gms | German Medical Science

Einleitung: Die Analyse der RNA-Expression mit Hilfe der real-time PCR (qRT-PCR) verwendet klassischerweise Referenzgene (RG) als internen Vergleichsstandard. In vorangegangenen Studien konnten wir zeigen, dass die klassischen RG Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) und beta-Aktin (ACTB) zu den inkonstantesten Genen aus der Gruppe der RG in differenzierenden Myoblastenzellkulturen gehörten. Aus diesem Grund führten wir eine qRT-PCR-Analyse unter Verwendung eines Normalisierungsfaktors (NF) durch, welcher aus den beiden stabilsten RG ribosomal protein, large, P0 (RPLPO) und TATA box binding protein (TBP) mittels der geNorm-Software errechnet wurde.

Methoden: Folgende Gene wurden mittels qRT-PCR unter Verwendung des NFs untersucht: myogenic factor 5 (Myf-5), Myogenin (MYOG), embryonische (MYH3)-, perinatale (MYH8)-, adulte (MYH1) Myosinschwerkette. Des Weiteren wurde ein Kreatinkinase-Assay durchgeführt und der Fusionsindex aus den sich bildenden Myofibrillen als weiterer Differenzierungsmarker bestimmt.

Ergebnisse: Alle Markergene zeigten bei Verwendung des Differenzierungsmediums eine zeitlich abhängige Zunahme der Expression. Die Expressionshöhe korrelierte gut mit dem Kreatinkinaseaktivität und dem Fusionsindex.

Schlussfolgerung: Zum ersten Mal wurde eine qRT-PCR Analyse in differenzierenden humanen Myoblastenzellkulturen durchgeführt, welche validierte Referenzgene verwendete, um die genaue zeitliche Abfolge der Genexpression von gut beschriebenen Markergenen während der Myogenese zu bestimmen. Die Genexpressionshöhen korrelierten sehr gut mit nicht RNA-Differenzierungsmarkern, welches die hohe Validität der Messung unterstreicht.