicher und zuverlässig nachweisen konnten. Die Probe # 1525401 mit der hundertfach geringeren Menge an Zielorganismen (ca. 104 IFU/mL) wurde erfreulicherweise ebenfalls mit lediglich einer Ausnahme als „positiv“ berichtet. Da in vorausgegangenen Ringversuchen auch noch etwa zehnfach geringere Erregerlasten (ca. 103 IFU/mL) sicher detektiert werden konnten, sollte ein falsch-negatives Ergebnis der C. pneumoniae-haltigen Proben sicherlich zum Anlass genommen werden, die Performance des verwendeten Testsystems und ggfs. auch die Prozessabläufe bei der Probenaufarbeitung zu hinterfragen. Für die Proben ohne Zielorganismen # 1525402 (Mycoplasma pneumoniae) und # 1525404 (Escherichia coli) ist im Vergleich zum vorausgegangenen Ringversuch die Anzahl falsch-positiver Befunde angestiegen. Während alle Labors die Probe # 1525402 als „negativ“ berichteten, fanden sich bei Probe # 1525404 3 falsch-positive und ein fragliches Ergebnis. Hierbei dürfte es sich am ehesten um eine laborinterne Kontamination bzw. eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung handeln. Kreuzreaktivitäten der C. pneumoniae-spezifischen PCR-Testsysteme mit DNA von E. coli erscheinen eher als unwahrscheinlich.

Inhibitionskontrollen wurden von allen Teilnehmern durchgeführt, lediglich ein Teilnehmer berichtete eine signifikante Inhibition der PCR-Reaktion in der „negativen“ Probe # 1525404. Selbstentwickelte in-house NAT-Testsysteme zur Detektion von C. pneumoniae-DNA wurden von 43 Labors eingesetzt, kommerzielle Assays wurden von 76 Teilnehmern verwendet.

Aufgrund des leider noch relativ geringen Anteils und der nicht durchgehenden Spezifizierung von kommerziellen Testsystemen innerhalb des Teilnehmerfeldes lassen sich derzeit keine seriösen Vergleiche zwischen bestimmten kommerziellen Kits und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität oder Kontaminationsanfälligkeit führen.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs wurde von 12 Teilnehmern die Verwendung des TIB Molbiol LightMix C. pneumoniae Testsystems, von 9 Teilnehmern der Diagenode MP/CP Kit und von 7 Teilnehmern der kommerzielle AmpliGnost CP PCR Kit angegeben.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP Bacterial Kit (9x), Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP Bac community acquired Pneumonia Kit (1x), GeneProof C. pneumoniae PCR Kit (7x), ARGENE Chla/Myco pneumo r-gene (6x), Seegene Pneumobacter ACE detection (1x), Seegene Anyplex RB5 detection (1x), fast-track Diagnostics Atypical CAP Kit (1x), fast-track Diagnostics Respiratory pathogens 33 (1x), Immundiagnostik MutaPLATE C. pneumoniae (1x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (2x), Euroclone Duplica Real Time C. pneumoniae Detection Kit (2x), AmpliSens M. pneumoniae/C. pneumoniae (2x), r-Biopharm RIDAGENE C. pneumoniae (1x) und Labsystems Diagnostics C. pneumoniae + M. pneumoniae Duplex Real-Time PCR (1x).

RV 541: Mycoplasma pneumoniae

Aufgrund zahlreicher Rückfragen von Teilnehmern der vergangenen Ringversuche hier eine wichtige Anmerkung vorab: der Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Mycoplasma pneumoniae ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Mycoplasma pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut, wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial, konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Dieses Mal waren jedoch keine Proben mit geringen Mengen an Zielorganismen im ausgesandten Probenset vertreten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 14) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal nur eine positive Probe: # 1525411 mit einer hohen Menge an Zielorganismen (Mycoplasma pneumoniae, ~1x106 Genomkopien/mL). Um im Rahmen der Möglichkeiten dieses Ringversuchskonzepts auch die Spezifität der eingesetzten Testsysteme abzuprüfen, enthielten Probe # 1525414 (Mycoplasma genitalium; ~1x106 Genomkopien/mL) und Probe # 1525413 (Mycoplasma salivarium; ~1x105 Genomkopien/mL) diesmal nennenswerte Mengen an DNA von dem Zielorganismus verwandter Mykoplasmen-Spezies. Probe # 1525412 enthielt ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli.

Mit einer Ausnahme konnten die 133 Teilnehmer die DNA von M. pneumoniae in Probe # 1525411 zuverlässig nachweisen. Für die zwei „negativen“ mit verwandten Mykoplasmen-Spezies (# 1525413 und # 1525414) versetzten Proben wurden 4 bzw. 8 falsch-positive Ergebnisse berichtet. Bei den falsch-positiven Ergebnissen könnte es sich eventuell um sporadische laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung handeln. Eventuelle Kreuzreaktivitäten der M. pneumoniae-spezifischen PCR-Testsysteme mit DNA von anderen Mykoplasmen-Spezies sollten von den betroffenen Teilnehmern abgeprüft und die entsprechenden Testkonzepte ggf. nachgebessert werden. Die dritte „negative“ Probe (# 1525412) enthielt lediglich E. coli und wurde von 130 der 133 Teilnehmer korrekt als „negativ“ gewertet. Inhibitionskontrollen wurden von allen Teilnehmern mitgeführt, für keine der ausgesandten Proben wurden Inhibitionsereignisse berichtet. Selbstentwickelte PCR-/NAT-Testsysteme kamen bei 49 Teilnehmern zum Einsatz, während 84 Teilnehmer kommerzielle Testsysteme verwendeten. Die Richtigkeitsquoten lagen bei in-house und vorkonfektionierten Assays auf vergleichbarem Niveau.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP Bacterial Kit (8x), GeneProof M. pneumoniae PCR Detection Kit (6x), ARGENE Chla/Myco pneumo r-gene (4x), Seegene PneumoBacter ACE detection (3x), r-Biopharm RIDAGENE M. pneumoniae (3x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (2x), AmpliSens M. pneumoniae/C. pneumoniae-FEP PCR Kit (2x), Euroclone Duplica Real Time M. pneumoniae Detection Kit (2x), Immundiagnostik MutaREAL M. pneumoniae (1x), Sartorius Microsart AMP Mycoplasma (1x), Labsystems Diagnostics C. pneumoniae + M. pneumoniae Duplex Real-Time PCR (1x), fast-track Diagnostics Atypical CAP Kit (1x), fast-track Diagnostics Respiratory pathogens 33 (1x), fast-track Diagnostics Real Time PCR (2x) und fast-track Diagnostics Respiratory pathogens 21 (2x).

RV 542: Coxiella burnetii & Bacillus anthracis

Auch hier wieder eine Anmerkung vorweg: Der kombinierte Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Coxiella burnetii & Bacillus anthracis ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Coxiella burnetii- und Bacillus anthracis-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt zwei Proben mit verschiedenen Mengen an Coxiella burnetii (~5x103 Genomkopien/mL in Probe # 1525421 und ~5x104 Genomkopien/mL in Probe # 1525422), eine Probe mit DNA des Bacillus anthracis „Pasteur“-Isolats (~1x106 Genomkopien/mL in Probe # 1525424), eine Probe mit DNA des Bacillus anthracis UR-1-Isolats (~1x105 Genomkopien/mL in Probe # 1525422) sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1525423), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Der Übersichtlichkeit halber haben wir uns bei diesem kombinierten Ringversuch entschlossen, die Ergebnislage für die beiden unterschiedlichen Erreger auch in zwei getrennten Tabellen darzustellen: für Coxiella burnetii in den Tabellen 2 und 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 15) sowie für Bacillus anthracis in den Tabellen 4 und 5 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 16).

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Sacace Biotechnologies C. burnetii Real-TM (1x), Altona diagnostics RealStar Anthrax PCR Kit (1x), Applied Biosystems B. anthracis (1x) und Liferiver C. burnetii real time PCR Kit (1x).

Coxiella burnetii: Wie bereits im vorausgegangenen Ringversuch gestaltet sich auch in der aktuellen Runde die Ergebnislage erfreulich einfach. Sowohl die etwas stärker positive Probe # 1525422 mit ca. 5x104 Genomkopien C. burnetii/mL als auch die zweite positive Probe # 1525421 des Probesets (ca. 5x103 Genomkopien/mL) wurden von allen der insgesamt 30 Teilnehmern mit ihren jeweiligen C. burnetii-spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert. Diese Ergebnislage deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus den vorherigen Ringversuchen. Bei der Probe ohne Zielorganismus # 1525423 (nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen) sowie der zweiten „negativen“ Probe # 1525424, welche ca. 1x106 Genomkopien/mL Bacillus anthracis „Stamm Pasteur“ DNA enthielt, wurden ebenfalls durchwegs korrekt negative Ergebnisse berichtet. Mit 27 diagnostischen Labors, welche in-house Testsysteme zum spezifischen Nachweis von C. burnetii verwenden, waren die selbstentwickelten Assays den vorkonfektionierten kommerziellen Testkits zahlenmäßig überlegen. Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von C. burnetii-DNA der Teilnehmer enthielten mit einer Ausnahme eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Bacillus anthracis: Die Ergebnislage des Ringversuchs „Bacillus anthracis-DNA“ ist ebenfalls relativ schnell dargestellt. Alle 19 Teilnehmer konnten mit ihren jeweils vor Ort etablierten B. anthracis-spezifischen PCR/NAT-gestützten Testsystemen die „negative“ Probe # 1525421 korrekt identifizieren, gleiches gilt für die zweite negative Probe # 1525423. Von 18 der 19 Teilnehmern wurde die Probe # 1525422 (B. anthracis Stamm UR-1, ~1x105 Genomkopien/mL und C. burnetii ~5x104 Genomkopien/mL) korrekt als positiv bewertet, zudem wurde ein fragliches Ergebnis eingereicht. Aufgrund der nicht geringen Mengen des Zielorganismus im Probenmaterial sollte ein fragliches Ergebnis unbedingt zum Anlass genommen werden, die Performance des verwendeten Testsystems und gegebenenfalls die laborinternen Abläufe der Probenaufarbeitung zu prüfen. Die zweite „positive“ Probe (# 1525424) enthielt den B. anthracis Stamm Pasteur: dieser ist zwar positiv für das Virulenzplasmid pXO2 und die B. anthracis-spezifischen chromosomalen Sequenzmarker rpoB und dhp61, jedoch (im Gegensatz zum Stamm UR-1) negativ für das „lethal- und edema-factor, sowie protective antigen-(pagA)-“tragende Virulenzplasmid pXO1. 18 der 19 Teilnehmer berichteten für diese Probe korrekt positive Befunde. Der Teilnehmer mit falsch-negativem Ergebnis sollte den Ringversuch zum Anlass nehmen, die Performance der verwendeten Testsysteme sowie die laborinternen Prozessabläufe zu evaluieren.

Wie immer stehen nach erfolgreichem Abschluss der aktuellen Ringversuchsrunde den Kolleginnen und Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen für C. burnetii-DNA und B. anthracis-DNA interessiert sind, mit den Proben dieses Ringversuchs auch gewissermaßen „standardisierte Rückstellproben“ zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

RV 543: Francisella tularensis

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Francisella tularensis“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Francisella tularensis-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 17) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben: Probe # 1525431 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (Francisella tularensis spp. novicida, ~1x105 CFU/mL), Probe # 1525432 mit ca. zehnfach geringerer Menge (F. tularensis spp. holarctica, ~1x104 CFU/mL) und Probe # 1525434 mit ca. ~1x103 CFU/mL an F. tularensis spp. novicida. Im Ringversuchsprobenset befand sich zudem eine Probe ohne Zielorganismen (# 1525433), die nur humane Zellen und E. coli enthielt.

Ähnlich wie bei vorausgehenden Ringversuchen haben auch hier alle der 17 Teilnehmer die relativ stark positiven Proben # 1525431 (F. tularensis spp. novicida, ~1x105 CFU/mL) und # 1525432 (F. tularensis spp. holarctica, ~1x104 CFU/mL) als positiv identifiziert. Die Probe mit der geringsten Erregermenge (~1x103 CFU/mL) konnte noch von 15 der 17 Teilnehmer korrekt als positiv befundet werden. Die zwei falsch-negativen Bewertungen sollten Anlass geben, das verwendete Testsystem bzgl. Sensitivität zu evaluieren und gegebenenfalls zu optimieren.

Die F. tularensis-negative Probe # 1525433 wurde von allen Teilnehmern erfreulicherweise durchgehend als negativ befundet. Die gesamte Ergebnislage deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus vorherigen Ringversuchen und spricht erneut für ein gutes Funktionieren sowohl der bei den jeweiligen Teilnehmern etablierten Testsysteme, als auch der implementierten laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationsereignissen.

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von F. tularensis-DNA der Teilnehmer enthielten mit einer Ausnahme eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

RV 544: Carbapenemase-Gene

Der seit 2015 in das reguläre Ringversuchsprogramm von INSTAND e.V. aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Carbapenemase-Gene“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zur molekularen Resistenztestung bzw. dem Direktnachweis von charakteristischen Carbapenemase-Genen aus DNA-Präparationen von Reinkulturen an Enterobacteriaceae konzipiert. Zum orientierenden Herantasten an die technische Eignung und die „Praktikabilität“ der versandten Probenmaterialien werden wir uns in den ersten Runden dieses methodisch anspruchsvollen Ringversuchs zur molekularen Resistenztestung auf die Abprüfung eines kleinen Spektrum der derzeit häufigsten Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae beschränken: KPC, VIM, OXA-48 ähnliche Gene, GES-Carbapenemasen, NDM, IMP und GIM.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 18) der Auswertung dargestellt, enthielt das aktuelle Set vier Proben mit Carbapenem-resistenten Enterobacteriaceae: Probe # 1525441 enthielt Serratia marcescens-Zielorganismen mit dem OXA-48 Gen (ca. 1x106 Genomkopien/mL), Probe # 1525442 enthielt Escherichia coli-Zielorganismen mit den Genen für NDM-5 und OXA-181 (ca. 1x106 Genomkopien/mL), Probe # 1525443 enthielt Klebsiella pneumoniae-Zielorganismen mit den Genen für KPC-2 und VIM-1 (ca. 1x106 Genomkopien/mL), und Probe # 1525444 enthielt ein Enterobacter cloacae-Complex-Isolat mit dem IMP-14 Gen (ca. 1x106 Genomkopien/mL).

Alle Teilnehmer stellten erfreulicherweise ein Carbapenemase-Gen in der Probe # 1525441 (Serratia marcescens mit OXA-48 Gen) fest. Für die Probe # 1525443 berichteten 49 der 50 Teilnehmer ein positives Ergebnis (Klebsiella pneumoniae-Zielorganismen mit den Genen für KPC-2 und VIM-1), ein Teilnehmer berichtete ein negatives Ergebnis für VIM-1. Spannender war die Auswertung der Probe # 1525422, welche Escherichia coli-Zielorganismen mit den Genen für NDM-5 und OXA-181 enthielt. 39 Teilnehmer berichteten ein korrekt positives Ergebnis für das Vorliegen beider Gene. Die verbleibenden 11 Teilnehmer „verpassten“ entweder OXA-181 (10x) oder NDM-5 (1x). Es ist bekannt, dass einige OXA-48 ähnliche Carbapenemasen wie OXA-181 und OXA-232 in einigen kommerziellen Testsystemen nicht erkannt werden. Da diese OX-48 Varianten jedoch aktuell vermehrt nach Europa importiert werden, sollte sich jeder Nutzer im Klaren darüber sein, ob der im Labor verwendete molekulare Test solche OXA-48 Varianten detektieren kann oder nicht. Die Lücken in der Abdeckung in der molekularen Testung auf Carbapenemasen zeigten sich eindrucksvoll an Probe # 1525444. Nur 14 Laboratorien berichteten hier richtig positive Ergebnisse und detektierten das IMP-14 Gen in dem ausgesandten Enterobacter cloacae-Complex-Isolat. Betalaktamase-Gene aus der IMP-Familie stellen für NAT-Testsysteme wegen der großen Heterogenität der zahlreichen IMP-Varianten eine Herausforderung dar. In Deutschland sind Carbapenemasen vom Typ IMP, erst recht die Carbapenemase IMP-14, sehr selten. Ein falsch-negatives Ergebnis sollte Anlass geben, einerseits die „Coverage“ des verwendeten Carbapenemase-Assays zu evaluieren und sich andererseits möglicher Lücken bewusst zu sein.

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Direktnachweis von Carbapenemase-Genen aller Teilnehmer enthielten jeweils eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet. Selbstentwickelte in-house NAT-Testsysteme zur Detektion von Carbapenemase-Genen wurden von 17 der insgesamt 50 teilnehmenden Laboratorien eingesetzt, alle anderen Labors verwendeten kommerzielle Testkonzepte. Aufgrund der leider noch nicht durchgehenden Spezifizierung von kommerziellen Testsystemen innerhalb des Teilnehmerfeldes lassen sich derzeit keine seriösen Vergleiche zwischen bestimmten kommerziellen Kits und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität oder Kontaminationsanfälligkeit führen. Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkit aufgeführt: Cepheid GeneXpert Carba-R (16x).

RV 545: Clostridium difficile

Der neu ins Ringversuchsprogramm aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Clostridium difficile“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Clostridium difficile-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 19) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben drei positive Proben: Probe # 1525451 und # 1525453 mit einen relativ hoher Menge an Clostridium difficile, (~1x104 CFU/mL und ~5x104 CFU/mL), Probe # 1525452 mit ca. zehnfach geringerer Menge (~5x103 CFU/mL ) sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1525454), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Die beiden „hochpositiven“ Clostridium difficile-Proben # 1525451 und # 1525453 wurden erfreulicherweise von 82 bzw. 83 der 85 teilnehmenden Laboratorien korrekt als „positiv“ klassifiziert. Falsch-negative Ergebnisse sollten auch hier zum Anlass genommen werden, das verwendete Testsystem bzgl. analytischer Sensitivität und Spezifität zu evaluieren und auch die laborinternen Prozesse der Probenaufbereitung und -abarbeitung kritisch zu hinterfragen. Letzteres gilt insbesondere für Teilnehmer mit falsch-positiven Ergebnissen für die lediglich E. coli-enthaltende Probe # 1525454. Eine Kreuzreaktion der verwendeten Testsysteme mit E. coli erscheint unwahrscheinlich, am ehesten sind Kreuzkontaminationen im Prozess der Probenbearbeitung ursächlich. Probe # 1525452 enthielt mit ~5x103 CFU/mL die geringste Menge des Zielorganismus und wurde von 79 Teilnehmern korrekt als positiv berichtet, leider wurden auch 5 falsch-negative Ergebnisse eingereicht. Hier sollte ggfs. die analytische Sensitivität des Testsystems hinterfragt werden. Inhibitionskontrollen wurden von allen Teilnehmern mitgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse wurden für keine der Proben berichtet. Wie in Tab. 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 19) angegeben, verwendeten der Großteil der Teilnehmer kommerzielle Testsysteme, während selbstentwickelte Testkonzepte in 12 Laboratorien zum Einsatz kam. In dieser Ringversuchsrunde zeigten sich (vergleichbar mit der vorausgegangenen) zwischen den kommerziellen Testsystemen und den Eigenentwicklungen keine signifikanten Unterschiede bezüglich Sensitivität und Spezifität. Für eine verlässlichere Beurteilung sollten jedoch die folgenden Ringversuchsrunden abgewartet werden.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: r-Biopharm RIDAGENE CD Toxin A/B (15x), r-Biopharm RIDAGENE Hospital Stool Panel (3x), Altona diagnostic RealStar C. difficile PCR Kit (6x), HAIN Lifescience GenoType CDiff (5x), HAIN Lifescience FluoroType CDiff (1x), AmpliGnost C. difficile Toxin A und B von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (2x), Meridian Bioscience illumigene C. difficile (1x), fast-track Diagnostics C. difficile (1x), Abacus Diagnostica GenomEra C. difficile (1x) und Greiner Bio-One Genspeed C. difficile (1x).

RV 546: VRE

Der neu ins Ringversuchsprogramm aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Vancomycin-resistente Enerokokken“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an DNA Vancomycin-resistenter Enterokokken aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 20) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben zwei positive Proben: Probe # 1525462 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (Enterococcus faecium van B resistent, ~1x105 CFU/mL), Probe # 1525463 mit ca. gleicher Menge (Enterococcus faecium van A resistent, ~1x105 CFU/mL) und Probe # 1525461 mit ca. ~1x105 CFU/mL an Enterococcus faecalis. Im Ringversuchsprobenset befand sich zudem eine Probe ohne Zielorganismen (# 1525464), die nur humane Zellen und E. coli enthielt.

Erfreulicherweise wurden die beiden „positiven“ Proben # 1525462 und # 1525463 (je ca. ~1x105 CFU/mL) mit vanA bzw. vanB tragenden Enterokokken mit lediglich einer Ausnahme von allen Teilnehmern als „VRE-positiv“ klassifiziert. Wie bereits im vorangegangenen Ringversuch waren alle eingereichten vanA/vanB Differenzierungen korrekt. Auch die beiden „negativen“ Proben # 1525461 und # 1525464 mit E. coli waren durchwegs als „VRE-negativ“ berichtet worden. Bei den eingesetzten Testsystemen hielten sich kommerziell erhältliche, vorkonfektionierte Systeme und Eigenentwicklungen in etwa die Waage. Bezüglich analytischer Sensitivität und Spezifität waren keine signifikanten Unterschiede zu verzeichnen, wenngleich einschränkend angemerkt werden muss, dass für eine verlässlichere Beurteilung weitere Ringversuchsrunden abgewartet werden sollten. Insgesamt war die Ergebnislage dieser Probenaussendung jedoch sehr erfreulich.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: HAIN Lifescience GenoType Enterococcus (9x), GeneProof VRE PCR Kit (1x) und Seegene Magicplex Sepsis Real-time test (1x).

RV 560: Pneumocystis jirovecii

Dieser im Jahr 2013 neu in unser Ringversuchsprogramm aufgenommene Ringversuch RV 560 „Pilzgenomnachweis PCR/NAT Pneumocystis jirovecii“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis von Pneumocystis jirovecii-DNA in geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Zum orientierenden Herantasten an die unteren Nachweisgrenzen der im Anwenderkreis etablierten PCR/NAT-gestützten Testsysteme enthielt das aktuelle Set drei positive Proben (siehe Tab. 1, Anhang 1 [Anh. 1], S. 21): eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1525601; Pneumocystis jirovecii, ca. 5x105 Organismen/mL), eine Probe mit ca. zehnfach geringerer Menge (# 1525604; Pneumocystis jirovecii, ca. 5x104 Organismen/mL), eine Probe mit ca. hundertfach geringerer Menge (# 1525602; Pneumocystis jirovecii, ca. 5x103 Organismen/mL), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1525603) aber mit E. coli und einer Suspension aus humanen Zellen.

Die „negative“ Probe # 1525603 wurde von nahezu allen Teilnehmern korrekt als negativ für den Zielorganismus gewertet, lediglich 2 fragliche Ergebnisse wurden berichtet. Die betroffenen Teilnehmer sollten ggfs. die laborinterne Testdurchführung und die Performance des verwendeten Testsystems überprüfen. Im Vergleich zur vorausgegangenen Ringversuchsrunde kann jedoch insgesamt ein erfreulicher Rückgang falsch-positiver oder fraglicher Befunde festgestellt werden. Bei den „positiven“ Proben wurde Probe # 1525601 mit ~5x105 Organismen/mL von 90 der 91 Teilnehmer richtig klassifiziert. Die schwächer positive Probe # 1525604 (ca. 5x104 Organismen/mL) wurde noch von 86 Teilnehmern korrekt als „positiv“ gewertet, 5 Labors berichteten falsch-negative Ergebnisse. Wie bereits in der vorausgegangenen Ringversuchsrunde muss hier angemerkt werden, dass 104 Organismen/mL nicht gerade als „äußerst geringe“ Menge gelten und durchaus mit adäquaten Testsystemen und Arbeitsabläufen detektierbar sind. Leider ist hier (im Vergleich zum vorhergehenden Ringversuch) bislang keine Steigerung der Performance zu sehen. Die Probe mit der geringsten Menge an Zielorganismen (# 1525602, 5x103 Organismen/mL) konnte noch von 58 der 91 teilnehmenden Labors als „positiv“ erkannt werden. Neben 29 falsch-negativen Ergebnissen wurden auch 4 „fragliche“ Befunde übermittelt. Inhibitionskontrollen wurden von allen 91 Teilnehmern durchgeführt, lediglich 2 Inhibitionsereignisse der „negativen“ Probe (# 1525603) wurden berichtet.

In-house PCR Assays wurden von 38 Teilnehmern eingesetzt, bei den kommerziellen Testsystemen waren r-Biopharm RIDAGENE Pneumocystis jirovecii (21x), TIB MolBiol LightMix Pneumocystis jirovecii (9x) sowie AmpliGnost Pneumocystis jirovecii PCR Kit (9x) die drei am häufigsten verwendeten.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [26] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: fast-track Diagnostics Pneumocystis jirovecii (2x), fast-track Diagnostics Respiratory pathogens 33 (1x), Altona diagnostics RealStar P. jirovecii PCR Kit (2x) and Liferiver P. carinii real time PCR Kit (1x).

Danksagung

Wie gehabt möchten wir uns an dieser Stelle recht herzlich bei allen Kollegen in den zahlreichen nationalen und internationalen Sollwertlaboratorien sowie bei den Kollegen und Mitarbeitern in Jena, Salzburg, Hamburg, Oberschleißheim, Bonn, Dresden, München, Berlin, Bochum und Regensburg bedanken, die nach wie vor hochmotiviert an der praktischen Umsetzung unseres gemeinsamen Vorhabens zur externen Qualitätssicherung mitarbeiten.

Zugleich hoffen wir weiterhin auf rege Teilnahme und einen reibungslosen Ablauf der zukünftigen Ringversuchsrunden.


Literatur

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Reischl U, Lehn N, Wolf H, Straube E. „Bakteriengenom-Nachweis PCR/NAT“: Eine neue Ringversuchsreihe von INSTAND e.V. zur externen Qualitätskontrolle molekularbiologischer Nachweisverfahren in der bakteriologischen Diagnostik. Mikrobiologe. 2003 Aug;13(4):149-56.
2.
Linde HJ, Lehn N. Infektionen mit Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus: Bedeutung des Pathogenitätsfaktors Panton-Valentine Leukozidin [Infections with methicillin-resistant Staphylococcus aureus: impact of Panton-Valentine leukocidin]. Dtsch Med Wochenschr. 2005 Oct 21;130(42):2397-401. DOI: 10.1055/s-2005-918583 Externer Link
3.
Witte W, Braulke C, Cuny C, Strommenger B, Werner G, Heuck D, Jappe U, Wendt C, Linde HJ, Harmsen D. Emergence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus with Panton-Valentine leukocidin genes in central Europe. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2005 Jan;24(1):1-5. DOI: 10.1007/s10096-004-1262-x Externer Link
4.
Reischl U, Tuohy MJ, Hall GS, Procop GW, Lehn N, Linde H. Rapid detection of Panton-Valentine leukocidin-positive Staphylococcus aureus by real-time PCR targeting the lukS-PV gene. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2007 Feb;26(2):131-5. DOI: 10.1007/s10096-007-0254-z Externer Link