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Herstellung dendritischer Zellen (DC) aus menschlichen peripheren Blutzellen zur Immuntherapie von Patienten mit Kopf- und Halskarzinomen
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Autoren
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Jan B. Weise
- Klinik für Hals-, Nasen-, Ohrenheilkunde, Kopf- und Halschirurgie, UKSH, Universität Kiel, Kiel, Deutschland
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Axel Heiser
- Klinik für Hals-, Nasen-, Ohrenheilkunde, Kopf- und Halschirurgie, UKSH, Universität Kiel, Kiel, Deutschland
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Ilse Adamzik
- Klinik für Hals-, Nasen-, Ohrenheilkunde, Kopf- und Halschirurgie, UKSH, Universität Kiel, Kiel, Deutschland
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Steffen Maune
- Klinik für Hals-, Nasen-, Ohrenheilkunde, Kopf- und Halschirurgie, UKSH, Universität Kiel, Kiel, Deutschland
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Dietrich Kabelitz
- Klinik für Hals-, Nasen-, Ohrenheilkunde, Kopf- und Halschirurgie, UKSH, Universität Kiel, Kiel, Deutschland
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Rita Kühl-Burmeister
- Klinik für Hals-, Nasen-, Ohrenheilkunde, Kopf- und Halschirurgie, UKSH, Universität Kiel, Kiel, Deutschland
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Petra Ambrosch
- Klinik für Hals-, Nasen-, Ohrenheilkunde, Kopf- und Halschirurgie, UKSH, Universität Kiel, Kiel, Deutschland
| Veröffentlicht: | 6. Dezember 2005 |
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Gliederung
Zusammenfassung
Immuntherapeutische Ansätze mit autologen DC, die in vitro mit tumorantigen-kodierenden Informationen (Peptide, DNA, RNA) beladen werden und als Vakzine anschließend im Patienten eine spezifische Immunantwort auslösen sollen, benötigen DC in ausreichender Anzahl, Reinheit und Qualität.
Im Rahmen einer Leukapherese im geschlossenen System werden menschliche periphere Blutleukozyten gewonnen und durch Dichtegradientenzentrifugation angereichert. Die so gewonnenen PBMC werden in serumfreiem Medium in einer Zelldichte von 1x10ⁿ8 Zellen pro 35 ml in Zellkulturflaschen bei 37ºC/5%CO2 für 1 h inkubiert, gespült und davon die adhärenten Zellen mit rekombinantem, humanem IL-4 (500 U/ml) und rekombinatem, humanem GM-CSF (800 U/ml) weiter inkubiert. An Tag 3 und Tag 7 werden erneut IL-4
(500 U/ml) und GM-CSF (800 U/ml) und am Tag 10 den dann unreifen DC 10 ng/ml TNFα, 2 ng/ml IL-1β und 100 U/ml IL-6 zugegeben. An Tag 11 erfolgt die phänotypische Charakterisierung der Zellen mittels Färbung mit monoklonalen Antikörpern und FACS-Analyse. Die reifen DC können nun für die Transfektion verwendet werden. Die fertige Vakzine wird anschließend in Aliquots kryokonserviert und vor Applikation einem „Batch-Release-Test“ unterzogen. Dieser beinhaltet die Messung der Zellviabilität und mikrobiologischen Kontaminierung. Alle Präparationschritte müssen dabei in einem Reinraum nach den Richtlinien von GMP und SOP (Standard Operating Procedure) erfolgen, um die Vakzine zur Therapie von Patienten freizugeben.
Die Gewinnung von DC aus menschlichen Blutmonozyten und Präparation nach diesem Protokoll ermöglicht die weitere Verwendung der DC über in vitro Versuche hinaus bis zum klinischen Einsatz als Vakzine für eine Immuntherapie.
