gms | German Medical Science

Das hochkonservierte Nukleoprotein (NP) ist essentiell für die Replikation von Influenzaviren. Es stellt ein potenzielles Zielprotein für die Influenzatherapie dar, was mit der Entdeckung des ersten NP-Inhibitors nachgewiesen wurde [1]. Unter humanpathogenen Influenzastämmen zeigen einige H1N1 und H3N2 Stämme eine Resistenz gegenüber Nucleozin und seinen Analoga. In pandemischen H1N1 Influenza-A-Virus (A(H1N1)pdm09)-Isolaten vermittelt der Aminosäureaustausch NP Y289H eine Resistenz. Da auch der Austausch Y52H eine Nucleozinresistenz hervorruft, wird angenommen, dass Nucleozin durch Bindung an zwei verschiedene Bindetaschen NP-Oligomere induziert [2], was zum Funktionsverlust des viralen Proteins führt. In der vorliegenden Studie wurden (a) Resistenzprofile von Chlornucleozinanaloga analysiert, welche zur Überbrückung dieser Resistenz entwickelt wurden und (b) die reverse Genetik eingesetzt, um deren resistenzbrechende Wirkmechanismen genauer zu untersuchen.

Zunächst wurde die Inhibitorempfindlichkeit von H3N2 und pandemischem H1N1, repräsentiert durch A/Hongkong/1/68 (HK/68) und A/Jena/8178/09 (pH1N1), in zellbasierten Tests ermittelt. Hier zeigten einige der Analoga eine vielversprechende, duale Hemmwirkung mit Hemmkonzentrationen im Bereich <10 µM. Zusätzlich wurden Virusvarianten mit den Resistenzmutationen Y52H und Y289H im NP auf dem genetischen Hintergrund von HK/68 und H1N1 A/WSN/1933 mit Hilfe eines Plasmid-Transfektionssystems in Zellkultur erzeugt, um diese duale Wirkung zu bestätigen. In zytopathischen Effekt-Hemmtests wurde die 50%ige Hemmkonzentration für die Analoga mit den Virusvarianten bestimmt und mit den jeweiligen Nucleozin-empfindlichen Wildtyp-Varianten verglichen. Es stellte sich heraus, dass die auf das pandemische Virus wirksamen Substanzen keinen inhibierenden Effekt auf die Replikation des äquivalenten WSN/33 Virus mit Y289H besitzen. Auch die WSN/33 Variante mit Y52H-Austausch zeigte diese Unempfindlichkeit. Um diesen Unterschied auszugleichen und die molekularen Mechanismen der NP-Hemmung weiter zu analysieren, wurde ein zusätzlicher Aminosäureaustausch eingeführt und somit die Sequenz des WSN/33 NP der des NP von pH1N1 weiter angenähert.

Unsere Ergebnisse geben erste Hinweise darauf, dass NPI-Resistenzen bei pandemischen Influenzastämmen mit Modifikationen am Chlornuclezin-Molekülgerüst überwunden werden können. Gleichzeitig zeigen sie, dass erfolgsversprechende Ergebnisse innerhalb eines Influenzastammes trotz der hohen Konservierung des NP nicht zwangsläufig auf andere Influenzastämme übertragen werden können.

Förderung: Diese Arbeit wird gefördert vom Thüringer Ministerium für Wirtschaft, Arbeit und Technologie aus Mitteln des Europäischen Sozialfonds (2011 FGR 0137) sowie vom FWF – die Wissenschaftsfonds (P23051, P24587).